Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

Qianfan Bai; Zhiqiang Bai; Shaohai Xu; Lei Sun

doi:10.3791/54207

Methodenartikel

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

DOI:

10.3791/54207

⸱

22. Juli 2016

Qianfan Bai^*¹ , Zhiqiang Bai^*¹ , Shaohai Xu³ , Lei Sun¹^,²

¹Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, ²Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, ³Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

^* These authors contributed equally

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Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

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Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine (RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten.

Zusammenfassung

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RNA-bindende Proteine (RBPs) entstehen als regulatorischer Ebene in der Entwicklung und Funktion von Fettgewebe. RBPs spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation bei posttranskritionelle Ebenen durch die Stabilität und Translationseffizienz von Ziel-mRNAs beeinflussen. RNA pull-down-Technik weit verbreitet RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen ist, die notwendig ist, den Mechanismus zugrunde liegende RBPs 'sowie lange nicht-kodierenden RNAs' (lncRNAs) Funktion aufzuklären. Jedoch stellt die hohe Lipid Fülle in Adipozyten eine technische Herausforderung, dieses Experiment in der Durchführung. Hier ist eine detaillierte RNA Pull-Down-Protokoll wird für die primäre Adipozyten Kultur optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptors (AR) 3 'untranslatierten Region (3'-UTR), die eine Adenylat-uridylat reichen elementwas verwendet als ein Beispiel enthält, zu zeigen, wie ihre RBP Partner HuR Protein von Adipozyten lystate abzurufen. Das hier beschriebene Verfahren kann um die Wechselwirkungen zu detektieren angewendet werden zwischenRBPs und nicht-kodierenden RNAs sowie zwischen RBPs und kodierenden RNAs.

Einleitung

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RBPs sind Proteine, die bei der Bildung von RNA-Protein-Komplexe in Zellen zur Doppel- oder Einzelstrang-RNA binden und zu beteiligen. RBPs kann eine Vielzahl von RNA-Spezies binden, einschließlich mRNA und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) und deren Einfluss auf posttranskriptionales Ebenen ausüben. Beide RBPs und lncRNAs sind , sich als neue Aufsichtsbehörden bei adipösen Entwicklung und Funktion ^1,2,3. Um zu verstehen, den Mechanismus der RBP- und lncRNA vermittelte Regulation der zellulären Wege, ist es oft notwendig ist, die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen RNA-Moleküls und eines oder mehrere RBPs zu erfassen, und manchmal das gesamte Spe....

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Protokoll

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HINWEIS: Die RNA von Interesse im Rahmen dieser Studie ist ein Fragment von AR 3'UTR.

1. Herstellung von Biotin-markierter RNA

Um die RNA zu erhalten, T7-AR-Oligos durch PCR, gefolgt von in vitro Transkription unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers ¹¹ amplifizieren.
HINWEIS: T7-AR-F und T7-AR-R: Primer für die PCR sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Für nicht-spezifische Bindungskontrolle, amplifizieren eine Teilsequenz der Glühwürmchen - Luciferase (FL) DNA durch PCR aus psiCHECK-2 - Plasmid, gefolgt von in vitro Transkript....

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Ergebnisse

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In dieser Demo-Experiment wurde ein AR-RNA-Fragment als Köder verwendet, um seine bindende Protein HuR zu erfassen. Sowohl ein FL RNA Köder, die HuR Protein und ein Aliquot von unkonjugiertem blank Streptavidinbeads dienten als negative Kontrollen nicht relevant ist. RNA-Protein-Wechselwirkungen können entweder im Kern oder Cytoplasma auftreten, und das Pull-Down-Protokoll kann entweder insgesamt oder fraktionierte (Kern- oder cytoplasmatische) Zelllysate angewendet werden. Analyse von P.......

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Diskussion

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lncRNAs und RBPs haben eine lebenswichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, aber die molekularen Mechanismen dieser Moleküle schlecht verstanden werden. Identifizierung von Proteinen, die mit lncRNA Molekülen interagieren ist ein wichtiger Schritt in Richtung auf die Regulationsmechanismen aufzuklären. Anreicherung von RBPs durch die RNA-Pull-Down-Assay-System wird in-Lösung auf Basis von Erfassung von komplexen interagieren, so dass Proteine, die aus einem Zelllysat selektiv extrahiert werden können biotinylierte RNA.......

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Offenlegungen

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Keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von Singapur NRF Gemeinschaft (NRF-2011NRF-NRFF001-025) sowie CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) finanziert.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Wichtige Materialien, die in dieser Studie verwendet wurden.
MEGAscript kit	Ambion
Biotin-14-CTP	Invitrogen
NucAway Spin-Säulen	Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen
HuR (3A2) monoklonaler Maus-Antikörper (sc-5261)	Santa Cruz Biotechnologie
Ziege Anti-Maus IgG-HRP (sc-2005)	Santa Cruz Biotechnology
Hypure Wasser in molekularbiologischer Qualität (nukleasefrei)	HyClone
Phosphat Puffer Kochsalzlösung (1&fach; PBS)	HyClone
RNase-Hemmer	Bioline
Proteasehemmer	Sigma
Pfu Turbo DNA-Polymerase	Agilent Technologies
TRIsure	Bioline
Name	Unternehmen	Katalognummer<	strong>Kommentare
Wichtige Geräte, die in dieser Studie verwendet wurden.
Sorvall Legend Micro 21R Zentrifuge	Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R Zentrifuge	Thermo Scientific
Bio-Rad T100 Thermocycler	Bio-Rad
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
BOECO Rotator Multi Bio RS-24	BOECO, Deutschland
Protein-Gel-Elektrophorese- und Blotting-Geräte	Bio-Rad
DynaMag-2 Magnet	Lebenstechnologien

Referenzen

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Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.

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Qianfan Bai¹*, Zhiqiang Bai^1*, Lei Sun^1,2

¹Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

²Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai¹*, Zhiqiang Bai^1*, Shaohai Xu³, Lei Sun^1,2

¹Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

²Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

³Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

Schlagwörter

In Vitro Transcription Biotinylated RNA Streptavidin Beads Cell Lysate Preparation Western Blotting HuR Protein AR 3 UTR

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

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