Abstract
Singolo tracing clonale e analisi a livello intero cuore può determinare il comportamento delle cellule progenitrici cardiache e differenziazione durante lo sviluppo cardiaco, e consentire lo studio delle basi cellulari e molecolari della morfogenesi cardiaca normale e anormale. Recenti tecnologie emergenti di retrospettive singole analisi clonali rendono lo studio della morfogenesi cardiaca a risoluzione singola cella fattibile. Tuttavia, l'opacità dei tessuti e la dispersione della luce del cuore come la profondità delle immagini è aumentata Hinder di imaging intero-cuore con una risoluzione di singola cellula. Per superare questi ostacoli, un sistema di compensazione intero embrione che può rendere il cuore altamente trasparente sia per l'illuminazione e la rilevazione devono essere sviluppati. Fortunatamente, negli ultimi anni, sono stati segnalati molti metodologie per sistemi di compensazione intero organismo, come la chiarezza, la Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cubi, DBE, BABB e PACT. Questo laboratorio è interessato ai meccanismi cellulari e molecolari della cartaIAC morfogenesi. Recentemente, abbiamo stabilito singola linea cellulare tracciare tramite il ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti alle cellule di etichette scarsamente durante lo sviluppo cardiaco. Abbiamo adattato diverse metodologie embrio-clearing interi compresi Sca le e cubi (chiare, senza ostacoli cocktail di imaging cerebrale e analisi computazionale) per cancellare l'embrione in combinazione con tutto il monte colorazione di immagine singoli cloni all'interno del cuore. Il cuore è stato ripreso con successo ad una risoluzione di singola cellula. Abbiamo trovato che le Sca può cancellare il cuore embrionale, ma non può efficacemente eliminare cuore postnatale, mentre CUBIC può cancellare cuore postnatale, ma danneggia il cuore embrionale sciogliendo il tessuto. I metodi qui descritti permetteranno lo studio della funzione genica in una sola risoluzione clone durante morfogenesi cardiaca, che, a sua volta, può rivelare basi cellulari e molecolari dei difetti cardiaci congeniti.
Introduction
Morfogenesi cardiaca è un evento sequenziale che richiede l'organizzazione spaziotemporale di quattro diversi tipi di cellule progenitrici cardiache in settori distinti del cuore, e richiede anche più reti di regolazione genetica di orchestrare questo processo per formare il 1,2 cardiaca funzionale. Cardiac specificazione, differenziazione, patterning, e la maturazione della camera sono regolati da fattori di trascrizione cardiogeno 3. Mutazione genetica o aberrazione posttranscriptional di questi fattori nelle cellule progenitrici cardiache possono provocare sia letalità embrionale o difetti cardiaci congeniti (CHD) 4. Lo studio della morfogenesi cardiaca richiede una comprensione dei dettagli inerenti strutturali in tre dimensioni (3D) e singola etichetta lignaggio cellule progenitrici cardiache tracciamento durante lo sviluppo cardiaco promuoverà la comprensione della morfogenesi cardiaca. Un certo numero di sezione metodi basati tomografia ad alta risoluzione sono stati sviluppati in the negli ultimi decenni a immagine Struttura organo 5,6; tuttavia, questi metodi richiedono costosi, strumenti specializzati, il lavoro esteso, e la mancanza di organizzazione strutturale dettagliata alla risoluzione di singola cellula nel volumetrico finale ricostruita immagine 7,8.
L'imaging volumetrico 3D a livello di singola cellula fornisce un mezzo per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici e comportamento cellulare in vivo 7. Tuttavia, la luce tessuto dispersione rimane l'ostacolo principale per l'imaging cellule e strutture in 3D in profondità all'interno del cuore intatto. I lipidi sono una fonte importante di diffusione della luce, e la rimozione dei lipidi e / o regolazione della differenza di indice di rifrazione tra i lipidi e le aree circostanti sono potenziali approcci per aumentare la trasparenza del tessuto 8. Negli ultimi anni, un certo numero di metodi di compensazione del tessuto sono stati sviluppati, che riducono l'opacità dei tessuti e diffusione della luce, come BABB (alcool benzilico e benzile benzoate miscela) e DBE (tetraidrofurano e dibenzylether); ma in questi metodi, fluorescenza quenching rimane un problema 8-10. Il solvente basa metodi idrofili, come SeeDB (fruttosio / thioglycerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), conserva segnali fluorescenti, ma non rende l'intero organo trasparente 7,8,11. In confronto, il metodo tessuto-clearing CLARITY rende l'organo trasparente, ma richiede un dispositivo per elettroforesi specializzata per rimuovere i lipidi 8,12, come fa PACT (tecnica passiva chiarezza), che richiede anche idrogel incorporamento 7,13. Per informazioni dettagliate su tutti i metodi di tessuto-compensazione disponibili, fare riferimento alla Tabella 1 a Richardson e Lichtman, et al. 7.
Nel 2011, Hama et al. Casualmente scoperto una miscela idrofila 'Sca Le' (urea, glicerolo e Triton X-100 miscela) che rende il cervello di topo ed embrione traspaent mentre completamente preservando segnali fluorescenti da cloni etichettati 14. Questo permette l'imaging del cervello intatto ad una profondità di diversi millimetri e ricostruzione su larga scala di popolazioni neuronali e proiezioni a una risoluzione subcellulare. Susaki et al. ulteriormente migliorata Sca Le aggiungendo amminoalcoli e sviluppato il 'cubica (chiare, senza ostacoli cocktail di brain imaging e analisi computazionale) Metodo tessuto compensazione, che ha aumentato la solubilizzazione fosfolipide, riduzione dei tempi di compensazione, e ha permesso per l'imaging a fluorescenza multicolore 8. Nel presente studio, approfittando della Sca Le e Cubic tecniche del tessuto di compensazione e alta risoluzione sezionamento ottico 3D, i singoli cloni all'interno del cuore durante cardiogenesis sono stati rintracciati utilizzando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, NFATc1-Cre 19, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linee di mouse. La combinazione del metodo tutto il monte colorazione (WMS) sviluppato in precedenza 21,22 con metodi di compensazione tessuto ulteriormente consentiti per la colorazione di altre proteine in cloni etichettati e per lo studio del loro comportamento in un contesto volumetrica 3D. La combinazione di compensazione tessuti e WMS permette una migliore comprensione dei ruoli dei diversi geni e proteine durante lo sviluppo cardiaco, e l'eziologia di difetti cardiaci congeniti. Questo protocollo può essere applicato per studiare altre differenziazione di cellule progenitrici, comportamento cellulare, ed eventi morfogenesi organo durante lo sviluppo.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali (IACUC) a Albany Medical College ed eseguite secondo la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione della soluzione
NOTA: Il Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linee di topo sono state acquistate sul mercato cTnT-Cre 18 è stato un dono dal Dott Jiao presso l'Università di Alabama NFATc1-Cre.. era un dono di Dr. Bin Zhou all'Albert Einstein college of Medicine 19. I topi sono stati sacrificati per inalazione di anidride carbonica in un locale chiuso per almeno 60 secondi seguiti da mezzi fisici di verifica morte per toracotomia bilaterale, decapitazione o dislocazione cervicale.
- Preparare Tamoxifen. Sciogliere 10 mg di tamoxifene in 10 ml di oi semi di girasolel. Una volta che si è completamente sciolto, aliquotare e conservare a -20 ° C.
- Preparare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Sciogliere Na 2 HPO 4 (1,41,96 mila g), KH 2 PO 4 (0,24,496 mila g), NaCl (8,0669 g) e KCl (0,20,129 mila g) in 1 L di acqua distillata e regolare il pH a 7,4.
- Preparare PBST: 0.1% Tween-20 soluzione in PBS sciogliendo 100 ml di Tween-20 in 100 ml di PBS.
- Preparare tampone di bloccaggio. Rendere 3% di siero albumina bovina (BSA) soluzione bloccante sciogliendo 3 g di BSA in 100 ml di PBST contenente 0,2% Tween-20.
- Preparare CUBIC-1 (reattivo 1). Mescolare 25% in peso di urea, 25% in peso di N, N, N ', N'-tetrakis etilendiammina (2-idrossipropil) e il 15% in peso di Triton X-100 in dH 2 O.
- Preparare CUBIC-2 (reattivo 2). Mescolare 50 wt% di saccarosio, 25% in peso di urea, 10% in peso di 2, 2 ', 2' '- nitrilotrietanolo e lo 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O.
- Preparare Sca le A2: 4 M urea, 10% w / v di glicerolo e 0,1% w / v Triton X-100 in DH 2 O. Regolare il pH a 7,7.
- Preparare Sca le B4: 8 M urea e 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Regolare il pH a 8,7.
- Preparare Sca le 70: 4 M urea, 70% w / v di glicerolo e 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O.
2. Tamoxifen Induzione, isolamento degli embrioni e la fissazione
- Tamoxifene Induzione e isolamento Embryo
- Utilizzando un protocollo sondino ricurvo approvato (ACUP 13-12.007), sonda gastrica i topi di sesso femminile R26Cre ERT2 Confetti (collegato da R26Cre ERT2 topi maschi) con 10 mg / g di Tamoxifen al giorno embrionale di sviluppo E7.75 33. Al giorno embrionale 9,5 (E9.5) o E10.5, eutanasia i topi femmina con CO 2 e dislocazione cervicale.
- Dopo la verifica della morte del mouse (vedi Sezione 1 Nota), aprire il mouse cavità addominale con le forbici e sezionare il corno uterino, rimuovere gli strati di tubo uterino con l'aiuto di forbici e pinzette, e reaffittare gli embrioni dal 23,24 tuba uterina.
- Trasferire gli embrioni di una capsula di Petri contenente PBS (pH 7,4). Sotto il microscopio da dissezione, rimuovere gli strati non-embrionali (chorion, sacco vitellino e amnion) con l'aiuto di una pinzetta.
- Utilizzando le pinzette e forbici, raccogliere i campioni femminili del mouse e della coda degli embrioni per la genotipizzazione come riportato in precedenza 22. Usando una pipetta di plastica, trasferire ogni embrione in un pozzetto di una piastra ben 48 contenente 1 ml di PBS 1x.
- Sotto un microscopio a fluorescenza, identificare le GFP / RFP / CFP embrioni positivi tramite un microscopio invertito con una macchina fotografica. Sbucciare via il pericardio con una pinzetta e ruotare il cuore / embrione con l'aiuto di pinzette ricurve per determinare il numero di cloni fluorescenti su entrambi i lati del cuore con i filtri GFP / RFP / CFP. Non sono necessari tagli.
- Dopo aver identificato GFP / RFP / CFP embrioni positivi, lavare rapidamente gli embrioni per due volte (2 min ciascuna) con PBS 1x in the 48 ben piastra su un agitatore a temperatura ambiente (RT). Questo rimuoverà il sangue in eccesso.
- Fissare l'embrione / cuore embrionale utilizzando 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente. Il tempo di fissazione dipende dall'età e del tessuto dimensioni embrionale. Per E9.5 fissare l'embrione per 2 ore a temperatura ambiente. Gli embrioni fase embrionale fine richiedono un tempo più lungo di fissazione, che può anche essere prolungata fino a 24 ore per il cuore postnatale.
ATTENZIONE: Paraformaldeide è tossico, evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. - Dopo la fissazione, lavare l'embrione / cuore nel 48 ben piatto due volte (10 minuti ciascuno) con 1x PBS su un agitatore a temperatura ambiente. Questo rimuove l'eccesso di PFA dall'embrione / cuore. Gli embrioni vengono poi ulteriormente trattati per tutto il monte di colorazione e di compensazione dei tessuti.
3. monte intero colorazione
NOTA: Dopo PFA fissaggio l'embrione / cuore è sottoposto a tutto il monte colorazione come segue.
- Permeabilize l'embrione / cuore in un 48 ben piastra con 1 ml di 0,1% PBST per 2 ore su piastra agitatore a RT.
- A seguito di permeabilizzazione, immergere l'embrione / cuore in 1 ml di tampone di bloccaggio, per 2 ore o durante la notte su un agitatore a 4 ° C.
- Immergere l'embrione / cuore al endoteliali cellule-specifiche anticorpi PECAM (CD31), diluito (1: 100) in 0,3 ml di tampone di bloccaggio per 48 ore su piastra agitatore a 4 ° C.
- Lavare l'embrione / cuore con PBST 5 volte, 30 min ciascuno a temperatura ambiente sulla piastra shaker. Ciò elimina la non-specifico anticorpo primario legato in eccesso dal tessuto.
- Immergere l'embrione / cuore in Alexa Fluor 647 capra anticorpo secondario anti-topo, diluito (1: 1.000) in 1 ml di tampone di bloccaggio per 48 ore su piastra agitatore a 4 ° C.
- Ripetere il passaggio 3.4 per lavare l'anticorpo secondario.
- Post-fix l'embrione / cuore con 4% PFA per 1 ora a temperatura ambiente sulla piastra shaker e lavare due volte con PBS 5 minuti ciascuno.
- Colorare l'embrione / cuore con la macchia nucleare di 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (diluito in PBST a concentrazione di 0,01 mg / ml) per 10 min a tavola oscillante a RT. Seguire con due lavaggi PBS su 5 minuti ciascuno.
4. Embrione / Clearing cuore con Sca l e o metodo CUBIC
NOTA: dopo tutto il monte colorazione, l'embrione / cuore è sottoposto sia alla Sca le o il metodo del tessuto compensazione cubi. La scelta del metodo dipende dalle dimensioni del tessuto ed età embrionale. Per E11.5 o embrioni età precedenti, l'uso Sca l e metodo tessuto compensazione, mentre per gli embrioni di età superiore o cuori postnatali il metodo tessuto compensazione CUBIC è preferito.
- Scala del tessuto Metodo Clearing
- Incubare l'embrione / cuore con 1 ml di Sca l soluzione e A2 in un flaconcino scintillazione (avvolti in carta stagnola) con occasionali agitando delicatamente (a mano) per 48 ore a 4 ° C.
- Dopo l'incubazione Sca l e A2, incubare l'embrione / cuore con 1 ml di Sca l soluzione e B4 a 4 ° C nella stessa fiala con occasionali agitando delicatamente per anotil suo 48 hr.
- Incubare l'embrione / cuore per un altro 48 ore con 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C con occasionale agitazione delicata. Monte embrione utilizzando il 90% di glicerolo (vedere paragrafo 5.1).
- CUBIC tessuto Metodo Clearing
- Per tutta la dell'embrione / cuore compensazione cubo, immergere ogni embrione / cuore in 1 ml di Cubic-1 con occasionali delicata agitazione per 48 ore a 37 ° C 7. Dopo 48 ore, sostituire la soluzione con lo stesso volume di reagente CUBIC fresco 1, e incubare il campione per ulteriori 48 ore a 37 ° C, con occasionale agitazione con mano.
- Lavare il CUBIC-1 trattati cuore / embrione con PBS 1X diverse volte a temperatura ambiente agitando delicatamente con la mano. Questo rimuove l'eccesso di soluzione CUBIC-1.
- Dopo aver lavato i cubico-1 con PBS, immergere gli embrioni / cuori in CUBIC-2 soluzione (1 g per dell'embrione / cuore) per 48 ore a 37 ° C con occasionali agitando delicatamente con la mano. Questo segue dell'embrione / montaggio con glicerolo cuore (vedi sezione 5.2).
5. Montaggio del campione e Imaging
NOTA: Gli embrioni o organi eliminato in Sca l e 70 o cubica-2 soluzione possono essere esposte direttamente con scala 70 e Cubic-2 soluzione come il mezzo di imaging, rispettivamente. Tuttavia, considerando la vulnerabilità dei campioni embrionali ai reagenti di compensazione, se i campioni non sono essere ripreso immediatamente, ma conservati a lungo termine, conservare i campioni a 90% glicerolo seguendo il protocollo di seguito.
- Direttamente immergere la Sca Le cancellata campione in 1 ml di 90% glicerolo e conservare a 4 ° C fino imaging.
- Lavare il campione trattato cubica con PBS 1x due volte, 5 min ciascuna e sequenzialmente incubare il campione con 1 ml di 30%, 50%, 70% e soluzione di glicerolo 90% ciascuno per 30 min.
- Per l'imaging, trasferire il campione a fondo piatto di vetro Petri con una quantità minima di 90% glicerolo e illustrati cloni con un microscopio confocale equipaggiato con due funzionalità fotoni.
- Immagine cuore o embrione in glicerolo con un / 0.3 NA 10X, 25X un / 0.8 NA immersione, o di una lente obiettivo correttiva 40X / 1.2 NA acqua. Immagine DAPI utilizzando 2-fotoni da un titanio coerente: zaffiro laser camaleonte. La scelta del microscopio e lente obiettivo dipenderà dallo scopo degli esperimenti, ad esempio per super-risoluzione, un microscopio a fluorescenza foglio leggero potrebbe essere utilizzato.
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Representative Results
Imaging del cuore embrionale eliminato
Formazione del cuore dei vertebrati è un processo morphogenic spatiotemporally regolata e dipende dall'organizzazione e la differenziazione delle cellule progenitrici da quattro diverse fonti 1. Le cellule del primo campo cuore della mezzaluna cardiaca si piega verso la linea mediana ventrale per formare un tubo lineari cuore. Le cellule dal secondo campo cuore, inizialmente residenti dorsomedially al primo campo cuore, successivamente traslocano alla faringe e splancnico mesoderma, da dove migrano al ponteggio preesistente del tubo lineari cuore. Le cellule del campo secondo cuore contribuiranno al ventricolo destro, tratto di efflusso (OFT) miocardio e ad alcuni endocardium 25-28. Cardiaci cellule della cresta neurale (CNCC), provenienti da rhombomeres postotic 6, 7 e 8, migreranno alla faringe caudale e contribuire significativamente allo strato di muscolatura liscia e cuscinetti endocardici nel OFT. Essi contribuiscono anche alla formazione del setto aorticopulmonary 29,30. La quarta frazione costituita da cellule derivate epicardial dall'organo pro-epicardica (PEO), e contribuisce alla fibroblasti, cellule muscolari lisce e potenzialmente altri tipi di cellule cardiache 31. L'epicardio regola lo sviluppo vascolare coronarica, la crescita cardiaca e la morfogenesi 21.
Il concetto più importante di morfogenesi cardiaca è che durante lo sviluppo del cuore, la migrazione delle cellule anormali / differenziazione delle popolazioni di cellule progenitrici quattro si tradurrà in malformazioni o difetti cardiaci congeniti 4,22,32, che è la prima causa di difetti alla nascita nel mondo . Determinare i meccanismi di morfogenesi cardiaca a livello cellulare e molecolare è un passo essenziale verso il miglioramento della diagnosi e potenziali trattamenti per CHDs.Pertanto, è fondamentale per l'immagine del processo di morfogenesi cuore a tutto il livello del cuore con una risoluzione di singola cellula. A tal fine, abbiamo etichettato i cardiomiociti attraversando la linea Cre sotto il controllo di cardiaca specifica troponina T (cTnT), che è specificamente indicato nella cardiomiociti 18, con la linea di giornalista mTmG. Gli embrioni a E8.5 sono state raccolte e colorate per PECAM di distinguere le cellule endocardico ed endoteliali da cardiomiociti. Gli embrioni sono stati poi cancellati dalla Sca LE e il cuore è stato ripreso. Il miocardio è stato etichettato da GFP a causa di ricombinazione cTnT-driven Cre-mediata del reporter mTmG, e l'endocardio è stato etichettato con PECAM (Figura 1A e Movie supplementare 1). I cardiomiociti possono essere osservati in una sola risoluzione cella (Figura 1A). Le strutture del cuore della parte ripreso, come ad esempio il ventricolo primitivo e spesso possono essere chiaramente identificati dopo la ricostruzione 3D utilizzando re 3Dsoftware di progettazione (Figura 1B e supplementare Movie 2).
Imaging singoli cloni del cuore embrionale eliminato
Morfogenesi cardiaca dipende dalla differenziazione lignaggio cardiaca e organizzazione singola cella a tutto il livello del cuore 22, e, quindi, è essenziale per una sola immagine la differenziazione delle cellule progenitrici cardiache a diversi tipi di cellule cardiache e di immagine anche la morfologia delle cellule ad una risoluzione di singola cellula. A tal fine, Rosa26Cre ERT2 15 è stato attraversato da R26R-Confetti 16, e la femmina incinta è stata gavaged con Tamoxifene a basse concentrazioni. Dopo 48 ore, l'embrione è stato raccolto a E9.5, e tutto il monte macchiato per PECAM, e poi tutto il cuore è stato ripreso. Abbiamo scoperto che c'era solo un ammasso di cellule, localizzato l'OFT, e questo clone aveva o 8 celle a basen l'immagine ricostruita e sezioni consecutive (figure 2A, 2B e complementare film 3), indicando che queste cellule sono derivate da una singola cellula progenitrice. La morfologia cellulare e comportamento cellulare quali la proliferazione cellulare e la migrazione possono essere dedotte dal posizionamento finale delle cellule (Figura 2A). Abbiamo inoltre applicato il metodo CUBIC per cancellare il cuore embrionale a E9.5 e E10.5, e abbiamo trovato che anche dopo solo 24 ore di incubazione con il reagente 1, gli embrioni sono stati sottilmente sciolti e la struttura del tessuto è stato influenzato negativamente (dati non mostrati ).
Imaging di postnatale cancellato e cuori in ritardo embrionali
Abbiamo applicato sia Sca l e CUBIC e per cancellare i cuori postnatale. cuori P2 con il genotipo di αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre è specificamente indicato nella cardiomiociti <sup> 17) sono state autorizzate con Sca l e per 48 ore, ma non ha visualizzato più trasparenza rispetto ai cuori trattati con PBS solo (dati non mostrati), indicando che Sca l e compensazione non è efficace per i cuori postnatali. Quando cuori P2 sono stati liquidati con il reagente CUBIC 1 per 48 ore, e il reagente 2 per 96 ore, erano molto più trasparente di cuori liquidati con il reagente 1 per 48 ore e il reagente 2 per 48 ore. La profondità delle immagini è risultata significativamente aumentata con 96 ore di reagente 2 incubazione (Film complementari 4 e 5), indicando che più a lungo di incubazione con i reagenti CUBI promuove la trasparenza e prevede un aumento della profondità delle immagini. La forma e la dimensione di ogni cardiomiociti possono essere identificati dalla membrana GFP localizzata (Figura 3A), che può essere utilizzato per identificare l'ipertrofia.
Abbiamo anche chiarito NFATc1-Cre, Confetti (Confetti femminile collegato con Nfatc1Cre maschili) cuori E17.5 (NFATc1-Cre è espresso nelle cellule cardiache endocardico 19) con il reagente CUBIC 1 per 48 ore e il reagente 2 per 48 ore. I cuori sono trasparenti, e ci si aspettava proteine fluorescenti tra GFP, YFP, CFP e RFP per etichettare le cellule endocardico e le loro cellule derivate; tuttavia, solo GFP e YFP potrebbero essere esposte attraverso tutto il cuore (Figure 3B, 3C e filmati supplementari 6 e 7), e la PCP e RFP non potevano essere rilevati (dati non riportati). La colorazione per PECAM (Alexia Fluor 647), inoltre, non poteva essere rilevato (dati non riportati), suggerendo che il reagente CUBIC placa la PCP, RFP e l'anticorpo coniugato fluoroforo in questo protocollo.
Figura 1:. Imaging Sac / e cancellata cuore embrionale (A) Un opè mostrato; fetta tici di un cuore E8.75 (mTmG cTnT-Cre). V: ventricolo; OFT: tratto di efflusso. (B) di visualizzare la struttura cuore ricostruito di 93 fette ottici consecutivi con una profondità totale di 110,4 micron. Barra di scala = 20 micron di A. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging singolo clone di Sca / e cancellata cuore embrionale (A) Una sezione ottica di un clone da un cuore E9.5 con il genotipo di ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-Confetti. La freccia indica una sporgenza cellulare di un cardiomiociti. (B) mostra il clone ricostruito nella regione OFT del cuore E9.5 con 10 fette ottici e 36 micron di profondità totale. Barra di scala = 20 micron di A. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 3: Imaging del post-natale eliminato cubica e cuori fine embrionali (A) mostra una sezione ottica di un cuore P2 con il genotipo di αMHC-Cre; mTmG; tutte le sezioni ottiche sono mostrati in Movie supplementare 5. (B) mostra una sezione di un cuore E17.5 con il genotipo di NFATc1-Cre; ROSA26-Confetti. (C) di visualizzare la struttura del cuore ricostruita da 106 fette ottici con una profondità totale di 630 micron. La barra di scala = 20 micron di A e 100 micron di B. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Film supplementare 1: Imaging la Sca le cancellata cuore embrionale (clic destro per scaricare) Film 1 mostra sezioni ottiche di un Sca Le trattate E8.75 cardiaca (cTnT-Cre; mTmG) dalla superficie cuore a lume di cuore. La profondità è 110,4 micron e ci sono 93 fette in totale.
Film integrativa 2:. Imaging la Sca le cancellata cuore embrionale (clic destro per il download) Movie 2 mostra l'immagine superficie 3D del cuore ricostruito in Movie 1, ricostruzioneTed tramite il software di ricostruzione 3D. segni gialli l'espressione PECAM e verde etichette di tutti i cardiomiociti.
Film supplementare 3: Imaging un singolo clone della Sca le cancellata cuore embrionale (clic destro per il download). Film 3 mostra sezioni di un clone da un cuore E9.5 con il genotipo di ROSA26-Cre ERT2.
Film supplementare 4: Imaging cubica cuori postnatale eliminato (clic destro per il download). Film 4 mostra le sezioni di un CUBIC cuore P2 trattati (& #945; MHC-Cre; mTmG) dalla superficie cuore a lume di cuore. Questo cuore P2 è stata autorizzata con il reagente CUBIC 1 per 48 ore, e il reagente CUBIC 2 per 96 ore.
Film supplementare 5: Imaging cubica cuori postnatale eliminato (clic destro per il download). Film 5 mostra un cuore che è stato cancellato con il reagente CUBIC 1 per 48 ore e il reagente CUBIC 2 per 48 ore. La profondità è 136 micron con 6 micron per sezione in film 4 e lo spessore è 76 micron con 6 micron per sezione in film 5.
Film supplementare 6: Imaging cubica Embry fine eliminatocuore onic (clic destro per il download) Film 6 mostra sezioni di un cuore CUBIC E17.5 trattati (NFATc1-Cre; ROSA26-Confetti). dalla superficie del cuore a lume di cuore. La profondità è 630 micron con 6 micron per sezione.
Film supplementare 7: Imaging cubica eliminato cuore tardo embrionale (clic destro per il download). Film 7 mostra il quadro superficie 3D del cuore nel film 6, ricostruita tramite il software di ricostruzione 3D.
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Discussion
L'isolamento embrione è un passo molto importante. embrioni E9.5 sono molto fragili e di piccole dimensioni, in modo da la cura dovrebbe essere presa per non danneggiare le strutture dell'embrione / cardiaci durante l'isolamento. Gli strati aggiuntivi non embrionali che avvolgono l'embrione / cuore devono essere rimossi con attenzione soprattutto quando l'imaging tutta dell'embrione. Questo permette la penetrazione di anticorpi e di compensazione miscela in profondità all'interno dei tessuti embrionali, e aiuta anche a rimuovere il segnale di fondo quando l'imaging. Anticorpi multipli comprese anticorpi contro PECAM, acetilata α-tubulina e β1 integrine sono stati esaminati e tutti sono stati rilevati con successo (dati non riportati) 33. Ciò dimostra che l'integrità molecolare, integrità cellulare e compatibilità antigene non fosse interrotto durante questo processo di compensazione.
Trasferire l'embrione / cuore utilizzando una vasta pipetta di trasferimento bocca (tagliare la punta). Questo evita danni durante la movimentazione. La GFP / YFP / RFP / CFP espressione modello e numero di cloni deve essere attentamente registrata nel cuore per determinare il dosaggio appropriato per etichettare un clone a cuore o altri organi. A causa del basso dosaggio di Tamoxifen (10 ug / g), a volte il cuore non contiene alcun cloni o è difficile da rilevare eventuali cloni. Pertanto, si raccomanda di utilizzare il sacco vitellino per determinare se l'embrione ha qualche GFP / YFP / RFP / cloni della PCP.
La fissazione embrione o cuore è un punto critico, come sopra fissazione si tradurrà in uno sfondo alta mentre sotto fissazione si tradurrà in scarsa colorazione. Si consiglia di fissare il E8.5-E10.5 intero embrione per 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Mentre per gli embrioni E11.5-E15.5, la raccomandazione è quello di isolare con cura il cuore e fissarlo con 4% PFA per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo essersi assicurati per rimuovere gli strati che circondano il cuore, se l'elaborazione del tutto embrionale, gli embrioni E11.5- E13.5 possono anche essere fissati per 3-4 ore a temperatura ambiente, ma che richiede un aumento del tempo di tessuto di compensazione. Il E16.5-P1 (postnatalegiorno 1) cuori sono fissati per 3-4 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Nel fissare l'intero embrione, in primo piano e gli arti posteriori devono essere rimossi in quanto ostacolano la dell'imaging cardiaco.
I campioni devono essere trattati con cubica e Sca le in fiale di scintillazione per ridurre al minimo l'essiccazione del campione. Abbiamo osservato meglio compensazione dei campioni con il metodo tessuto compensazione CUBIC a 37 ° C, mentre le Sca compensazione è ottimamente eseguita a 4 ° C. Dopo l'imaging, i campioni possono essere conservati a breve termine cubico-2 o Sca le 70. I campioni devono essere sempre coperti con un foglio di alluminio per evitare la fluorescenza sbiancamento.
tessuti embrionali e organi hanno meno lipidico e deposizione di matrice extracellulare, che si traduce in meno tempo di compensazione. D'altra parte, sono più vulnerabili ai reagenti di compensazione. I reagenti di compensazione potrebbero compromettere l'integrità della struttura dei tessuti e l'antigene, causando lo spegnimento del PCP, RFP e anticorpi conjufluoroforo gated. Pertanto, tempi di fissazione più lunghi potrebbero impedire la tempra. La tempra delle proteine fluorescenti potrebbe anche essere dovuto alla loro sensibilità agli agenti chimici e pH come precedentemente riportato 34. Altre ricette chimici, pH, fissativi e durata dell'incubazione dovrebbero essere esaminati per minimizzare la tempra delle proteine fluorescenti.
Il metodo di tutto transparentizing organo o tessuto di compensazione volumetrica ha rivoluzionato l'imaging 3D. Il metodo di imaging precedente per morfogenesi cardiaca, che ha coinvolto la ricostruzione 2D o 3D manuale delle sezioni seriali, in termini di tempo e strumento esigenti 5,6. Alta risoluzione episcopica microscopia (HREM) in combinazione con la modellazione 3D può essere applicata allo studio della morfogenesi del cuore mouse e fornisce un'eccellente descrizione anatomica dell'architettura trabecolare nella sviluppo dell'embrione di topo 35. Tuttavia, HREM non consente l'identificazione del flcellule marcate proteina ent o cellule anticorpo macchiato dal resto delle cellule 35. Utilizzando il protocollo attuale, con il minimo sforzo e l'efficacia alto costo, abbiamo conservato con successo i segnali fluorescenti nel cuore embrionale utilizzando Sca LE o metodi di tessuto di compensazione cubi (Figure 1 - 3). In combinazione con una bassa dose (10 mg / g) del Tamoxifene per indurre eventi di ricombinazione Cre e generare un paio di cloni all'interno dell'intero embrione e nel cuore, questo sistema può essere usato per tracciare e studiare singola differenziazione delle cellule progenitrici cardiache e comportamenti cellulari in vivo (Figura 2A) 33. Inoltre, in combinazione con delezione del gene Cre mediata o sovraespressione e Cre mediata etichettatura singola cella, questo sistema di imaging può essere applicato per studiare perdita genetica di funzione o di guadagno di funzione sulla differenziazione delle cellule progenitrici e comportamento cellulare durante morfogenesi cardiaca, e quindi fornisce una robusta strumento per stUdy l'eziologia di difetti cardiaci congeniti.
I due sistemi di compensazione tessuto Sca / ee CUBIC utilizzato in questo studio hanno mostrato differenti efficienze di compensazione, che differenzia ulteriormente i sistemi in base all'età embrionali, spessore del tessuto e la durata di tempo tessuto compensazione. Per prima fase embrioni E9.5-E10.5, la Sca / e sistema non solo ha reso il tessuto chiaro, ma anche protetto la morfologia degli embrioni e conservato i segnali fluorescenti, mentre il trattamento CUBIC portato in embrione dissoluzione. Questo potrebbe essere il risultato di amminoalcoli aggiuntivi e una maggiore concentrazione di Triton X-100 in soluzioni CUBIC 8. Per i cuori più anziani, la Sca / e il sistema non è riuscito a cancellare completamente il tessuto anche con un tempo di incubazione più lungo. La soluzione compensazione CUBIC reso il più vecchio tessuto chiaro (Figura 3). Tuttavia, aumento del tempo di incubazione provocato segnali più deboli e solo protetto GFP endogena, mentre RFP, CFP e segnali di anticorpi coniugatierano persi. Per questo motivo, una ricetta più ottimizzato dei reagenti compensatori e migliore tempo di incubazione sarebbe necessario per volumetricamente cuori immagine o organi con una maggiore spettro di etichette fluorescenti.
Questo studio ha dimostrato che si può etichettare, tracce, e illustrati singoli cloni cardiaci in combinazione con un intero monte colorazione endocardici / endoteliali indicatore di cella PECAM del cuore sviluppo. L'intero monte colorazione DAPI PECAM e in questo sistema aiuta non solo per identificare i tipi di cellule e la morfologia cellulare delle cellule marcate all'interno di un cuore, ma permette anche lo studio del pattern clonale, migrazione e comportamento durante morfogenesi cardiaca. Nella Figura 2A abbiamo osservato un clone con 8 celle a OFT. Utilizzando il numero di cellule presenti in questo clone con riferimento al tempo di etichettatura, il tasso di proliferazione cellulare può essere facilmente calcolata. In un altro studio con questo stesso sistema abbiamo identificato il modello di divisione cellulare e orientata migrmodello zione del singolo cardiomiociti durante il processo trabecolazione 33. L'applicazione di questo protocollo per studiare gli effetti della perdita genetica di funzione o di guadagno di funzione spatiotemporally sulla differenziazione delle cellule progenitrici cardiache etichettato, modello clonale e il comportamento cellulare è fattibile, e contribuirà in studi della eziologia di difetti cardiaci congeniti alla genetica e livello molecolare in un contesto 3D. Inoltre, questo protocollo può essere applicato allo studio della morfogenesi in altri sistemi di organi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
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