Methodenartikel

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

DOI:

10.3791/54202

⸱

22. August 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Selbstorganisierte Polyelektrolytkomplexe (PEC), die aus Heparin und Protamin hergestellt wurden, wurden auf Alginatkügelchen abgelagert, um die Freisetzung von osteogenen Wachstumsfaktoren einzufangen und zu regulieren. Diese Verabreichungsstrategie ermöglicht eine 20-fache Reduzierung der BMP-2-Dosis bei Wirbelsäulenfusionsanwendungen. Dieser Artikel veranschaulicht die Vorteile und die Herstellung von PECs.

Zusammenfassung

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Während der rekonstruktiven Knochenoperationen werden supraphysiologischen Mengen von Wachstumsfaktoren empirisch auf Gerüsten geladen erfolgreiche Knochenfusion zu fördern. Große Dosen von hochpotenten biologischen Agenzien werden als Ergebnis der raschen enzymatischen Abbau durch Wachstumsfaktor-Instabilität erforderlich sowie Träger Ineffizienzen in ausreichenden Mengen des Wachstumsfaktors an Implantatstellen zu lokalisieren. Daher Strategien, die die Stabilität von Wachstumsfaktoren wie BMP-2 / NELL-1 und steuern ihre Freilassung zu verlängern könnte tatsächlich ihre wirksame Dosis zu senken und damit die Notwendigkeit für größere Dosen bei zukünftigen Knochenregeneration Operationen reduzieren. Dies wiederum wird Nebenwirkungen und Wachstumsfaktor-Kosten zu reduzieren. Selbstorganisierende PECs wurden hergestellt , eine bessere Kontrolle der BMP-2 / NELL-1 Lieferung über Heparinbindung bereitzustellen , und weiter potenzieren Wachstumsfaktor - Bioaktivität durch Verbesserung in vivo Stabilität. Hier zeigen wir die Einfachheit der PEC Fertigung, die in der delive hilftry einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren während der rekonstruktiven Knochen Operationen.

Einleitung

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Die Inzidenz von Pseudoarthrosen wurde berichtet , so hoch wie 10 bis 45% in degenerative Spondylodese und Revisionswirbelsäulenchirurgie 1 sein. Um die Rate der Pseudoarthrose während Wirbelsäulenfusion und andere rekonstruktive Knochenoperationen, osteogenen Wachstumsfaktoren wie BMP-2, Nell-1 1 und von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) reduzieren wurden eingeführt , um de novo Osteogenese fördern. Unter diesen ist BMP-2 eine beliebte Wahl für Spondylodese 2. Obwohl die Wirksamkeit von BMP-2 bei der Induktion und neue Knochenbildung zu erleichtern wurde gut etabliert 3; klinisch signifikanten Komplikationen wie heterotope Knochenbildung, seroma und Hämatome, Entzündungsreaktion, Radikulitis, Wirbelkörper Osteolyse und rückläufige Ejakulation weiterhin aufgrund der supraphysiologischen Mengen 4,5 Anliegen zu sein.

Daher bleibt die Dosis von BMP-2 Absenken einer entsprechenden Strategie in zuminverleitet Nebenwirkungen zu minimieren. Außerdem sind effiziente Trägersysteme erforderlich, um den ersten Ausbruch Freisetzung von BMP-2 beobachtet in der zeitgenössischen Kollagenschwamm Trägersysteme und weiter zu verbessern verlängerte und lokalisierte Abgabe dieses potenten Zytokin zu unterdrücken. Die Schicht- für -Schicht - Selbstorganisation von kationischen und anionischen Polyelektrolyten alternierende kann als abstimmbarer Verfahren eingesetzt werden 6 Polyelektrolytkomplexe zum Aufbau auf der Oberfläche des Gerüsts Matrices oder implantierbare Materialien. In dieser Hinsicht, Heparin (bekannt für die höchste negative Ladungsdichte aller biologischen Agenzien haben) erkannt wurde, mit einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren über elektrostatische und Heparin-Bindungsdomänen avidly zu binden. Tatsächlich wurde Heparin gezeigt, um die Halbwertszeit zu verlängern und damit die Bioaktivität von verschiedenen Wachstumsfaktoren zu potenzieren.

Auf dieser Basis angepasst unserer Gruppe eine Schicht-für-Schicht self-assembly-Protokoll ein auf Heparin-Basis Polyelektrolytkomplex (PEC) herzustellen, die Lasten und bewahrt die Bioaktivitäten von osteogenen Wachstumsfaktoren während der Immobilisierung 7,8. Die Alginat-Mikrokügelchens Kern wurde durch vernetzende α-L-Guluronat (G) -Resten von Alginat mit zweiwertiges Kation Calcium- oder Strontiumionen hergestellt. Die Alginat-Kern ist ein biologisch abbaubares Gerüst Matrix; die nach der Implantation wird in dem Fusionsbett bietet Raum für das Einwachsen des Knochens resorbiert. Poly-L-Lysin (PLL) oder Protamin als kationische Schicht verwendet mit Interlace sowohl die Gerüstmatrix (in diesem Fall das Alginat Mikrokügelchens Trägerkern) und dem negativ geladenen Heparin; während die anionische Funktionen Heparin Schicht zu stabilisieren und belastet Wachstumsfaktoren zu lokalisieren. Die dreilagige PEC wurde in einem Schweinemodell 9 gezeigt Wachstumsfaktor Belastbarkeit zu erhöhen. Vor kurzem haben PEC Träger wurden in Ratten 10 und Schweinemodellen Spondylodese 8 gezeigt , um erfolgreich die wirksame Dosis von BMP-2 um mindestens das 20-fache zu verringern.

ntent "> Hier berichten wir über die Verfahren zur Herstellung von PEC für verbesserte Wachstumsfaktor Lieferung in Spondylodese und den anderen rekonstruktiven Knochenoperationen unter Verwendung von BMP-2 als osteogenen Wachstumsfaktor-Modell.

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Protokoll

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1. Alginatlösung Vorbereitung

  1. Man löst 200 mg Natriumalginat (nicht bestrahlten) oder 400 mg 8 MRad bestrahlt Natriumalginat in 10 ml doppelt destilliertem Wasser und Schütteln für 1 Stunde für nicht abgestrahlte Alginat und 15 min für bestrahlte Alginat. Lagern Sie die Alginat-Lösung bei 4 ° C über Nacht. Filtern Sie die Alginat-Lösung mit einem sterilen 0,2 um Spritzenfilter vor Alginat Mikrobead Fertigung.

2. Alginate Microbead Fabrication

  1. Desinfizieren Sie die elektrostatische Wulst Generator und Spritzenpumpe mit 70% Ethanol und legen Sie sie in der Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank (Abbildung 1).
  2. Ein Glastisch mit einem magnetischen Rührstab im Inneren des Wulst-Generator.
  3. Stellen Sie den Arm-Elektrode des Wulst-Generator 9 cm über dem Becken.
  4. Schließen Sie das Elektrodenkabel des Wulstes Generators an die Rändelschraube 2 des Arm - Elektrode und schütten 80 ml ​​SrCl 2 -Lösung in dieBecken.
  5. Last 5 ml von 0,2 um filtriert Alginat-Lösung in die Spritze und Gummischlauch. Nach dem Verbinden der Gummischlauch auf den Arm Elektrode, einschalten der Spritzenpumpe bei 5 ml / h für 2 min die Luft innerhalb des Schlauchs zu vertreiben und die Alginatlösung in die Spitze der Düse zu liefern. Drehen Sie die Spritzenpumpe ab.
  6. Als nächstes schalten Sie den encapsulator und dann auf die Spritzenpumpe Mikrobead Generation beginnen. Stellen Sie die Alginat-Strömungsgeschwindigkeit bei 5 ml / h und die Spannung bei 5,8 kV an der encapsulator. Verwerfen, die während der ersten zwei Minuten erzeugt Mikrokügelchen (oder die anfängliche 0,5 ml Alginatlösung aus der Spritze gepumpt), da diese Mikrokügelchen neigen unregelmäßig dimensioniert und geformt sein.
  7. Sammeln nachfolgende Mikrobeads in 0,2 M Strontiumchloridlösung. Schalten Sie sowohl die Spritzenpumpe und die encapsulator (in dieser Reihenfolge) nach der im voraus geplanten Volumen von Alginat-Lösung zu pumpen. Wiederholen Sie dies für nachfolgende Chargen von Mikrobead Fertigung. Nach Abschluss der Wendef der Spritzenpumpe zunächst durch die encapsulator gefolgt.
  8. Speichern der Mikrokugeln in 20 ml 0,2 M Strontiumchloridlösung bei 4 ° C über Nacht Vernetzung zu vervollständigen und um das Gel zu stabilisieren.

3. Größe Messung der Alginate Microbeads

  1. Sammeln Sie 0,5 ml Alginat-Mikrokügelchen mit einer Plastikpipette und legen Sie es auf einem Glasträger. Sehen Sie sich die Mikrokügelchen unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Nehmen zehn Bilder der Mikrokügelchen mit einem Mikroskop-CCD-Kamera. Speichern Sie die Bilder mit Skala bar (500 & mgr; m) im TIFF-Format bei einer Auflösung von 2.048 x 1.536.
  2. Unter Verwendung der Länge Werkzeuge in ImageJ, messen Sie die Größe der Mikrokügelchen und Maßstabsleiste (Abbildung 2). Konvertieren Sie die Mikrokügelchen Länge von Pixel zu Mikrometer.
    1. Klicken Sie auf die Zeilentools und eine Linie in der Mitte des Alginatkugel ziehen.
    2. Klicken Sie auf "Analysieren" auf der Menüleiste und wählen Sie "Messen". Ein Pop-up-Fenster erscheint.
    4. Konvertieren den Durchmesser des Alginatkugel der tatsächlichen Länge unter Verwendung der Formel: Länge der Alginatkugel / Länge von Maßstabsleiste x 500 um. Zum Beispiel, 1,420 (Durchmesser gemessen von ImageJ) / 2,657 (Maßstab Länge von ImageJ gemessen) * 500 & mgr; m = 267 & mgr; m.
  3. Betrachten Sie die durchschnittliche Größe von 100 Mikrokugeln (Mittelwert ± Standardabweichung) als Vertreter Größe jeder Charge von Mikrokügelchen.

4. Sterilisation

  1. Sammeln Sie die Mikrokügelchen eine 100 & mgr; m Nylon-Sieb verwenden und die Perlen mit doppelt destilliertem Wasser waschen.
  2. Mit einem Spatel, übertragen alle aus Mikrokügelchen von 0,1 ml Alginatlösung in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit Gaze Austrocknen zu verhindern.
  3. Schließlich sterilisieren die Mikrokügelchen durch Flüssigmodus Autoklavenbehandlung unter Verwendung von (115 ° C, 15 min) oder in Übereinstimmung mit mersteller Angaben. Hinzufügen 1,5 L destilliertem Wasser in die Kammer aus Trockenperlen zu verhindern.

5. Protamin und Heparin-Beschichtung

  1. Im Inneren der BSL-2 hood inkubieren die sterile Mikrokügelchen mit 1 ml von 2 mg / ml Protamin Lösung (sterilisiert, um eine 0,2 & mgr; m Spritzenfilter) für 1 h bei Raumtemperatur.
  2. Nach Inkubation der Mikrokugeln für 1 Stunde (Schritt 5.1), sammeln 150 ul der Protaminlösung für die Mikro Bicinchoninsäure (microBCA) Test (Abschnitt 6).
  3. Waschen Sie die Protamin beschichteten Mikrokügelchen zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Spin down mit einer Tischzentrifuge bei 200 × g für 3 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation absaugen Wasser unter Verwendung einer Spritze.
  4. Inkubieren Protamin beschichteten Mikrobeads mit 1 ml von 0,5 mg / ml Heparinlösung (sterilisiert, um eine 0,2 & mgr; m Spritzenfilter) für 30 min Polyelektrolytkomplex (PEC) zu erstellen.
  5. Nach dem Protamin beschichteten Mikrokügelchen f Inkubationoder 30 min (Schritt 5.4), sammeln 400 ul der Heparin-Lösung Heparingehalt (Abschnitt 7) zu bestimmen.
  6. Nach der Inkubation waschen das ungebundene Heparin aus den BBW durch zweimaliges Waschen mit doppelt destilliertem Wasser ab.

6. Protamin Inhalt

  1. Führen Sie die microBCA Prüfung nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, mit 150 & mgr; l Protaminlösung (vor und nach der Inkubation mit Mikrokugeln gesammelt) in eine 96-Well-Platte. In 150 ul microBCA Arbeitslösung.
  2. Verwenden Albuminlösung (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 und 200 ug / ml) als Kalibrierungsstandards.
  3. Inkubieren der Mischung für 60 min bei 60 ° C. Messen der Extinktion mit einem Spektrophotometer bei 562 nm.
  4. Verwenden der Standardkurve, die Protamin-Konzentration von jeder unbekannten Probe zu bestimmen, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  5. Bestimmen die Protamin-Gehalt der Mikrokügelchen durch die Gesamtmenge von Protamin in der SubtrahierenBeschichtungslösung (vor der Inkubation mit Microbeads) aus der Menge an Protamin in der Beschichtungslösung verbleibende (nach Inkubation mit Microbeads).

7. Heparin Inhalt

  1. Bereiten Sie die 10 ml der Arbeitslösung durch Auflösen von 4 mg Toluidinblau und 20 mg Natriumchlorid in 0,01 N Salzsäure.
  2. Werden 400 ul Probe (aus Schritt 5.5) in die Arbeitslösung in einem Verhältnis von 2: 3 und Vortex für 30 sec.
  3. Hinzufügen, 600 & mgr; l n-Hexan (äquivalentes Volumen an die Arbeits Reagenslösung) und die Mischung vortexen die Toluidinblau Heparinkomplex zu extrahieren.
  4. Aspirat 200 & mgr; l der wässrigen Phase durch eine Spritze nach der Phasentrennung.
  5. Messen der Menge an nicht-extrahierten Toluidinblau in der wässrigen Phase enthielt ein Spektrophotometer bei 631 nm verwendet wird.
  6. Bereiten Sie Heparin Standardlösungen von 0-20 & mgr; g / ml.
  7. Zeichnen Sie die 631 nm Lesen jedes Heparin-Standard gegen Heparinkonzentration in g / ml. Verwenden, um die Standardkurve der Heparinkonzentration jeder Probe zu bestimmen.

8. Die konfokale Bild von Schicht-für-Schicht-Struktur

  1. Fabrizieren Protamin, Heparin und Nell-1 / BMP-2 Fluoreszenz analog CF-405 Protamin (blau), CF 594 Heparin (rot) und FITC markiertem NELL-1 / FITC markiert (grün) BMP-2 + Heparin + Protamin nach Hersteller technisches Datenblatt.
  2. Coat 100 & mgr; g Mikrokügelchen mit 300 ul Fluoreszenz analog (Beschichtungsverfahren wie in 5,3-5,6 beschrieben) CF-405 Protamin (blau) (2 mg / ml, 1 h Inkubation), CF 594 Heparin (rot) (0,5 mg / ml, 30 min) und FITC markiert NELL-1 / FITC markiert (grün) BMP-2 (1,5 mg / ml, über Nacht). Waschen der Mikrokügelchen zweimal mit destilliertem Wasser, um die ungebundenen Fluoreszenz Protamin, Heparin und Nell-1 / BMP-2 zu beseitigen.
  3. Beachten Sie die Schicht- für -Schicht - Struktur (Abbildung 3) durch ein konfokales Mikroskop mit 10 - facher Vergrößerung verwendet wird . 7

9. BMP-2und Nell-1 Aufnahme und -abgabe

  1. Last 13,3 & mgr; l von 1,5 mg / ml BMP-2 oder NELL-1-Lösung auf 100 & mgr; g PEC. Inkubieren PEC bei 4 ° C unter 30 Umdrehungen pro Minute für 10 Stunden Schütteln.
  2. Tauchen Sie die Mikrokügelchen in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C unter konstantem Schütteln (30 rpm).
  3. Sammeln Sie 1 ml des Überstandes und ersetzen Sie es mit 1 ml PBS nach 1, 3, 6, 10 und 14 Tage.
  4. Bewerten die Aufnahme und Abgabe Effizienz der BMP-2, um die ELISA-Methode unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers. Bewerten die Aufnahme und Abgabe Effizienz NELL-1 die carboxybenzoyl Chinolin-2-carboxaldehyd (CBQCA) Protein-Assay-Verfahren gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  5. Bestimmen Sie kumulative Freisetzung zur Zeit (t):
    Kumulative Freisetzung zum Zeitpunkt (t) = Freigabe zum Zeitpunkt (t) + vorherige Freigabe zum Zeitpunkt (t-1).
  6. Plot kumulative Freisetzung von BMP-2 und Nell-1 gegen die Zeit.

10. In - vitro - Bioaktivitätvon Nell-1

Anmerkung: Die Bioaktivität Nell-1 von PEC veröffentlicht wurde durch Messen seiner Fähigkeit bewertet, die Expression von alkalischer Phosphatase (ALP) in Kaninchen-Knochenmark-Stammzellen (rBMSC) zu erhöhen.

  1. Seed 20.000 rBMSCs pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen und erlauben ihnen 2 einen Tag lang mit 1 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C und 5% CO zu wachsen.
  2. Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Medium mit 1 ml eines osteogenen Medium (DMEM mit 10% FBS, 2% Penicillin Streptomycin, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 10 mmol / L beta-Glycerophosphat und 10 -8 mol / L Dexamethason for) 7 Tage bei 37 ° C und 5% CO 2.
  3. Legen 300 & mgr; g PEC-Nell-1 (aus Schritt 8.2) und PEC Inneren Zellkultur-Einsätze (TC Insert), um die PEC halten getrennt von den Zellen (dies vermeidet die Auswaschung von PEC-Mikrokügelchen während der osteogenen Mediumwechsel). Platz TC führen, in den 24-Well-plaß für 14 Tage.
  4. Sobald alle drei Tage, aspirieren 1 ml des osteogenen Medium durch eine Nadel außerhalb des TC Einsatz platzieren und ersetzen mit 1 ml frischem osteogenen Medium.
  5. Nach 7 und 14 Tagen Inkubation bestimmen ALP-Aktivität mit einem ALP-Testkit in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Kit-Herstellers.
    1. Lysieren Zellen mit Assay-Puffer, enthaltend 0,1% Triton X-100 bei 4 ° C für 10 min. Scrape anhaftenden Zellen mit einem Zellschaber aus. Inkubieren bei 4 ° C unter Rühren Zellsuspension für 60 min zumindest.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 2.500 × g bei 4 ° C für 10 min. Sammeln Sie den Überstand für die ALP-Test.
    3. Zugabe von 50 & mgr; l seriell verdünnte alkalische Phosphatase-Standardlösung 200-0 ng / ml zu den Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Die endgültigen Mengen an alkalischer Phosphatase-Standard sind 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 und 0 ng / Vertiefung.
    4. Fügen Sie den Überstand von Schritt 10.5.2 (50 & mgr; l / Vertiefung) und verdünnt mit Verdünnung bUffer.
    5. In 50 ul p - Nitrophenylphosphat (pNPP) Substratlösung in jede Vertiefung. Mischen Sie die Reagenzien durch leichtes Schütteln der Platte für 30 Sekunden. Inkubieren der Mischung für 30 min im Dunkeln. Messen Sie die Absorption bei 405 nm von Plattenleser.
    6. Berechnen ALP-Aktivität der Kalibrierungskurve.
  6. Bestimmen Proteingehalt des microBCA Protein-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Normalisieren der ALP-Aktivität durch Dividieren ALP-Aktivität von Eiweißgehalt.

11. Zelllebensfähigkeit

  1. Inkubieren 200 mg der PEC-NELL-1 mit 1 ml DMEM + 10% FBS bei 37 ° C für 24 Stunden für den 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Test.
  2. Seed 2,000 rBMSCs pro Vertiefung (in 100 & mgr; l DMEM mit 10% FBS) in eine 96 - Well - Platte und Inkubation für 1 Tag bei 37 ° C, 5% CO 2.
  3. Ersetzen DMEM + 10% FBS mit 100 ul PEC-Nell-1 / PEC-Extrakt und Inkubationbei 37 ° C, 5% CO 2.
  4. Nach 1 Tag oder 3 Tagen Inkubation wurden 10 ul von 5 mg / ml MTT - Lösung hinzufügen und weiter bei 37 ° C, 5% CO 2 für 4 Stunden im Dunkeln inkubieren.
  5. Füge 100 & mgr; l DMSO-Lösung zu jeder Vertiefung Formazankristalle zu lösen.
  6. Bestimmen Sie die Absorption bei 570 nm im Mikrotiterplatten-Reader.
  7. Berechnen Sie die relative Wachstumsrate:
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12. Verpackung in Scaffold und BMP-2 & Nell-1 Loading

  1. Packen die PECs in die Poren eines bioresorbierbaren medizinischen Grades Polycaprolacton - Tricalciumphosphat (MPCL-TCP) Gerüst eines sterilisierten Spatel in einem BSL-2-Kammer verwendet wird.
  2. In 1,5 mg / ml Lösung von BMP-2 oder NELL-1 auf den MPCL-TCP Gerüst mit PEC gepackt und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.

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Ergebnisse

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In unserem Träger wurde als Ersatz von Poly-L-Lysin-Protamin gewählt, da sie ähnliche chemische Eigenschaften hat, und es ist von der FDA als Antidot von Heparin zugelassen. Lichtmikroskop zeigte sich, dass die nicht bestrahlten Mikrobeads mit einem Durchmesser von 267 ± 14 & mgr; m in Form sphärisch waren. (0,35 mm Düse, Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / h und 5,8 kV). Die Mehrzahl der bestrahlten Mikrokugeln sind von Tropfenform. Der Durchmesser auf der runden Abschnitt der bestr...

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Diskussion

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Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Herstellung von PECs durch die Schicht-für-Schicht self-assembly. Der Schicht-für-Schicht-Struktur wird unter Verwendung von fluoreszierenden Analoga von Protamin, Heparin visualisiert, BMP-2 und Nell-1 und der konfokalen Mikroskopie. Uptake und Release-Tests zeigen, dass auf PEC Heparin osteogenen Wachstumsfaktor Aufnahme und Freisetzung vermittelt. Die Aufnahme Effizienz des PEC Methode ist: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Der PEC Träger hat eine bessere Modulation Nel...

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Offenlegungen

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Wir haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Studien wurden finanziert durch den National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 und NMRC EDG/0022/2008.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Biowissenschaften Acrodisc 25  mm Spritzenfilter mit 0,2  &Mikro; m Supor MembranPALL PN4612Sterile Protamin-Heparin-Lösung durch Ultrafiltration
24-Well-PlatteCell Star 662160
96-Well-Platte Nuclon Delta SurfaceThermo Fisher Scientific167008
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid), MTTSigma AldrichM5655Messung der Zytotoxizität von PEC-NELL-1
AcetonFisher ScientificA/0600/17Niederschlag CF-405
markiertes Protamin
Alamar BlueInvitrogen, Life TechnologiesDAL 1025Messung der Zytotoxizität von PEC-BMP-2
Alkalischer Phosphatase Assay (ALP) Assay KitAnaspecAS-72146
AmmoniumchloridMerckArt 1145Stoppreagenz in der FITC-Markierung
Wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO)Invitrogen, Life TechnologiesD12345Lösungsmittel für fluoreszierendes Isothiocyanat I
Dimethylsulfoxid ( DMSO)Sigma AldrichAuflösen  formazan 
AutoklavHirayamaHU-110Sterilisieren von Alginatkügelchen mit Dampf
Beta-GlycerophosphatSigma AldrichG9422
BMP-2 (Infusion Bone Graft Large II Kit) Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA7510800Osteogener Wachstumsfaktor, Dialyse ist erforderlich, um die Stabilisatorkomponente zu entfernen, die die FITC-Kopplung stört
Carboxybenzoylchinolin-2-Carboxaldehyd (CBQCA) Thermo Fisher ScientificA-6222Zur Quantifizierung von NELL-1 Protein
Cell Strainer (100  &Mikro; m)BD Science352360PEC für ALP-Assay
Cell Scraper 290  mm Sägebreite 20  mmSPL Life Science90030Lösen Sie die Zelle von der 24-Well-Platte
CF 405S, SuccinimidylesterSigma AldrichSCJ4600013Blauer Fluoreszenzfarbstoff für die Protaminmarkierung
CF 594, HydrazidSigma AldrichSCJ4600031Tiefroter Fluoreszenzfarbstoff für die Heparinmarkierung
ZentrifugeBeckman CoulterMicrofuge 22R
KonfokalmikroskopOlympus FV1000
DexamethasonSigma AldrichD4902Bestandteil des osteogenen Wachstumsmediums
Dextran EntsalzungssäulenPierce (Thermo Scientific) 43230
DMEMGibco 12320
BMP-2 Quantikine ELISA KitR& D SystemDBP200Bestimmung der BMP-2-Freisetzung
Fetales Rinderserum FBSHycloneSV30160.03
Fluoescein Isothiocyananat, Isomer ISigma AldrichF7250Grüner Fluoreszenzfarbstoff für NELL-1 und BMP-2 Markierung
ThinCert Zellkultureinsätze,
Für 24 Well Platten, steril		Greiner 662630Verhindert das Auswaschen von PEC beim Wechsel des osteogenen Mediums
Havard Appartus Spritzenpumpe (11 plus)Havard Apparatur70-2208
n-Hexan (>99%)Sigma Aldrich139386
HeparinSigma AldrichH3149Bindet an den osteogenen
Wachstumsfaktor mit Heparin-Bindungsdomäne
Salzsäure (37%)Merck100317Hochkorrosiver
InkubatorBinderC8150
MicroBCA Protein Assay KitThermoscientific23235
Microplate ReaderTecanInfinite M200Für ALP- und microBCA-Assays
Nisco ZellverkapselerNisco Engineering IncVerkapselungseinheit VAR V1
FluoreszenzmikroskopOlympusIX71
mPCL-TCP Gerüst (Porengröße beträgt 1,3  mm)OsteoporePCL-TCP 0/90Hold PEC für in vivoStudie
Penicillin-Streptomycin 10.000 Einheit/ml, 100  mlHyclone ZellkulturSV30010Antibiotikum
10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)VivantisPB0344-1L10x Lösung, ultrareines
Poly-L-Lysin MW 15.000-30.000Sigma AldrichP2568Polykation
Protamin Sulfatsalz, aus LachsSigma AldrichP4020Polykation
ShakerLabnetS2025
Schlangenhaut-Dialyseschlauch 3.500 MWCO 22  mm x 35 FußThermo Fisher Scientific68035Entfernen Sie nicht umgesetztes FITC durch Dialyse
NatriumchloridMerck1.06404.1000
NatriumhydroxidQrecS5158
NatriumbicarbonatUS BiologicalS4000Puffer
NatriumcarbonatSigma AldrichS7795-500GPuffer
Strontiumchlorid HexahydratSigma Aldrich255521Vernetzer für Alginatspatel
3dia
5 ml SpritzeTerumo140425RDurchmesser der Spritze beeinflusst die Durchflussrate
75 cm2 Zellkulturflasche Canted NeckCorning730720
Toluidine BlueSigma Aldrich52040Heparin-Assay
Trypsin 1xHyclone ZellkulturSH30042.01
NatriumalginatNovamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)Pronova UPMVGKernmaterial von Mikrokügelchen

Referenzen

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  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
  3. Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
  4. Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
  5. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
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