Methodenartikel

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

DOI:

10.3791/54190

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30. Juli 2016

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1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll in dieser Studie präsentierten beschreibt Verfahren zur Echtzeit-Überwachung der Reprogrammierung Progression über die kinetische Messung von positiven und negativen pluripotenten Stammzellmarker Durchflusszytometrie-Analyse. Das Protokoll enthält auch die Imaging-basierte Beurteilung der Morphologie und Marker oder Reporter-Expression während der iPS-Generation.

Zusammenfassung

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Die somatische Reprogrammierung hat die Umwandlung von adulten Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und Krankheitsphänotypen ermöglicht. Jüngste Fortschritte haben effizientere und sicherere Methoden für die Einführung von Reprogrammierungsfaktoren aufgezeigt. Es gibt jedoch nur wenige Tools, um den Fortschritt der Neuprogrammierung zu überwachen und zu verfolgen. Derzeitige Methoden zur Überwachung der Reprogrammierung beruhen auf der qualitativen Inspektion der Morphologie oder der Färbung mit stammzellspezifischen Farbstoffen und Antikörpern. Werkzeuge zur Analyse des Fortschreitens der iPS-Erzeugung können helfen, den Prozess unter verschiedenen Bedingungen aus verschiedenen Zellquellen besser zu verstehen.

Diese Studie stellt Schlüsselansätze für die kinetische Messung des Reprogrammierungsfortschritts mittels Durchflusszytometrie sowie Echtzeitüberwachung mittels Bildgebung vor. Um die Kinetik der Reprogrammierung zu messen, wurde eine Flussanalyse zu diskreten Zeitpunkten mit Antikörpern gegen positive und negative pluripotente Stammzellmarker durchgeführt. Die Kombination aus Echtzeit-Visualisierung und Strömungsanalyse ermöglicht die quantitative Untersuchung der Reprogrammierung in verschiedenen Stadien und ermöglicht einen genaueren Vergleich verschiedener Systeme und Methoden. Die bildbasierte Echtzeitanalyse wurde für die kontinuierliche Überwachung von Fibroblasten verwendet, während sie in einem Feeder-freien Mediumsystem umprogrammiert werden. Die Kinetik der Koloniebildung wurde anhand der Konfluenz in den Phasenkontrast- oder Fluoreszenzkanälen nach Färbung mit lebenden alkalischen Phosphatasefarbstoffen oder Antikörpern gegen SSEA4 oder TRA-1-60 gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Messung der Konfluenz semi-quantitative Metriken liefert, um den Fortschritt der Reprogrammierung zu überwachen.

Einleitung

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Patienten stammende induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind vielversprechende Werkzeuge für Zelltherapie und Wirkstoff-Screening. Sie bieten eine autologe Quelle von Zellen für die Therapie. Darüber hinaus umfassen sie ein sehr breites Spektrum an genetischen Hintergründen, eine detaillierte In - vitro - Analyse von genetischen Erkrankungen jenseits dessen, was Strom an embryonalen Stammzellen (ESC) Linien erlauben würde , zu ermöglichen. Jüngste Fortschritte haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt iPSCs zur Erzeugung, einschließlich Umprogrammierung mit Sendai - Virus, episomalen Plasmiden oder mRNAs 1,2. Bemer....

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Protokoll

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1.Solution und Medium Vorbereitung

  1. Basalmembranmatrix (Gereinigt aus Engelbreth-Holm-Swarm - Tumor)
    1. tauen langsam Basalmembranmatrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht.
    2. Von der Stammlösung 1: 1 mit 5 ml eiskaltem, sterilem DMEM / F-12-Medium in einem sterilen, vorgekühlte 15 ml konischen Röhrchen. Dispense Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C.
    3. Vor Gebrauch, tauen die gefrorenen 1: 1 Basalmembranmatrix aliquoten über Nacht bei 4 ° C. Zur Zeit der Verwendung, verdünnt ferner das 1: 1-Aliquot ein anderes 50-fach mit eiskaltem, sterilem DMEM / F-12....

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Ergebnisse

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Überwachung Reprogrammierung Kinetics Mit Flow Cytometry

CD44 ist ein Fibroblasten - Marker während SSEA4 ein PSC Marker 6,10 ist. Wie aus diesem Expressionsmuster erwartet, Durchflusszytometrie von BJ Fibroblasten zeigt eine SSEA4 - CD44 + Population, die die Schaffung von Quadranten Toren in Kombination mit der ungefärbten Probe erleichtert. Während Reprogrammierung von DF1 Fibroblas.......

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Diskussion

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Diese Studie bietet Strategien zur Überwachung und Verfolgung des Reprogrammierungsprozesses mit Hilfe von Durchflusszytometrie und bildgebender Echtzeitanalyse. Die kritischen Schritte im Protokoll sind die Initiierung der Reprogrammierung, die Messung des Reprogrammierungsfortschritts auf der Grundlage der Markerexpression und die Echtzeitüberwachung der Reprogrammierung. Jede Reprogrammierungsmethode der Wahl kann verwendet werden, aber hier konzentrieren wir uns auf die Sendai-basierte Reprogrammierung von humanen Fi.......

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Offenlegungen

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Alle Autoren [RHQ, JSTA, KS, und UL] sind Mitarbeiter von Thermo Fisher Scientific, die in diesem Artikel einige der verwendeten Reagenzien und Instrumente produziert.

Danksagungen

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Die Autoren danken Chad MacArthur für hilfreiche Diskussionen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAXSupplement, PyruvatThermo Fisher Scientific10569-010
Fötales Rinderserum, qualifiziert für embryonale Stammzellen, US-HerkunftThermo Fisher Scientific16141-061
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)Thermo Fisher Scientific11140-050
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot Thermo Fisher Scientific25300-054
Maus (ICR) Inaktivierte embryonale FibroblastenThermo Fisher ScientificA24903
Attachment Factor Protein (1x)Thermo Fisher ScientificS-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific10565-018
KnockOut-SerumersatzThermo Fisher Scientific
2-Mercaptoethanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
Kollagenase, Typ IV, PulverThermo Fisher Scientific17104-019
TrypLE Select Enzym (1x), kein Phenolrot Thermo Fisher Scientific12563-011
DPBS, kein Kalzium, kein MagnesiumThermo Fisher Scientific14190-144
Geltrex LDEV-frei, hESC-qualifiziert, Basalmembran-Matrix mit reduziertem WachstumsfaktorThermo Fisher ScientificA1413302
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinantes humanes ProteinThermo Fisher ScientificPHG0264
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575-020
Rinderalbuminfraktion V (7,5 %ige Lösung)Thermo Fisher Scientific15260-037
HEPES (1 m)Thermo Fisher Scientific15630-080
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140-122
InSolution Y-27632EMD Millipore688001
CytoTune-iPS Sendai ReprogrammierungskitThermo Fisher ScientificA1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai ReprogrammierungskitThermo Fisher ScientificA16517
Countess II Automatisierter ZellzählerThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Countess ZellzählkammerObjektträger Thermo Fisher ScientificC10228
BJ ATCC Humane Vorhaut-Fibroblasten, NeugeboreneATCCCRL-2522
DF1 Erwachsene humane dermale FibroblastenThermo FisherScientific N/A
BG01V/hOG Zellen Variante hESC hOct4-GFP ReporterzellenThermo Fisher ScientificR7799-105
IncuCyte ZOOMEssen BioScience
SSEA-4 Antikörper, Alexa Fluor 647 Konjugat (MC813-70)Thermo Fisher ScientificSSEA421
SSEA-4 Antikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat (eBioMC-813-70 (MC-813-70))Thermo Fisher ScientificA14810
SSEA-4 Antikörper (MC813-70)Thermo Fisher Scientific41-4000
TRA-1-60 Antikörper (cl.A)Thermo Fisher Scientific 41-1000
CD44 Ratte Anti-Mensch/Maus mAb (Klon IM7), PE-Cy5 KonjugatThermo Fisher ScientificA27094
CD44 Alexa Fluor 488 Konjugat-Kit für die Bildgebung lebender ZellenThermo Fisher ScientificA25528
CD44 Ratte Anti-Mensch/Maus mAb (Klon IM7)Thermo FisherScientific RM-5700 (nicht mehr erhältlich)
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 KonjugatThermo Fisher Scientific  A-11029
Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 KonjugatThermo Fisher Scient  A-11007
Alkalische Phosphatase LebendfleckThermo Fisher ScientificA14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Konjugat-Kit für die Bildgebung lebender ZellenThermo Fisher ScientificA25618
CD24 Maus Anti-Human-mAb (Klon SN3), FITC-KonjugatThermo Fisher ScientificMHCD2401
Beta-2-Mikroglobulin-Antikörper, FITC-Konjugat (B2M-01)Thermo Fisher ScientificA15737
EpCAM / CD326 Antikörper, FITC-Konjugat (VU-1D9)Thermo Fisher ScientificA15755
CD73 / NT5E Antikörper (7G2)Thermo Fisher Scientific41-0200
VECTOR Substrat Kit für rote alkalische Phosphatase (AP)Vector LaboratoriesSK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 Mikroskop Carl Zeiss491912-0003-000
FlowJo Datenanalyse-SoftwareFLOJO, LLCN/A
Attune Akustisches Fokussierungszytometer, blau/rot LaserThermo FisherWissenschaftliche Nutzung Attune NXT 
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm)BIO-RAD1451006
Falcon 12 x 75 mm Röhrchen mit Cell StrainerCap Corning352235
Falcon 15 ml, hochklar, kuppeldichtende SchraubkappeCorning352097
Falcon T-75 FlaskCorning353136
Falcon T-175 FlaskCorning353112
Falcon 6-Well-DishCorning353046
Heraeus Heracell CO2 RollinkubatorThermo Fisher Scientific51013669
Antihaftbeschichtete, RNasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 mlAM12450
HulaMixer Probenmischer15920D
10828010

Referenzen

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  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., ....

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Schlagwörter

Somatic ReprogrammingiPSC GenerationFlow CytometryReal Time ImagingCell Surface MarkersReprogramming KineticsFibroblast ReprogrammingConfluence MeasurementAntibody StainingLive Cell Imaging

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