Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in Brucella Die Infektion von HeLa-Zellen

Zusammenfassung

Zwei Assays für mikroskopiebasiertes Hochdurchsatz-Screening von Wirtsfaktoren, die an der Brucella-Infektion beteiligt sind, werden beschrieben. Der Entry-Assay weist Wirtsfaktoren nach, die für den Brucella-Eintritt erforderlich sind, und der Endpunkt-Assay diejenigen, die für die intrazelluläre Replikation erforderlich sind. Das siRNA-Screening in HeLa-Zellen ist zwar für alternative Ansätze anwendbar, wird aber zur Veranschaulichung der Protokolle verwendet.

Zusammenfassung

Brucella - Arten sind fakultativ intrazelluläre Erreger, die Tiere als ihre natürlichen Wirte infizieren. Übertragung auf den Menschen wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln und kann zu schweren chronischen Infektionen führen.

Brucella können professionelle und nicht-professionelle Phagozyten eindringen und repliziert innerhalb endoplasmatischen Retikulum (ER) abgeleitetes Vakuolen. Die Wirtsfaktoren für Brucella Eintritt in Wirtszellen, die Vermeidung von lysosomalen Abbau erforderlich ist , und die Replikation in der ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir zwei Assays Wirtsfaktoren beteiligt in Brucella Eintrag und Replikation in HeLa - Zellen zu identifizieren. Die Protokolle beschreiben die Verwendung von RNA-Interferenz, während alternative Screening-Verfahren angewendet werden könnten. Die Assays basieren auf der Detektion von fluoreszenzmarkierten Bakterien in fluoreszenzmarkierte Wirtszellen unter Verwendung automatisierterWeitfeldmikroskopie. Die Fluoreszenzbilder werden analysiert, um eine standardisierte Bildanalyse-Pipeline in CellProfiler verwendet, die einzelnen zellbasierten Infektion Scoring ermöglicht.

Im Endpunkt-Assay wird die intrazelluläre Replikation zwei Tage nach der Infektion gemessen. Auf diese Weise können Bakterien Besucher auf ihre replikativen Nische , wo die Proliferation um 12 Stunden nach der bakteriellen Eintritt initiiert wird. Brucella , die erfolgreich eine intrazelluläre Nische etabliert haben so stark innerhalb von Wirtszellen vermehrt haben wird. Da intrazelluläre Bakterien stark einzelne extrazelluläre oder intrazelluläre nicht-replikativen Bakterien überwiegen werden, die konstitutiv ein Stamm GFP exprimieren, können verwendet werden. Das starke GFP-Signal wird dann verwendet, infizierte Zellen zu identifizieren.

Im Gegensatz dazu ist für den Eintrag Test ist es wichtig, zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden. Hier wird ein Stamm, kodierend für ein Tetracyclin-induzierbarer GFP verwendet. Induktionvon Gentamicin von GFP bei gleichzeitiger Inaktivierung von extrazellulären Bakterien ermöglicht die Unterscheidung zwischen intra- und extrazellulären auf dem GFP-Signal basierend Bakterien, mit nur intrazelluläre Bakterien in der Lage zu sein GFP zu exprimieren. Dies ermöglicht die robuste Detektion einzelner intrazellulären Bakterien, bevor die intrazelluläre Vermehrung initiiert wird.

Einleitung

Brucella Spezies gram-negative, fakultativ intrazelluläre Pathogene zur Klasse der α-Proteo gehören. Sie verursachen Abtreibungen und Unfruchtbarkeit in ihren natürlichen Wirten wie Rinder, Ziegen oder Schafe was zu schweren wirtschaftlichen Verlusten in Endemiegebieten. Brucellose ist eine der wichtigsten Zoonosen weltweit verursacht mehr als eine halbe Million neue Infektionen beim Menschen jährlich ^1. Die Übertragung auf menschliche wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln wie nicht pasteurisierte Milch. Symptome der fieberhafte Erkrankung sind unspezifisch, was Schwierigkeiten bei der Diagnose von Brucellose verursacht. Wenn unbehandelt, können Patienten eine chronische Infektion mit schwereren Symptomen entwickeln , wie Arthritis, Endocarditis und Neuropathie ^2.

Auf zellulärer Ebene ist Brucella können phagozytische und nicht-Phagozyten und repliziert innerhalb eines intrazellulären einzufallenFach wie die Vakuole -haltigen Brucella bekannt (BCV). Internalisierung von Bakterien erfordert von Rac, Rho Aktinzytoskelett Umlagerungen und direkte Aktivierung von Cdc42 ^3. Innerhalb der eukaryotischen Wirtszelle, verkehre die BCV entlang der endocytischen und trotz der Interaktion mit Lysosomen, zu verwalten Bakterien Abbau ⁴ zu vermeiden. Ansäuern des BCV von der vesikulären ATPase erforderlich , um die Expression des bakteriellen Typ IV - Sekretionssystem (T4SS) ⁵ zu induzieren. Es wird angenommen , dass bakterielle Effektoren sekretiert durch die T4SS wesentlich sind für Brucella ihrer replikativen Nische zu etablieren, da Deletion des T4SS ⁶ oder Hemmung der vesikulären ATPase führen zu Fehlern in der Einrichtung der intrazellularen Nische ^7. Bakterien während der Phase des Handels nicht, bis sie replizieren erreichen ⁸ ein ER-derived vacuolar Fach. Sobald die intrazelluläre Vermehrung auftritt, wird die BCV in cl gefundenose Assoziation mit ER Marker wie Calnexin und Glucose-6-Phosphatase - ^6.

Die molekularen Mechanismen , durch die Brucella Zellen eintritt, vermeidet lysosomalen Abbau und repliziert schließlich in einem ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Wirtsfaktoren in verschiedenen Schritten der Infektion beteiligt sind vor allem durch gezielte Ansätze oder kleinem Maßstab small interfering RNA (siRNA) Bildschirm ausgeführt in Drosophila - Zellen ⁹ identifiziert worden. Diese haben Aufschluss über den Beitrag der einzelnen Wirtsfaktoren bei Brucella - Infektion , aber wir sind noch weit von einem umfassenden Verständnis des gesamten Prozesses.

Hier Protokolle, die die Identifizierung der menschlichen Wirtsfaktoren unter Verwendung von großen RNA-Interferenz (RNAi) Screening in Verbindung mit automatisierten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildanalyse ermöglichen vorgestellt. Reverse siRNA-Transfektion von HeLa-Zellen durchgeführt wird als described früher ^10,11 mit geringfügigen Modifikationen. Der Endpunkt - Assay deckt einen großen Teil des Brucella intrazellulären Lebenszyklus außer dem Austritt und die Infektion von benachbarten Zellen. Um die Treffer charakterisieren in den Endpunkt-Assay identifiziert, ein modifiziertes Protokoll Faktoren identifizieren, in frühen Schritte der Infektion beteiligt ist, verwendet.

Ein Brucella abortus Stamm, der konstitutiv GFP exprimiert wird für den Endpunkt - Assay verwendet , in denen Bakterien erlaubt werden Zellen für zwei Tage zu infizieren. Während dieser Zeit geben Bakterienzellen, Verkehr auf die ER-abgeleiteten replikativen Nische, und in der peri-Kernraum replizieren. Die hohen GFP-Signal kann dann verwendet werden, um zuverlässig einzelner Zellen nachzuweisen, die replizierende Bakterien enthalten.

Brucella Eintrag in einem Hochdurchsatz - Assay zu untersuchen, ist es wichtig , zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden zu können. Die hier vorgestellte Methode circumvents Differential-Antikörper-Färbung von intra- und extrazellulären Bakterien. Es basiert auf einem Brucella - Stamm zugrunde , ein Tetracyclin-induzierbaren GFP in Kombination mit konstitutiver Expression von dsRed auszudrücken. Das Vorhandensein eines konstitutiven dsRed Marker ermöglicht die Identifizierung aller Bakterien, die in der Probe vorhanden sind. GFP-Expression wird durch die Zugabe des nicht-toxischen Tetracyclin analog Anhydrotetracyclin (ATC) gleichzeitig mit der Inaktivierung von extrazellulären Bakterien durch Gentamicin (Gm) induziert. Während die Zelle undurchlässige Antibiotikum Gm extrazelluläre Bakterien tötet, kann AtC die Wirtszelle eindringen und die GFP-Expression selektiv in intrazellulären Bakterien induzieren. Dieser duale Reporter ermöglicht die robuste Trennung einzelner intrazelluläre Bakterien (GFP und dsRed Signal) von extrazellulären Bakterien (nur dsRed Signal) mit Weitfeldmikroskopie. Um nachweisbare GFP - Expression durch intrazelluläre Brucella zu erreichen haben wir festgestellt , dass 4 h Induktion durch atc führt zu einer ReliLage Signal. Ähnliche Induktionsschemata selektiv GFP in intrazellulären Bakterien exprimieren verwendet wurde zuvor intrazelluläre Shigella ¹² zu studieren.

Protokoll

Hinweis: Alle Arbeiten mit Live - Brucella abortus - Stämme müssen in einem Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) Labor durchgeführt werden , unter Berücksichtigung aller erforderlichen Vorschriften und Sicherheitsvorkehrungen.

1. Herstellung von Screening-Platten und Anzucht von Bakterien und Zellen

1. Herstellung von Starterkulturen Brucella abortus
   1. Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) von -80 ° C Milch stock auf einem CASO - Agar (TSA) Platte , die 50 ug / ml Kanamycin (TSA / Km). Inkubieren Platte für 3-4 Tage bei 37 ° C. Verwenden Stamm Brucella abortus 2308 pJC43 (APHT :: GFP) ¹³ für den Endpunkt - Assay und Stamm Brucella abortus pAC042.08 (APHT :: dsRed, tetO :: tetR-GFP) für den Eintrag Test.
      Hinweis: Die glatte Lipopolysaccharide (LPS) von Brucella abortus ist ein wichtiger Virulenzdeterminante aber rauhen Mutanten bei relativ hohen Frequenzen ¹⁴ auftreten können. We so empfehlen den Status der Kulturstamm testen, bevor mit diesem Experiment zu starten.
   2. Restreak Bakterien auf vier TSA / Km-Platten die volle Platte Abdeckung und Inkubation für 2-3 Tage bei 37 ° C.
   3. Mit Hilfe einer Einweg-Kunststoff-Schleife, die Übertragung und resuspendieren Bakterien von den TSA / Km-Platten in 10 ml 10% autoklaviert Magermilch. Stellen Sie sicher, dass die Bakterien gut resuspendiert, um konsistente Bakterienkonzentrationen in allen Starterkulturen zu gewährleisten.
   4. Aliquot 250 ul der Bakteriensuspension in 2 ml Schraubdeckel Rohre und gefrier bei -80 ° C.
   5. Tauen Sie einen aliquoten Teil der Starterkultur und Transfer 25 ul, 50 ul und 100 ul der Bakterienstarterkultur 250 ml zu trennen Schraubverschlussflaschen mit 50 ml CASO-Bouillon (TSB), enthaltend 50 ug / ml Kanamycin (TSB / Km) . Verschließen Sie die Flaschen mit Parafilm.
   6. Inkubiere die Flaschen über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 100 Upm und 37 ° C.
   7. Messung der optischen Dichte bei 600 Nm (OD ₆₀₀₎ , um das Volumen der Starterkultur zu bestimmen , die erforderlich eine OD ₆₀₀ = 0,8-1,1 nach über Nacht Kultur zu erreichen.
2. Herstellung von HeLa-Zellen
   1. Wachsen HeLa - Zellen in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) (DMEM / 10% FCS) in einem 37 ° C feuchten Inkubator mit 5% CO ₂ Zellen auf 80% Konfluenz wachsen.
3. Bereiten Sie die Abschirmplatten mit siRNAs.
   1. Verdünnte siRNAs in RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,32 uM. Jeweils 5 ul / Vertiefung zu schwarz klar Vertiefungen mit flachem Boden 384-Well-Platten.
      1. Verwenden Sie Spalten 1, 2, 23 und 24 für Standardkontrollen. Für Negativkontrollen verwenden nicht-Targeting-siRNA (Rührei) und Mock Brunnen ohne siRNAs (Transfektionsreagenz nur). Für die Transfektion steuert, verwenden Sie eine siRNA, die den Zelltod (KIF11) sowie positive Kontrollen bekannter Wirtsfaktoren beteiligt in Brucella - Infektion induziert (zB ARPC3,eine Komponente des Komplexes Arp2 / 3 in Aktin-Polymerisation beteiligt sind). Übertragen im Handel erhältlichen siRNA-Bibliotheken oder benutzerdefinierte siRNAs auf die restlichen Brunnen.
      2. Dichtungsplatten mit abziehbaren Aluminiumfolien. Store-Platten bei -20 ° C.
         Hinweis: Die Platten können für mindestens 6 Monate und bis Jahre bei -20 ° C gelagert werden, je nach den Empfehlungen des Herstellers.

2. Reverse-siRNA-Transfektion

1. Auftauen einen schwarzen 384-Well-Platte durch Zentrifugation bei 300 xg für 20 min bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Dies wird bringen die ganze Flüssigkeit, die mit dem Deckel oder an der Seite der Vertiefungen anhaften könnten.
2. Bereiten Sie die Transfektionsmedium durch Verdünnen des Transfektionsreagenz 1: 200 in DMEM ohne FCS bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Transfektionsmediums nicht mehr als 20 Minuten vor der Verwendung. mischen Sie vorsichtig die Lösung vor dem Gebrauch.
3. In 25 ul Transfektionsmediums zu jedem Well ein Reagens Dispenserund die Lösungen mischen, indem die Platte hin und her zu bewegen.
4. Inkubieren der Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur siRNA / Transfektionsreagenz Komplexbildung zu ermöglichen.
5. HeLa - Zellen In der Zwischenzeit bereiten , indem sie die subkonfluenten Zellen einer 75 cm ² Kolben einmal mit 2,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA in PBS waschen (Trypsin).
6. 1,5 ml frisches Trypsin und übertragen den Kolben auf 37 ° C für 2-3 Minuten, bis die Zellen abrunden.
7. Resuspendieren der Zellen in 10 ml vorgewärmten DMEM / 16% FCS.
8. Zählen von Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler und bereiten eine Zellsuspension von 10.000 Zellen / ml in DMEM / 16% FCS.
9. In 50 ul Zellsuspension in jede Vertiefung ein Reagenz Dispenser / Vertiefung in 500 Zellen führt.
10. Bewegen, um die Platte hin und her eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erreichen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 5-10 min zu ermöglichen, dass die Zellen sich zu beruhigen.
11. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und Inkubation für 72 Stunden auf einer vorgewärmten AluminiumPlatte in einem 37 ° C feuchten Inkubator mit 5% CO _2.
    Hinweis: Die vorgewärmten Aluminiumplatte ermöglicht gleichmäßige Temperaturverteilung über den gesamten 384-Well-Platte.

3. Infektion und Fixierung

1. Einen Tag vor der Infektion, impfen die bestimmte Menge in 1.1.7 von B. abortus Starterkultur in 50 ml TSB / Km - Medium in einem 250 ml Schraubverschluss Flasche. Verschließen Sie die Flasche mit Parafilm und Bakterien wachsen über Nacht bei 37 ° C und 100 rpm auf einem Orbitalschüttler bis zu einer OD ₆₀₀ = 0,8-1,1.
2. Messung der OD ₆₀₀ der Bakterienkultur und bereiten die Infektionsmedium durch die Bakterienkultur in DMEM / 10% FCS verdünnt das gewünschte Multiplizität der Infektion (MOI) zu erreichen.
   Hinweis: Um eine Infektionsrate von 5-10% in HeLa-Zellen zu erhalten, eine MOI von 10.000 verwendet. Eine MOI Titrationskurve sollte für jeden Zelltyp zu erhalten optimalen Infektionsraten durchgeführt werden.
3. Tauschen Sie das Transfektionsmediums der 384-Well-Plattemit 50 ul des Infektionsmedium mit einem automatischen Plattenwäscher.
4. Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte bei 400 × g und 4 ° C für 20 min.
   Anmerkung: Dies hilft, den Infektionsprozess zu synchronisieren.
5. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und brüten sie auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte in einem 37 ° C feuchten Inkubator mit 5% CO ₂ für 4 Stunden.
6. Waschen Sie die Zellen mit DMEM / 10% FCS, die 100 ug / ml Gm extrazellulären Bakterien zu inaktivieren die automatisierte Plattenwäscher mit (arbeiten mit 200 ul / Vertiefung Überlauf Wasch).
   Hinweis: Während einer Überlaufwäsche, die automatisierte Plattenwäscher verzichtet gleichzeitig und ansaugt Medium.
7. Für den Eintrag Test waschen ein zweites Mal Zellen mit DMEM / 10% FCS, die 100 ug / ml Gm und 100 ng / ml AtC die automatisierte Plattenwäscher mit (arbeiten mit 200 ul / Vertiefung Überlauf Wasch).
8. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und schicken Sie es an einem vorgewärmten Aluminiumplatte in der 37 ° C feuchten Inkubator mit 5% CO ₂ für eine andere40 Stunden oder 4 Stunden, für den Endpunkt-Assay und den Eintrag Test sind.
9. Zur Fixierung, waschen Sie die Vertiefungen mit PBS die automatisierte Plattenwäscher mit (arbeiten mit 200 ul / Vertiefung Überlauf Wasch).
10. Exchange-PBS mit 50 & mgr; l 3,7% Paraformaldehyd in 0,2 M HEPES bei pH 7,4 (PFA) unter Verwendung der automatischen Plattenwäscher.
    Hinweis: Achtung: PFA durch Einatmen giftig ist, in Berührung mit der Haut und beim Verschlucken.
11. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur.
12. Tauschen Sie das Fixierungsmedium mit 50 & mgr; l PBS mit dem automatischen Plattenwäscher. Anmerkung: Die Proben sind nun bereit, von der BSL3 herausgenommen werden, wenn nötig.
    Achtung: Die Entfernung von jeder Probe aus einer BSL3 Anlage unterliegt Risikobewertung und Validierung des Verfahrens und richtet sich nach den geltenden Vorschriften für die biologische Sicherheit.

4. Die Färbung

1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 50 ul PBS.
2. Permeabilisieren Zellen in 50 & mgr; l 0,1% Triton-X-100 in PBS für 10 min.
3. Wash Zellen dreimal mit PBS. Geben Sie 20 & mgr; l PBS, enthaltend 1 & mgr; g / ml DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Wasche die Zellen dreimal in PBS und schützen die Anfärbung von Licht mit einer Aluminiumfolie.

5. Imaging

1. Stellen Sie die automatische Weitfeldmikroskop für die Bildaufnahme auf.
   Hinweis: Die Einstellungen für ein Molecular Device Imagexpress Mikroskop MetaXpress Software werden nachfolgend beschrieben. Alternative 2D-Weitfeldmikroskopie Geräte mit den entsprechenden Hardware-Spezifikationen und Imaging-Software (siehe Tabelle von Material / Ausrüstung für weitere Details) verwendet werden.
   1. Wählen 10X-Objektiv, Kamera Binning = 1, Verstärkung = 1.
   2. Wählen Sie das Plattenformat entsprechend dem 384-Well-Platte.
   3. Erwerben 9 Standorte pro Vertiefung.
   4. Verwenden Sie "Enable laserbasierten Fokus" und "Fokus auf Platte und gut Boden".
   5. Set "Zuerst gut" als Anfangs gut fürSuche nach der Probe und "Alle Standorte" für Website-Autofokus.
   6. Verwenden Sie den DAPI-Kanal manuell einstellen Z-Offset für Fokus.
   7. wählen Sie manuell die Z-Offset von DAPI für alle anderen Kanäle.
   8. Zur manuellen Korrektur für alle Kanäle, die Belichtungszeit einen weiten Dynamikbereich mit geringer Überbelichtung zu gewährleisten.
      1. Erwerben Sie ein Bild von einem repräsentativen Standort mit dem Auto-Belichtungsfunktion. Verwenden Sie diese Belichtungszeit Bild 3-5 Standorten in der Platte und eine manuelle Einstellung der Belichtungszeit, bis die hellsten Pixel erreichen ~ 80% der maximalen Helligkeit über alle Standorte.
   9. Bild die volle Platte die DAPI und GFP-Kanäle für den Endpunkt-Assay verwendet wird. Für den Eintrag Test des RFP-Kanal zusätzlich wählen.

6. Automatische Bildanalyse

Hinweis: CellProfiler 2 ¹⁵ als Bildanalyse - Software zur Segmentierung zellulären und Bakterien Objekte eingesetzt und measur automatisierte performements innerhalb der identifizierten Objekte. Die Software liefert die Bildanalyse-Algorithmen in einzelnen Modulen, die in eine Rohrleitung verbunden werden können, die die Module nacheinander auf alle Bilder ausgeführt wird, um automatisch eine spezifische Bildanalyseaufgabe auszuführen. Um das Protokoll zu folgen, installieren CellProfiler 2.1.1 oder eine neuere Version. Dann laden Sie die bereitgestellte Pipeline und folgen Sie den nachstehenden Anweisungen die erforderlichen Parameter innerhalb der Module anzupassen. Eine Beschreibung der einzelnen Module aller Rohrleitungen können in der Zusatzdateien zu finden.

Anmerkung: Zwei separate Rohrleitungen werden für jeden Test verwendet. Die erste Pipeline berechnet eine Schattierungsmodell, das von der zweiten Pipeline verwendet wird, um Bilder vor der Analyse zu korrigieren. Shading-Korrektur wird auf die Bilder angewendet, um die Effekte eines inhomogenen Lichtpfad von dem Mikroskop zu reduzieren. Die Berechnung der Schattierungsmodell in der ersten Pipeline ist ein langwieriger Prozess, aber die Ergebnisse werden mit höherer Genauigkeit sein.

1. Endpunkttest
   1. Berechnen Sie die Schattierungsmodell
      1. Rufen Sie das Menü "Datei", wählen Sie "Import" → "Pipeline aus Datei ...", und wählen Sie die bereitgestellte Pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Auf die Frage, ob die Legacy-Pipeline zu konvertieren, zu beantworten "konvertieren Sie nicht".
      2. Gehen Sie auf "Output" → "Ansicht Ausgabeeinstellungen" und wählen Sie einen Eingangsordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die daraus resultierenden Verschattungs Modelle.
      3. In Modul (1) "Loadimages", stellen Sie den Namen des "Text, dass diese Bilder gemeinsam haben", um die Bildnamen übereinstimmen.
      4. Stellen Sie sicher, dass keines der Module deren Display vor der vollständigen Analyse läuft durch unchecking alle Augen Symbole neben den Modulen. Hinweis: Dies verringert erheblich Rechenressourcen erforderlich ist, während die Pipeline verarbeitet.
      5. Drücken Sie auf "Analysieren von Bildern" die Berechnung des Schattierungsmodell zu starten.
   2. Führen Sie Bildanalyse
      1. Rufen Sie das Menü "Datei", wählen Sie "Import" → "Pipeline aus Datei ...", und wählen Sie die bereitgestellte Pipeline "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Auf die Frage, ob die Legacy-Pipeline zu konvertieren, zu beantworten "konvertieren Sie nicht".
      2. Gehen Sie auf "Output" → "Ansicht Ausgabeeinstellungen" und wählen Sie einen Eingangsordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die resultierende Tabelle.
      3. In Modul (1) "Loadimages", stellen Sie den Namen des "Text, dass diese Bilder gemeinsam haben", um die Bildnamen übereinstimmen.
      4. In Modul (2) "LoadSingleImage", legen Sie die Abschattung Modelle unter 6.1.1 berechnet, indem die Standortwahl und die Dateinamen der beiden Schattierungsmodelle.
      5. In Module (4) - (5) "ImageMath", stellen Sie den Parameter "das erste Bild Multiplizieren von" die Bit-Tiefe der Mikroskopkamera entspricht. Für 8 und 16 bitBilder den Parameter auf "1.0", für 12-Bit-Bilder den Parameter auf "16.0" gesetzt.
      6. In Modul (9) "ImageMath" stellen Sie den Parameter "das zweite Bild Multiplizieren von" auf einen Wert (Start mit 0,25), die die Brucella - Signal in der DAPI - Färbung unterdrücken , ohne die Nuclei zu unterdrücken.
         1. Klicken Sie auf "Start Testmodus", aktivieren Sie dann das Pausensymbol und die Anzeigefunktion für das Modul (9), indem Sie auf den entsprechenden Symbolen des Moduls klicken.
            Hinweis: Die Pause-Symbol in gelb erscheint, während das Auge Symbol ein offenes Auge zeigen, wenn aktiviert.
         2. Klicken Sie auf "Ausführen", um die Analyse zu laufen bis zum Modul (9) mit dem aktiven Pausensymbol. Um zu testen, die Werte für das Modul, drücken Sie "Step".
         3. Rechtsklick auf das neu geöffnete Bild und stellen Sie "Bildkontrast" auf "Log normalisiert". Schritt zurück wiederholt zu Modul (9), stellen Sie den Parameter "Multiplizieren Sie das zweite Bild durch", und Schritt über ter Modul wieder, bis die Brucella Signal vollständig , während unterdrückt wird , an die gleichzeitig schwarzen Flächen , die über Subtraktion zeigen werden im Ergebnisbild minimiert.
      7. In Modul (10) "IdentifyPrimaryObjects", den Parameter "Untere Grenze auf Schwelle" hoch genug (Start bei Null), so dass Keime segmentiert und Hintergrund ignoriert.
         1. Um ein gutes Preis-Leistungs-Modul (10), Schritt über das Modul identifizieren und das Eingangsbild anzuzeigen, wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert.
         2. Rechtsklick auf das Eingangsbild und das Histogramm angezeigt werden soll.
            Hinweis: Der Peak des Histogramms typischerweise Hintergrund angibt.
         3. Ausgehend von der Hintergrundintensität erhöhen, um die Parameter, bis eine gute Segmentierung von Zellkernen erreicht wird als in dem Ausgabebild angezeigt.
            Hinweis: Die Einstellung der Schwelle höher als Hintergrundintensität für Baulücken besonders wichtig ist.
      8. In-Modul (15)4; FILTERMinimalWert "", die Parameter einstellen " , so dass Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella im Kern gehalten werden, und alle anderen werden herausgefiltert In diesem Schritt ignorieren Brucella außerhalb des Zellkerns..
         1. Um einen guten Wert, Schritt über das Modul identifizieren und das Ausgangsbild angezeigt werden wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert. Beginnen bei Null, die alle Zellen identifiziert als infiziert und erhöhen den Wert von kleinen Schritten , bis nur Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella am Kern gehalten werden.
      9. In Modul (16) "FILTER", stellen Sie den Parameter "Minimalwert" , so dass die Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella bei Perinucleus gehalten werden, und alle anderen Zellen werden herausgefiltert. Verwenden Sie einen ähnlichen Ansatz wie im vorherigen Modul.
      10. In Modul (17) "FILTER", stellen Sie den Parameter "Minimalwert" , so dass die Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella an der Voronoi Zellkörper gehalten werden, und alle anderen Zellen werden abfiltriert. Verwenden Sie einen ähnlichen Ansatz wie im vorherigen Modul.
          Hinweis: Der Voronoi Zellkörper eine radiale Ausdehnung des Kerns ohne Überlappung von 25 Pixeln Voronoi Zellkörper mit benachbarten.
      11. Verlassen Sie den Testmodus und stellen Sie sicher, dass keines der Module zeigen ihre Anzeige vor der vollständigen Analyse läuft durch unchecking alle Augen Symbole neben den Modulen.
          Hinweis: Dies verringert erheblich Rechenressourcen erforderlich ist, während die Pipeline verarbeitet.
      12. Drücken Sie auf "Analysieren Bilder", um die Analyse zu starten.
      13. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die resultierende PNG-Bilder sowie das Blatt CSV, um sicherzustellen, dass die Analyse zuverlässig in die ganze Platte gearbeitet.
2. Eintrag Assay
   1. Berechnen Sie die Schattierungsmodell
      1. Rufen Sie das Menü "Datei", wählen Sie "Import" → "Pipeline aus Datei ...", und wählen Sie die zur Verfügung stellend Pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Auf die Frage, ob die Legacy-Pipeline zu konvertieren, zu beantworten "konvertieren Sie nicht".
      2. Gehen Sie auf "Output" → "Ansicht Ausgabeeinstellungen" und wählen Sie einen Eingangsordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die daraus resultierenden Verschattungs Modelle.
      3. In Modul (1) "Loadimages", stellen Sie den Namen des "Text, dass diese Bilder gemeinsam haben", um die Bildnamen übereinstimmen.
      4. Stellen Sie sicher, dass keines der Module deren Display vor der vollständigen Analyse läuft durch unchecking alle Augen Symbole neben den Modulen.
         Hinweis: Dies verringert erheblich Rechenressourcen erforderlich ist, während die Pipeline verarbeitet.
      5. Drücken Sie auf "Analysieren von Bildern" die Berechnung des Schattierungsmodell zu starten.
   2. Führen Sie Bildanalyse
      1. Rufen Sie das Menü "Datei", wählen Sie "Import" → "Pipeline aus Datei ...", und wählen Sie die provided Pipeline "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Auf die Frage, ob die Legacy-Pipeline zu konvertieren, zu beantworten "konvertieren Sie nicht".
      2. Gehen Sie auf "Output" → "Ansicht Ausgabeeinstellungen" und wählen Sie einen Eingangsordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die resultierende Tabelle.
      3. In Modul (1) "Loadimages", stellen Sie den Namen des "Text, dass diese Bilder gemeinsam haben", um die Bildnamen übereinstimmen.
      4. In Modul (2) "LoadSingleImage", legen Sie die Abschattung Modelle unter 6.2.1 berechnet, indem die Standortwahl und die Dateinamen der beiden Schattierungsmodelle.
      5. In Module (4) - (5) "ImageMath", stellen Sie den Parameter "das erste Bild Multiplizieren von" die Bit-Tiefe der Mikroskopkamera entspricht. Für 8 und 16-Bit-Bilder den Parameter auf "1.0" für 12-Bit-Bilder den Parameter auf "16.0" gesetzt.
      6. In Modul (6) "IdentifyPrimaryObjects", den Parameter "Lower auf Schwelle "hoch genug gebunden, dass nur Kerne segmentiert und Hintergrund ignoriert.
         1. Um ein gutes Preis-Leistungs-Modul (6), Schritt über das Modul identifizieren und das Eingangsbild anzuzeigen, wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert.
         2. Rechtsklick auf das Eingangsbild und das Histogramm angezeigt werden soll.
            Hinweis: Der Peak des Histogramms typischerweise Hintergrund angibt.
         3. Ausgehend von der Hintergrundintensität erhöhen, um die Parameter, bis eine gute Segmentierung von Zellkernen erreicht wird als in dem Ausgabebild angezeigt.
            Hinweis: Die Einstellung der Schwellenwerte Hintergrund für Baulücken wichtig ist.
      7. In Modul (8) "IdentifyPrimaryObjects", den Parameter hoch genug "Untere Schwelle gebunden" , dass nur Brucella segmentiert und Hintergrund ignoriert.
         1. Um ein gutes Preis-Leistungs-Modul (8), Schritt über das Modul identifizieren und das Eingangsbild anzuzeigen, wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert.
         2. Rechtsklick auf das Eingangsbild und das Histogramm angezeigt werden soll.
            Hinweis: Der Peak des Histogramms typischerweise Hintergrund angibt.
         3. Ausgehend von der Hintergrundintensität erhöhen , um die Parameter , bis eine gute Segmentierung von Brucella wie im Ausgangsbild angezeigt erreicht wird.
            Hinweis: Die Einstellung der Schwellenwerte Hintergrund für Baulücken wichtig ist.
      8. In Modul (11) "FILTER", stellen Sie den Parameter "Minimalwert" , so dass Hintergrund und Artefakte werden herausgefiltert und nur sind Brucella Kolonien gehalten.
         1. Um einen guten Wert, Schritt über das Modul identifizieren und das Ausgangsbild angezeigt werden wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert. Beginnen Sie mit dem ausgewählten Wert in 6.2.2.7 und schrittweise erhöhen, bis nur Brucella Objekte gehalten werden.
      9. Verlassen Sie den Testmodus und stellen Sie sicher, dass keines der Module zeigen ihre Anzeige vor der vollständigen Analyse von unche läuftcking alle Augen Symbole neben den Modulen.
         Hinweis: Dies verringert erheblich Rechenressourcen erforderlich ist, während die Pipeline verarbeitet.
      10. Drücken Sie auf "Analysieren Bilder", um die Analyse zu starten.
      11. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die resultierende PNG-Bilder sowie das Blatt CSV, um sicherzustellen, dass die Analyse hat gut funktioniert auf der ganzen Platte.

7. Infektion Scoring

Hinweis: siRNAs, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen haben müssen mit Vorsicht betrachtet werden, da diese falsch positiven Entdeckungen fördern können. Eine veränderte Zellzahl wirkt sich auf die tatsächliche MOI und von essentiellen Genen Targeting können pleiotrope Effekte auf Erreger-Infektion haben. Während die unvollständige Abreicherung von siRNAs zur Untersuchung essentieller Gene ermöglicht, müssen solche Ziele durch alternative Methoden validiert werden (beispielsweise pharmazeutische Interferenz) ihrer Rolle als Wirtsfaktoren zu erhärtenwährend der Infektion.

1. Endpunkttest
   1. Öffnen Sie die CSV-Blatt erzeugt in Schritt 6.1.2.12 und berechnen eine pro Well Infektionsrate durch die Anzahl der infizierten Zellen Teilen (CellProfiler Anzeige: "Count_InfectedCells") durch die Gesamtzahl der Zellen (CellProfiler Anzeige: "CountNuclei"). Wenn mehrere Standorte pro Vertiefung abgebildet wurden, zusammenfassen zunächst alle Standorte für jede Vertiefung, um eine pro-gut Anzahl der infizierten Zellen aufzubauen und eine pro-gut Gesamtzahl der Zellen.
   2. Führen Z Scoring Normalisierung zur Berücksichtigung von Platte zu Platte Variationen, wenn die Platten ausreichend nicht getroffen siRNAs enthalten. Angenommen, eine ausreichende Anzahl von Nicht-Treffer siRNAs pro Platte, wenn die volle Bibliotheken gescreent werden.
      
2. Eintrag Assay
   1. Öffnen Sie die CSV-Blatt erzeugt in Schritt 6.2.2.10 und berechnen eine pro Well Infektionsrate durch die Anzahl der infizierten Zellen Teilen (CellProfiler Anzeige: "Count_InfectedCells ") durch die Gesamtzahl der Zellen (CellProfiler Anzeige:". CountNuclei ") Wenn mehrere Standorte pro Vertiefung abgebildet wurden, zusammenfassen zunächst alle Standorte für jede Vertiefung, eine pro-gut Anzahl der infizierten Zellen zu bauen und eine pro-Well Gesamtzahl der Zellen.
   2. Um die bakterielle Belastung von infizierten Zellen zu quantifizieren, schätzen die durchschnittliche Fläche durch intrazelluläre Bakterien pro infizierten Zelle besetzt. Zu diesem Zweck teilen die integrierte Fläche aller intrazellulären Bakterien Überlappung mit Zellen (CellProfiler Anzeige: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") durch die Anzahl der infizierten Zellen auf dieser Seite. Um Artefakte Konto, verwenden Sie den Median aller Seiten dieser Anzeige als auch Auslese.
      Hinweis: Wenn dieser Test als Follow - up - Test verwendet wird , eine große Anzahl von Genen , die in Brucella - Infektion enthält, nicht Z - Score Normalisierung anwenden. Stattdessen führen die Normalisierung mit mock Brunnen als Referenz für die zu berücksichtigen Platte zu Platte Variation.

Ergebnisse

1A zeigt ein Beispiel für die Bildanalyse verwendet , um automatisch infizierten Zellen in dem Endpunkt - Assay zu identifizieren. Kerne von HeLa-Zellen mit DAPI gefärbt wurden identifiziert, eine peri-Kern von 8 Pixeln Breite den Kern umgibt, und ein Voronoi Zellkörper durch Erweiterung des Kerns von 25 Pixeln berechnet. Da vor allem in der peri-Kernraum proliferieren Bakterien, ist die GFP Intensität in diesem Bereich der Zelle die stabilste Messung zwischen infizierte...

Diskussion

Bakterielle Krankheitserreger haben zahlreiche Strategien entwickelt, um eukaryotische Wirtszellen zu ihrem Vorteil zu manipulieren. Erreger, die akute Infektionen verursachen, zeigen oft eine schnelle Vermehrung, die mit einer erheblichen Beunruhigung des Immunsystems und einem Verlust der Lebensfähigkeit infizierter Zellen einhergeht. Im Gegensatz dazu gelingt es Brucella und anderen Krankheitserregern, chronische Infektionen zu verursachen, langfristige Wechselwirkungen innerhalb der Wirtszellen aufzubauen. D...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tryptische Soja-Agar (TSA)	BD	236950
Tryptische Sojabrühe (TSB)	Fluka	22092
Kanamycinsulfat	Sigma-Aldrich	60615
Magermilch
250 ml Flasche mit Schraubverschluss	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Fetal Kälberserum (FCS)	Gibco	10270	Hitzeinaktiviertes
Trypsin-EDTA (0,5%)	Gibco	15400-054	10x Stammlösung, verdünnt 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Zellzähler	Merck Milipore	PHCC20060	Alternative Zellzählgeräte können verwendet werden
Greiner CELLSTAR 384-Well-Platte	Sigma-Aldrich	M2062
Schälbare Aluminiumfolie	Costar	6570
Reagenzienspender: "Multidrop 384 Reagenzienspender"	Thermo Scientific	5840150	Es kann ein alternativer Reagenzienspender verwendet werden.
Transfektionsreagenz: "Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Automatisierter Plattenwascher: "Plattenwascher ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Dieser Plattenwascher enthält einen 16-Kanal-Verteiler, der für 384-Well-Platten geeignet ist. Es passt in eine Biosicherheitswerkbank und hat einen Deckel, der die Platte während des Waschens abdeckt, wodurch das Risiko der Aerosolproduktion verringert wird. Alternative Unterlegscheiben mit ähnlichen Eigenschaften könnten verwendet werden.
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
Anhydrotetracyclinhydrochlorid	Sigma-Aldrich	37919	100 μ g/ml Lösung in 100% Ethanol wird bei -20 &° gehalten; C lichtgeschützt in Aluminium-Folie
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Lösen in 0,2 M HEPES Puffer, pH 7,4. Bei -20 Grad lagern; C und am Tag vor Gebrauch frisch auftauen. Achtung, PFA ist giftig beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
Scrambled siRNA	Dharmacon	D-001810-10
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP)			Celli et al.12
pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)			Aufbau: pJC44 4 wurde mit EcoRI verdaut, gefolgt von der Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenov-Enzym und dem anschließenden Verdau mit SalI. TetR-GFP wurde aus pNF106 mit den Primern prAC090 und prAC092 amplifiziert. Nach dem Aufschluss mit SalI wurde das TetR-GFP-Produkt an den verdauten pJC44-Vektor ligiert.
Primer prAC090	Sigma-Aldrich		TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092	Sigma-Aldrich		TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Molecular Devices	IXM IMAGING MSCOPE	Automatisiertes zelluläres Bildgebungsmikroskop, ausgestattet mit einem präzisionsmotorisierten Z-Tisch. Alternative Systeme für die automatisierte Mikroskopie und alternative Komponenten für Hard- und Software, die unten aufgeführt sind, können eingesetzt werden.
Molekulare Hochgeschwindigkeits-Laser-Autofokus-Geräte		1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X Objektiv	Nikon	MRF00100	N.A 0,50, B.D 1,20 mm, DIC Prisma: 10X, Federbelastet
Photometrie CoolSNAP HQ Monochrome CCD-Kamera	Molekulare Bauelemente	1-2300-1060	1.392 x 1.040 Bildpixel, 6,45 x 6,45 und Mikro; Mio. Pixel, 12 Bit Digitalisierung
MetaXpress Software	Molekulare Bauelemente	9500-0100
LUI-Spectra-X-7	Lumencor	SPECTRA X V-XXX-YZ	Light Engine. Folgende Lichtquellen kommen zum Einsatz: violett (DAPI), cyan (GFP), grün/gelb (RFP)
Single Band Exciter für DAPI	Semrock	FF01-377/50-25
Single Band Emitter für DAPI	Semrock	FF02-447/60-25
Single Band Dichroic für DAPI	Semrock	FF409-DI03-25x36
Single Band Exciter für GFP	Semrock	FF02-472/30-25
Single Band Emitter für GFP	Semrock	FF01-520/35-25
Single Band Dichroic für GFP	Semrock	FF495-DI03-25x36
Single Band Exciter für RFP	Semrock	FF01-562/40-25
Single Band Emitter für RFP	Semrock	FF01-624/40-25
Single Band Dichroic für RFP	Semrock	FF593-DI03-25x36