In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Zusammenfassung

Eine Methode zur Etablierung eines in vitro Modells der Blut-Hirn-Schranke, die auf einer Co-Kultur von mikrovaskulären Endothelzellen und Astrozyten des Rattenhirns basiert, wird beschrieben und validiert. Dieses System erwies sich als ein valides Werkzeug, um die Wirkung der Nanoformulierung auf die Transbarriere-Permeation von fluoreszierenden Molekülen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns, die von Perizyten und Astrozyten-Endfüßen unterstützt werden, sind verantwortlich für die geringe Permeation großer hydrolöslicher Medikamente durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS), was zu Schwierigkeiten bei wirksamen pharmakologischen Therapien führt. In den letzten Jahren haben verschiedene Strategien zur Förderung des Gehirn-Targetings darauf abgezielt, die Wirkstoffabgabe und -aktivität an diesem Ort zu verbessern, einschließlich innovativer Nanosysteme für die Wirkstoffabgabe über die BHS. In diesem Zusammenhang bietet ein in vitro Ansatz, der auf einem vereinfachten zellulären Modell der BHS basiert, ein nützliches Werkzeug, um die Wirkung von Nanoformulierungen auf die trans-BHS-Permeation von Molekülen zu untersuchen. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Doppelschicht-BHS, bestehend aus co-kultivierten, kommerziell erhältlichen primären mikrovaskulären Endothelzellen des Rattenhirns, mikrovaskulären Endothelzellen und Astrozyten. Ein multiparametrischer Ansatz zur Validierung des Modells, der auf der Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands und der scheinbaren Permeabilität eines hochmolekularen Dextrans basiert, wird ebenfalls beschrieben. Als Proof of Concept für den Einsatz dieses BHS-Modells zur Untersuchung der Wirkung verschiedener Nanoformulierungen auf die Translokation fluoreszierender Moleküle durch die Barriere beschreiben wir die Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), das in Ferritin-Nanopartikel geladen ist. Die Fähigkeit von Ferritinen, die trans-BHS-Permeation von FITC zu verbessern, wurde durch Flussmessungen und konfokale Mikroskopieanalysen nachgewiesen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dies ein nützliches System zur Validierung von Nanosystemen für die Verabreichung von Medikamenten über die BHS ist.

Einleitung

Der Widerstand des Zentralnervensystems (ZNS) Erkrankungen (dh. Krebs, Epilepsie, Depression, Schizophrenie und HIV-assoziierte neurologische Störung) auf pharmakologische Therapien aufgrund der verschiedenen Mechanismen, einschließlich beschwerliche Arzneimittelpermeation über die Blut-Hirn - Schranke (BBB) . Die BBB ist die Grenze, die Gehirngewebe von den Substanzen isoliert im Blut zirkulieren. Innerhalb dieser Barriere eine Schicht aus Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs), von Perizyten und Astrozyten Endfüßen unterstützt wird , ist verantwortlich für die hohe Selektivität der BBB zu diesen wasserlöslichen Arzneimittel mit einem Molekulargewicht....

Protokoll

1. Festlegung der BBB-Modell

Hinweis: Für die BHS-Modell schaffen wir schlagen vor, im Handel erhältliche primäre RBMECs und RCAs verwenden. Alle Schritte müssen mit sterilen Reagenzien und Disposables durchgeführt werden, in einer Laminarströmungsabzug behandelt.

1. Zellkultur
   1. Coat Zellkulturflaschen mit Poly-L-lysin 100 ug / ml (1 h bei RT) oder Fibronektin 50 ug / ml (1 h bei 37 ° C) die Anlagerung von RCAs oder RBMECs zu fördern, respectively. Dann thaw 1 x 10 ⁶ RCAs und 5 x 10 ⁵ RBMECs in Endothelzell-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 1% endothelialen Zellwachstumsergänzungsmittel und 1% Penicillin / Strep....

Ergebnisse

Während der Einrichtung der BBB-Modell, die Zellanheftung und Wachstum auf der Einsätze können mit einem Lichtmikroskop durch die transparente Natur der PET-Membranen werden überwacht. RCAs, bei einer Dichte von 35.000 Zellen / cm ^2, befestigen effizient an der Unterseite des Einsatzes nach 4 h Inkubation bei RT (2A) und wachsen , um die Membranoberfläche in 3 Tagen zu bedecken, eine spindelförmige Morphologie wobei (2B). RBMECs, bei einer Dic.......

Diskussion

Die in vitro hier beschriebene Verfahren stellt einen nützlichen Ansatz validierten die trans-BBB Lieferung von fluoreszierenden Molekülen auf Nanoformulierung mit Nanopartikeln zu studieren. Hier verwenden wir FNN, die einen guten Kandidaten stellt die Verlagerung von Fracht-Moleküle über die BBB zu studieren. Fnn ist das Gold nanovector für trans-BBB Lieferung von Arzneimittel / Mittel angesehen, da sie spezifisch durch die TfR1 Rezeptor erkannt wird, die auf der luminalen Membran BMECs exprimiert und vermitt.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikrovaskuläre Endothelzellen des Rattengehirns	Innoprot	P10308	isoliert aus Hirngewebe der Sprague-Dawley-Ratte, kryokonserviert bei der ersten Passage und gelieferte
gefrorene kortikale Astrozyten	Innoprot	P10202	wurde aus 2 Tagen Hirngewebe von Ratten isoliert, bei der ersten Passage kryokonserviert und gefroren geliefert.
Endothelzellmedium Kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) und fötales Bovin-Serum (25 ml), Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen (5 ml) und Penicillin/Streptomycin (5 ml). Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch und Schutz vor Licht
Trypsin-EDTA ohne Phenolrot	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch
Fluorescein isothiocyanat-dextran 40.000	Sigma	FD40S	schützen vor leichtem
Paraformaldehyd	Sigma	158127	Diluition in der chemischen Haube
Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung ohne Ca und Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton  X-100	Sigma	T8787
Rinderserumalbumin	Sigma	A7906
Serum für Ziegen	EuroClone	ECS0200D
monoklonaler Maus-Anti-Von-Willebrand-Faktor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-konjugierter Antikörper gegen Maus-IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	schützt vor Licht
DAPI (4' ,6-Diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	schützt vor Licht
ProLong Gold Antifade Eindeckmittel	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-Lysin Hydrobromid	Sigma	P1274	die gleiche Lösung kann mehrmals verwendet werden
Fibronektin aus Rinderplasma	Sigma	F1141	die gleiche Lösung kann mehrmals verwendet werden
Polyethylenterephthalat (PET) setzt	Falcon	F3090	Transparente Membranen aus Polyethylenterephthalat (PET) ein; Oberfläche: 4,2 cm2; Porengröße 0,4 & Mikro; m/Oberfläche
T75 Primo TC Kolben	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC Kolben	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithel Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Licht-/Fluoreszenzmikroskop mit Kamera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Kameramodul	Inverses Mikroskop für lebende Zellen mit Kamera
Konfokalmikroskop	Leica Microsystems	TCS SPE
Spektrofluorimeter	Jasco	FP-8000