Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Zusammenfassung

Wir haben die Bedingungen für die DFAT-Zellerzeugung modifiziert und geben hierin Informationen über die Verwendung eines verbesserten Wachstumsmediums für die Produktion dieser Zellen.

Zusammenfassung

Tissue Engineering und Zelltherapie vielversprechend klinisch. In dieser Hinsicht multipotenten Zellen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs), können therapeutisch, in naher Zukunft wieder herzustellen Funktion geschädigte Organe verwendet. Dennoch einige technische Probleme, einschließlich der hochinvasiven Verfahren von MSCs und die Ineffizienz rund um ihre Verstärkung zu isolieren, behindern gegenwärtig die möglichen klinischen Verwendung dieser therapeutischen Modalitäten. Hierin stellen wir eine hocheffiziente Methode zur Erzeugung von dedifferenzierten Fettzellen (DFAT), MSC-ähnlichen Zellen. Interessanterweise kann DFAT Zellen in verschiedene Zelltypen, einschließlich adipogenen, osteogenen, chondrogenen Zellen und differenzieren. Obwohl andere Gruppen zuvor verschiedene Verfahren zur Erzeugung von DFAT Zellen aus reifen Fettgewebe präsentiert haben, unsere Methode ermöglicht es uns, mehr DFAT Zellen effizient zu produzieren. In dieser Hinsicht zeigen wir, dass DFAT Kulturmedium (DCM), ergänzt mit 20% FBS,ist wirksamer DFAT Zellen bei der Erzeugung als DMEM, ergänzt mit 20% FBS. Zusätzlich können die Zellen durch DFAT unserem Zellkulturverfahren hergestellt in verschiedene Gewebetypen redifferenziert werden. Als solche ein sehr interessantes und nützliches Modell für die Untersuchung von Gewebe Dedifferenzierung dargestellt.

Einleitung

Die Zelltherapie und Tissue Engineering sind heiße Themen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin ^1-5. Während diese therapeutischen Modalitäten großes Versprechen halten, die derzeit einige technische Probleme, ihre klinische Anwendung behindern. In diesem Zusammenhang ist, wie bei der Erzeugung von iPS-Zellen, alle Therapien Tissue Engineering müssen Zellen frei von äußeren Gen Transduktionen produzieren, um die Sicherheit der Patienten zu gewährleisten. Dementsprechend waren wir die erste Gruppe erfolgreich menschliche DFAT Zellen produzieren ^6. Mehrere andere Arbeitsgruppen haben unsere Methode , da angenommen DFAT Zellen von Säugetieren ^7-9, weiter hervorheben , die Nützlichkeit unseres Modells zu generieren.

Im Laufe von mehreren Studien haben wir festgestellt, dass die Qualität der Zellkulturumgebung durch Einstellen des Inhalts des Zellmediums verändert werden. Diese Erkenntnis hat zu einer Erhöhung der Erfolgsrate von DFAT Zellproduktion geführt und Zellqualität verbessert; beide kritischen Faktoren ineffizient Zellen für zukünftige klinische Studien zu generieren. In dieser Hinsicht verbesserte einer DFAT Kulturmedium (DCM, ein Medium ähnliche Zellmedium stammen mesenchymalen, die rekombinantes humanes Insulin, Serumalbumin, L-Glutaminsäure, verschiedene Fettsäuren und Cholesterin enthält) und ein Verfahren zur DFAT Zellgeneration und Proliferation wurde entwickelt (weitere Informationen über den Inhalt von DCM ist auf Anfrage erhältlich). Mit dieser Methode hohe Qualität DFAT Zellen wurden mit der Fähigkeit, erzeugt in verschiedene Zelltypen, einschließlich adipogenen, osteogenen und chondrogenen Zellen zu differenzieren. Insgesamt verbessert diese validierten Zellkultur Protokoll, um die Qualität der DFAT Zellen und kann zur Verbesserung der klinischen Anwendung der Zelltherapie und Tissue Engineering sehr nützlich sein.

Protokoll

Proben von menschlichem subkutanen Fettgewebes wurden von Patienten in der Chirurgie in der Abteilung für Plastische Chirurgie, Urologie, Kinderchirurgie und Orthopädische Chirurgie der Nihon Universität Itabashi Hospital (Tokyo, Japan) erhalten. Die Patienten gaben informierte Zustimmung geschrieben, und die Ethikkommission der Nihon University School of Medicine der Studie zugelassen.

1. Gewebepräparation

1. Bringen Sie die Gewebeprobe aus dem Operationssaal zu Labor.
2. Wash 1-2 g Fettgewebe mit 5 ml PBS (-) bei Raumtemperatur (RT) einmal, in einem 50-ml-Röhrchen und dann die Probe in einem 10 cm Plastikschale.

2. Collagenaseverdau

1. Entfernen der Probe aus der PBS (-), dann werden 10 ml steriler 0,1% (w / v) Lösung Kollagenase (Kollagenase Typ II) in die Schale der Gewebeprobe enthält.
2. Mince das Gewebe mit einer chirurgischen Schere für etwa 15 Minuten, bis er eine pürierte erreicht bestehenparenz.
3. Anschließend verdauen das zerkleinerte Gewebe in dem 0,1% (w / v) Kollagenase-Lösung bei 37 ° C für 30 min (60 rpm) in einem 50 ml Röhrchen unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler.
4. Filtern Sie die aufgeschlossene Probe durch ein 100 um-Filter in ein 50 ml Röhrchen. Als nächstes wurden 10 ml DCM passieren mit 2% FBS durch den Filter ergänzt (siehe Tabelle der Materialien).

3. Zell Isolation

1. Zentrifugieren der filtrierten Zellen bei 100 · g für 1 min bei RT.
2. An dieser Stelle vorbereiten 5 ml DCM mit 2% FBS in einer 50-ml-Tube ergänzt.
3. die schwimmenden Fettzellen unter Verwendung einer 1000 ul Pipette und fügen Sie die Zellen in ein 50 ml Röhrchen, das Medium Als nächstes erstellen.
4. Anschließend schütteln Sie die 50-ml-Röhrchen vorsichtig das DCM-Medium mit den Zellen zu mischen.
5. Zentrifuge dann das Rohr bei 100 × g für 1 min bei RT.
6. Verwerfen das Medium an der Unterseite des Rohrs eine 18 G-Nadel und einer 20 ml Spritze.
7. Als nächstes werden 10 ml DCM supplemented mit 2% FBS zu den gesammelten Zellen.
8. Mischen Sie die DCM mit den Zellen durch Schütteln des 50-ml-Röhrchen sanft.
9. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100 g für 1 min bei RT.

4. Plating Cells

1. Hinzufügen 41 ml DCM oder DMEM, supplementiert mit 20% FBS auf eine 12,5 cm-Kolben.
2. Als nächstes wird unter Verwendung einer 200 ul Pipette 40 ul Fettzellen in den Kolben hinzufügen.
3. Dann füllen Sie den Kolben mit DCM oder DMEM mit 20% FBS ergänzt. Kritischste Schritt: An dieser Stelle sicher, dass die Zellen im gesamten Medium verteilt sind. Eine Sichtprüfung der abgelösten Zellen und danach den Kolben eines runden Petrischale auf dem Deckel halten es flach zu halten.
4. Schließlich wird der Kolben im Inkubator und lassen Sie es für 7 Tage bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ Inkubator ungestört.
5. Nach einer Woche Inkubation kehren die Kolben und prüfen, ob DFAT Zellen. Als nächstes beurteilen Tüchtigkeit DFAT Zellgeneration wie seit fibrobl an dieser Stelle ¹⁰ beschriebenast-ähnlichen Zellen (DFAT Zellen) werden in den Regionen unterscheiden sich von Fettzellen.
6. 5 ml DCM oder DMEM, supplementiert mit 20% FBS in den Kolben der früheren Zellkulturmedium nach der Entfernung. Lassen Sie die DFAT Zellen für eine weitere Woche zu wachsen, nachdem das Medium verändert.
7. Mit Hilfe eines Zellzählers, zählen die Anzahl der DFAT unter verschiedenen Zellkulturbedingungen (DCM gegen DMEM) erzeugten Zellen.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde das Verfahren und das Toolkit für DFAT Zellgeneration verbessert (Abbildung 1). Unser Verfahren ermöglicht es uns , DFAT Zellen sowohl mit DCM und DMEM - Medium , das 20% FBS (2A) zu erzeugen. Als solche verglichen wir die Effizienz von DCM und DMEM DFAT Zellen zu erzeugen. In dieser Hinsicht verbesserte DCM DFAT Zellproliferation durch drei Mal , wenn auf DMEM verglichen, unabhängig von der Anzahl von Adipozyten (2A<...

Diskussion

Ältere Adipozyten , die in vitro Dedifferenzierung, ein Verfahren bekannt , als Deckenkultur unterzogen werden , können zu einer primitiveren Phänotyp zurückkehren und proliferativen Fähigkeiten gewinnen. Diese Zellen werden als dedifferenzierte Fett (DFAT) -Zellen bezeichnet. Die multilineage Differenzierungspotential von DFAT Zellen wurde bewertet. Durchflusszytometrie Analyse und Genexpressionsanalyse ergab , dass DFAT Zellen im Vergleich zu ASCS ⁶ sehr homogen waren. In der Tat ist das Zelloberfl...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CSTI303-MSC mittelgroße	CSTI	87-671	Dieses Medium wird im Text als DCM definiert
PBS(-)	Wako	166-23555	Es enthält kein Mg2+ und Ca2+
DMEM Medium	Gibco	11965-092
Fetales Rinderserum	Sigma	172012
Kollagenase Typ II	Sigma	C-6885
Schere	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Schüttler	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Sieb 100 μ m Gelb	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12,5 cm² Rechteckiger Zellkulturkolben mit schrägem Hals und blauem, belüftetem Schraubverschluss	CORNING LIFE SCIENCES
18 G Nadel	NIPRO	02-002
20 ml Spritze	NIPRO	08-753
Z-Serie Scharzähler	BECKMAN SCHAR	383550

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