Abstract
在全心脏水平单克隆跟踪和分析可以心脏发育过程中确定心脏祖细胞的行为和分化，并允许正常和异常的心脏形态发生的细胞和分子基础的研究。回顾单克隆分析最近的新兴技术使心脏形态发生在单细胞分辨率的研究是可行的。然而，组织的不透明度和心脏的成像深度的光散射在单细胞分辨率提高阻碍全心脏成像。为了克服这些障碍，整个胚胎清算系统，可以使心脏的高度透明为照明和检测必须发展。幸运的是，在过去的几年中，已报告的全生物结算系统如透明度，爱生雅乐 ，SeeDB，ClearT，3DISCO，CUBIC，DBE，BABB和PACT许多方法。这个实验有兴趣卡的细胞和分子机制IAC形态。心脏发育过程中ROSA26-纸屑系统稀疏标签细胞;最近，我们建立了单细胞系通过ROSA26 Cre重组ERT2跟踪。我们适应几个全胚胎清算方法，包括了Sca LE和立方（清晰，通畅脑成像的鸡尾酒和计算分析）来清除组合与胚胎整装染色心脏内部的图像单一克隆。该心脏在单细胞分辨率被成功成像。我们发现的Sca 乐可以清除胚胎心脏，但不能有效地清除产后心脏，而CUBIC可以清除产后心脏，但损害胚胎心脏的组织溶解。此处所描述的方法将允许基因功能的研究在心脏形态发生，这反过来，可以揭示先天性心脏缺陷的细胞和分子基础中的单个克隆的分辨率。
Introduction
心脏形态发生是需要的四种不同类型的心脏祖细胞的时空组织进入心脏的不同扇区的连续事件，并且还需要多基因调控网络来协调这一过程以形成功能性心脏1,2。心脏规范，分化，图案，和室成熟的心源性转录因子调控3。基因突变或这些因素在心脏祖细胞转录后像差可能导致要么胚胎致死或先天性心脏缺陷（CHD）4。心脏形态发生的研究需要在三维（3D）固有的结构细节和单标记心脏祖细胞系心脏发育过程中的跟踪将促进心脏形态的理解的理解。一些高分辨率的基础部分断层扫描方法已经在日被开发Ë过去几十年来的图像器官结构5,6;然而，这些方法需要昂贵的，专门的仪器，广泛劳动，并且缺乏在单细胞分辨率的详细结构组织在最终体积重建图像7,8。
在单细胞水平的3D体积成像提供研究祖细胞分化和细胞行为体内 7的装置。然而，组织光散射仍然是主要的障碍深完整的心脏内的3D成像的细胞和结构。脂质是光散射的一个主要来源，和去除脂质和/或脂质和它们的周围区域之间的折射率差的调整的是用于提高组织透明度8潜力的方法。在过去的几年中，一些组织结算方法的发展，从而降低组织的不透明性和光散射，像BABB（苄醇和苄benzoatË混合物）和DBE（四氢呋喃和dibenzylether）;但在这些方法中，荧光猝灭仍然是一个问题8-10。溶剂为基础的亲水性的方法，如SeeDB（果糖/硫代甘油）和3DISCO（二氯甲烷/ dibenzylether），保持荧光信号，但不使整个器官透明7,8,11。相比较而言，净度组织清除方法呈现器官透明的，但它需要一个专门的电泳装置以除去脂质8,12一样，PACT（无源清晰度技术），这也需要水凝胶包埋7,13。有关所有可用的组织清除方法的详细信息，请参阅表1 Richardson和利希特曼等。7。
2011年，哈马等人偶然发现了一种亲水的混合物“的Sca 乐 '（尿素，甘油和Triton X-100混合物）呈现小鼠大脑和胚胎transpar耳鼻喉科而完全从克隆标记保持14荧光信号。这允许完整的大脑中的几个毫米和神经元群体和突起的大规模重建的深度成像以亚细胞的分辨率。须崎等人。进一步完善了Sca 乐加入氨基醇，并制定了“CUBIC”（清晰，通畅脑成像的鸡尾酒和计算分析）组织清除的方法，从而增加磷脂溶解，降低了结算时间，并允许多色荧光成像8。在本研究中，心脏发生在服用心脏内线优势在SCA 乐和立方组织清算技术和高分辨率三维光学切片，单个克隆使用Rosa26Cre ERT2 15，R26R-纸屑 16，αMHCCre重组酶17， 肌钙蛋白Cre重组酶被追踪18， NFATC1 Cre重组酶 19，和ROSA26-mTmG（mTmG）20鼠标线。整个装载染色（WMS）方法的组合预先21,22与组织结算方法还允许在标记的克隆其他蛋白质的染色和对它们的行为在3D体积上下文中研究开发的。组织清除和WMS的组合允许更好地理解不同的基因和蛋白质的心脏发育过程中的作用，并先天性心脏缺陷的病因。这个协议可以被应用开发过程中来研究其他祖细胞分化，细胞行为和器官形态发生的事件。
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Protocol
所有动物实验的机构动物护理和使用委员会（IACUC）奥尔巴尼医学院根据NIH指南照顾和实验动物使用批准并执行。
1.解决方案的准备
注：Rosa26Cre ERT2 15，R26R-16五彩纸屑 ，αMHCCre重组酶17， 和ROSA26-mTmG（mTmG）20鼠标线被购得肌钙蛋白T-18的Cre来自蛟博士在阿拉巴马大学的礼物NFATC1 Cre重组酶 。来自周斌博士医学19的爱因斯坦医学院的礼物。小鼠通过吸入二氧化碳在一个封闭的腔室安乐死为至少60秒，接着通过双边开胸，断头或颈椎脱位死亡验证的物理手段。
- 他莫昔芬准备。溶解10毫克三苯氧胺的10ml葵花籽OI的湖一旦完全溶解，等分试样并贮存在-20℃。
- 制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。溶解的 Na 2 HPO 4（1.41960克），KH 2 PO 4（0.24496克），氯化钠（8.0669克）和KCl（0.20129克）在1L的蒸馏水中并调节pH至7.4。
- 通过在100毫升PBS中溶解100微升吐温-20的PBS中的0.1％Tween-20的溶液：准备PBST。
- 准备封闭液。通过3克BSA溶解在100毫升的PBST含有0.2％Tween-20的使3％牛血清白蛋白（BSA）封闭溶液。
- 准备CUBIC-1（试剂1）。混合25％（重量）的尿素，25％（重量）N，N，N'，N'-四（2-羟丙基）乙二胺和15％（重量）的Triton X-100在蒸馏水中2 O
- 准备CUBIC-2（试剂2）。混合50重量％的蔗糖，25％（重量）的尿素，10重量％2，2'，2'' - nitrilotriethanol和0.1％（体积/体积）的Triton X-100在蒸馏水中2 O
- 制备的Sca 勒 A2：4M尿素，10％w / v的甘油和0.1％w / v的的Triton X-100在卫生署2 O.调节pH值至7.7。
- 制备的Sca 勒 B4：8M尿素和0.1％w / v的的Triton X-100在蒸馏水中2 O调整pH值至8.7。
- 制备的Sca 文件 70：4M尿素，70％w / v的甘油和0.1％（重量）用蒸馏水2 O /体积的Triton X-100
2.他莫昔芬诱导，胚胎分离及固定
- 他莫昔芬诱导和胚胎隔离
- 使用弯曲进料管批准的协议（茶杯说教13-12007），灌胃女R26Cre ERT2五彩纸屑小鼠（R26Cre ERT2雄性小鼠插入式）与E7.75 33胚胎发育第10天微克/克三苯氧胺。在9.5天胚胎（E9.5）或E10.5，安乐死雌性小鼠用CO 2和颈脱位。
- 小鼠的死亡验证后（见1注），用剪刀拆开鼠标腹腔解剖出子宫角，用剪刀和镊子，并重新的帮助去除输卵管层租赁从子宫管23,24的胚胎。
- 胚胎转移到含有PBS（pH 7.4）中的培养皿。下的解剖显微镜，删除与镊子的帮助下非胚胎层（绒毛膜，卵黄囊和羊膜）。
- 使用镊子和剪刀，收集雌性小鼠胚胎尾部样本进行基因分型如先前报道22。使用塑料移液管，每个胚胎转移到含有1ml 1×PBS中的48孔平板的孔中。
- 在荧光显微镜，通过与摄像头倒置显微镜识别GFP / RFP / CFP积极的胚胎。剥离远用镊子心包和旋转具有弯曲镊子的帮助下心脏/胚，以确定荧光的克隆对心脏的两侧与GFP / RFP / CFP滤波器的数量。不需要裁员。
- 识别GFP / RFP / CFP积极的胚胎后，迅速用1X PBS洗涤胚胎两次（每次2分钟）日È48上，在室温（RT）下在板振荡器孔板。这将去除多余血液。
- 修复用4％多聚甲醛（PFA）在室温胚胎/胚胎心脏。在固定时间取决于胚胎的年龄和组织的大小。为E9.5固定胚胎在室温2小时。胚胎后期胚胎需要更长的固定时间，它甚至可以延长为产后心脏24小时。
注意：多聚甲醛是有毒的，避免与皮肤，眼睛和粘膜接触。 - 固定后，在48孔板洗涤胚胎/心脏两次用1×PBS（每次10分钟）上在室温在板振荡器。这从胚胎/心脏去除多余的PFA。胚胎，然后再整装染色和组织清算处理。
3.整装染色
注：PFA固定后胚胎/心脏如下受到整装染色。
- 通透的胚胎/心脏用1米48孔板升0.1％的PBST，在室温上板振荡器2小时。
- 以下透，在4ºC浸入胚胎/心脏在1ml阻断缓冲液中，用于在板振荡器2小时或过夜。
- 沉浸胚胎/心脏的内皮细胞特异性抗体PECAM（CD31），稀释（1：100），0.3毫升4ºC封闭缓冲液对板振荡器48小时。
- 在板振动筛使用PBST 5次，每次30分钟在室温洗胚胎/心脏。这消除了从组织的过量的非特异性结合的一次抗体。
- 浸入的Alexa Fluor 647山羊抗 - 鼠第二抗体胚/心脏，稀释（1：1,000）在1毫升，在4ºC封闭缓冲液对板振荡器48小时。
- 重复步骤3.4洗二次抗体。
- 后固定用4％PFA胚胎/心脏在RT上板振荡器1小时，并与每个PBS中的5分钟洗涤两次。
- 与核染色4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（在concent在PBST中稀释染色胚胎/心脏为0.01毫克/毫升），在室温上板振荡器10分钟配给。与每5分钟2 PBS洗涤跟随。
4.胚胎/心脏结算SCA的L E或三次法
注：整装染色后，胚胎/心脏受到任何SCA的文件或三次组织清除的方法。方法的选择依赖于组织大小和胚胎的年龄。对于E11.5或更早年代的胚胎，用的Sca L E组织清除的方法，而对于较旧的胚胎或产后心立方组织清除方法是首选。
- 大规模组织清除方法
- 在闪烁瓶中将1ml的Sca L E A 2溶液（用铝箔包裹）偶尔轻轻摇动（用手）48小时，在4℃下孵育胚胎/心脏。
- 的Sca L E A2孵育后，用1毫升的Sca L E B4解决方案孵化胚胎/心脏在4℃，偶尔温和振荡ANOT同一小瓶她48小时。
- 孵育胚胎/心脏再48小时用1毫升的Sca L E 70在4℃，偶尔轻轻摇动。用90％的甘油山胚（参见5.1节）。
- CUBIC组织清除方法
- 对于全胚胎/立方心脏清理，浸泡每个胚胎/心脏在1毫升CUBIC-1与偶尔的温柔在37ºC7惊天48小时。 48小时后，更换用相同体积的新鲜立方试剂1的溶液中，并在37℃下，偶尔用手摇动孵育样品另外48小时。
- 在室温下用手轻轻摇动洗三次-1处理的心脏/用1×PBS几次胚胎。这消除了多余的CUBIC-1解决方案。
- 用PBS洗涤三次出-1后，浸泡胚胎/心立方-2溶液（每胎/心脏1克）48小时，在37ºC与偶尔用手轻轻摇动。在此之前，胚胎/心脏使用甘油的安装（见第5节0.2）。
5.样品放置和成像
注：SCA中的L E 70或立方-2解决方案清除胚胎或器官可直接与规模70和CUBIC-2溶液为成像介质分别进行成像。但是，考虑到胚胎样品的脆弱性清除试剂，如果样品不能立即成像，但长期存储，保存在90％的甘油的试样按照下面的协议。
- 直接浸泡在SCA 乐在4°C，直到成像在1毫升90％甘油和商店清除样本。
- 用1×PBS洗涤三次处理的样品两次，每次5分钟，并依次孵育用1ml的30％，50％，70％和90％的甘油溶液的每个样品30分钟。
- 对于成像，将样品与90％甘油和图像克隆的最小量与装有两个光子能力的共焦显微镜转移到玻璃底培养皿。
- 图像中是10X / 0.3 NA甘油心脏或胚胎，一个25X / 0.8 NA浸泡，或40X / 1.2 NA水矫正物镜。图片DAPI使用2光子激发从一个连贯的钛蓝宝石激光变色龙。显微镜和物镜的选择将依赖于实验， 例如用于超分辨率的目的，一个光片的荧光显微镜可以利用。
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Representative Results
成像清除胚胎心脏
脊椎动物心脏的形成是一个spatiotemporally调节形态发生过程，并且取决于从四个不同来源1的组织和祖细胞的分化。从心脏月牙的第一场心脏细胞会向着腹中线折叠，形成线性心脏管。来自第二心脏视野中的细胞，最初驻留dorsomedially到第一心脏字段，随后转位到咽和内脏中胚层，从那里它们迁移到线性心脏管的现有预支架。第二心脏场的细胞将有助于右心室，流出道（OFT）心肌和一些心内膜25-28。心脏神经嵴细胞（CNCC），源自postotic菱6,7和8，将迁移到尾咽，贡献显着在OFT平滑肌层和心内膜垫。它们还向主肺动脉隔膜29,30的形成。第四人口由来自亲心外膜器官（PEO）衍生的外膜的细胞，并促进成纤维细胞，平滑肌细胞和潜在的其他心脏细胞类型31。心外膜调节冠状动脉血管发育，心脏生长和形态发生21。
关于心脏形态发生的最重要的概念是，心脏发育异常细胞迁移过程中/四祖细胞群分化将导致畸形或先天性心脏缺陷4,22,32，这是出生缺陷的头号原因世界。在细胞和分子水平上确定心脏形态发生的机制是为了提高诊断和潜在的治疗为CHDS的必要步骤。因此，重要的是将图像心脏形态发生在整个心脏水平与单细胞分辨率的过程。为了实现这一目标，我们通过横渡心肌特异性肌钙蛋白T的控制（cTnT）的，这是在18心肌特异性表达，与mTmG记者线下的Cre线标记的心肌细胞。在E8.5胚胎收获和染色PECAM从心肌区分心内膜和血管内皮细胞。胚胎随后被SCA 乐清零，心脏被成像。心肌被打成通过GFP由于mTmG记者cTnT的驱动Cre重组酶介导的重组和心内膜标记有粘附分子（ 图1A和补充电影1）。心肌细胞可在单细胞分辨率（ 图1A）被观察到。成像部的心脏结构，例如原始心室和OFT可以三维重建之后使用三维再明确建设软件（ 图1B和补充电影2）。
成像清除胚胎心脏的单克隆
心脏形态发生取决于心脏谱系分化和单个细胞组织在整个心脏水平22，并且因此，这是对图像单个心脏祖细胞分化为不同的心肌细胞类型必要并在单细胞分辨率也图像的细胞形态。为了实现这个目标，Rosa26Cre ERT2 15被杂交R26R-纸屑 16和怀孕雌性是在低浓度下与他莫昔芬管饲。 48小时后，胚胎收获E9.5，并且整装染色PECAM，然后整个的心脏成像。我们发现有细胞的仅一个簇，定位于OFT，并且该克隆具有基于8细胞ön中的重建图像和连续部分（ 图2A，2B和补充电影3），表明这些细胞是从一个单一的祖细胞衍生的。细胞形态和细胞行为，如细胞增殖和迁移可以从细胞（ 图2A）的最终定位来推断。我们还应用了三次方法来清除在E9.5和E10.5胚胎心脏，并且发现，即使后只有24与试剂孵育1小时后，胚胎微妙地溶解和组织结构受到不利影响（数据未示出）。
清除产后晚期胚胎心脏成像
我们同时适用的Sca L E和立方清除产后心。 P2与心中αMHCCre重组酶的基因型; mTmG（αMHCCre重组酶专门在心肌细胞表达<SUP> 17）与48小时的Sca L E清除，但没有表现出任何比用PBS处理的心只（数据未显示）更加透明，这表明了Sca L E结算是不是有效的产后心。当P2心脏立方试剂1清除了48小时，试剂2 96小时，他们比48小时试剂1和试剂2 48小时清除心中更加透明。成像深度与96小时试剂2温育（ 补充影4和5）中的显著增加，表明与立方试剂潜伏期较长提高透明度，并提供了增加的成像深度。每个心肌细胞的形状和大小可通过在膜的局部的GFP（ 图3A），其可用于识别肥大被识别。
我们也被清除NFATC1 Cre重组;五彩纸屑 （纸屑女性，插上的Nfatc1Cre男）E17.5心（NFATC1 Cre重组酶在心肌细胞心内膜19）CUBIC试剂1表示48小时和试剂2 48小时。心是透明的，和荧光蛋白，包括GFP，YFP，CFP和RFP被预期以标记心内膜细胞及其衍生细胞;然而，仅GFP和YFP可以通过整个心脏进行成像（ 图3B，3C和补充影6和7），和在CFP和RFP无法检测（数据未显示）。对于PECAM染色（失读症氟647）也无法检测到（数据未示出），这表明立方试剂淬火CFP，RFP与在此协议的抗体缀合的荧光团。
图 1： 成像萨克/ E清除胚胎的心脏 （A）一运一个E8.75心脏（cTnT的Cre重组; mTmG）的蒂卡尔片所示。五：心室; OFT：流出道。 （b）表示具有110.4微米的总深度的93个连续的光学切片的重建心脏结构。比例尺=20μm的A. 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：成像SCA /电子商务单个克隆清除胚胎的心脏 （A）从E9.5心脏与ROSA26-Cre重组酶ERT2的基因型克隆的一个光学部分。 ROSA26-纸屑。箭头指向一个心肌细胞的细胞突起。 （b）表示在E9.5心脏的OFT区域重建的克隆用10光学片和36微米的总深度。比例尺=20μm的A. 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：成像立方清除产后及后期胚胎心脏 （A）表示P2心脏与αMHCCre重组酶的基因的一个光学部分; mTmG;所有的光学部分在补充电影5（B）中显示的E17.5心脏与NFATC1 Cre重组酶的基因的一个部分; ROSA26-纸屑。 （C）表示从106光学切片的重建心脏结构的630微米的总深度。比例尺=20μm的A和100微米B. 请点击此处查看该图的放大版本。
。 补充电影1：成像SCA的 文件 清除胚胎的心脏 （点击下载），电影1显示的Sca 乐的光学切片处理E8.75心脏（cTnT的Cre重组; mTmG）从心脏表面，心脏腔。深度为110.4微米，有93片在总。
补充电影2：影像学检查的Sca 乐 清除胚胎的心脏 （点击下载），电影2显示了在电影1重建心脏的三维表面的图片，reconstruc通过三维重建软件特德。黄色标志的PECAM表达和绿色标签的所有心肌细胞。
补充电影3：成像在SCA 乐单个克隆 清除胚胎的心脏 （右击下载）。电影3显示了一个克隆的节从E9.5心脏与ROSA26-Cre重组酶ERT2的基因型。
补充电影4：成像立方清除产后心 （右击下载）。电影4显示了三次治疗心脏P2路段（＆＃945; MHC-Cre重组; mTmG）从心脏表面，心脏腔。此P2的心脏立方试剂1 48小时，和立方试剂2 96小时清除。
补充电影5：成像立方清除产后心 （右击下载）。电影5显示了与试剂CUBIC 1 48小时和试剂CUBIC 2 48小时清除了心脏。的深度为136微米，每部分6微米的电影4，厚度为76微米，每部分6微米的电影5。
补充电影6：成像立方清后期安莉芳ONIC心脏（点击下载）电影6显示了三次治疗E17.5心脏（NFATC1 Cre重组; ROSA26-五彩纸屑）的部分。对心脏腔心脏从表面。的深度为630微米，每部分6微米。
补充电影7：成像立方清晚期胚胎的心脏 （右击下载）。电影7显示了在电影6心脏的三维表面图像，通过三维重建软件重建。
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Discussion
胚胎隔离是一个非常关键的步骤。 E9.5胚胎的大小很脆弱的，小的，所以格外小心，应注意不要隔离时损坏胚胎/心脏结构。非胚层外包围胚胎/心脏成像应该在整个胚胎时特别小心取出。这使得抗体和清算混合穿透深胚胎组织内部，而且在成像时去除背景信号有所帮助。包括对PECAM抗体，乙酰化α微管蛋白和β1整合多种抗体进行了检查，并全部被成功检测（数据未显示）33。这证明了分子完整性，细胞完整性和抗原兼容性没有在此结算处理中断。
使用广口移液管（切尖）转移胚胎/心脏。此处理过程中避免了损伤。在GFP / YFP / RFP / CFP表达模式和n克隆的棕土应仔细记录在心脏来确定适当的剂量来标记每心脏一个克隆或任何其他器官。由于他莫昔芬（10微克/克）的低剂量，有时心脏不包含任何克隆或难以检测任何克隆。因此，建议使用卵黄囊以确定胚胎有任何GFP / YFP / RFP / CFP克隆。
胚胎或心脏固定是一个关键步骤，因为过度的固定将导致高背景，而下固定会导致染色不良。它建议以固定E8.5-E10.5全胚胎在RT板振荡器上2小时。虽然E11.5-E15.5胚胎中，建议仔细分离心脏，用4％PFA解决它在室温下2小时。确保去除周围的心脏，如果处理整个胚层后，E11.5- E13.5胚胎也可以固定在室温下3-4小时，但是这需要增加组织清算时间。在E16.5-P1（产后第1天）的心被固定在RT板振荡器上3-4小时。当固定全胚胎，因为它们妨碍心脏成像的前后肢应该被删除。
样品应具有立方和SCA 乐被视为闪烁小瓶中，尽量减少样品干燥。我们观察到与立方组织清除方法的样品更好清除在37℃，同时的Sca 乐信息交换是在4℃下最优地进行。成像后，将样品可以储存在立方-2 -或Sca 文件 70短期。样品应始终用铝箔覆盖，以防止荧光漂白。
胚胎组织和器官有较少的脂质和细胞外基质沉积，这导致更少的清除时间。在另一方面，他们更容易受到清算试剂。信息交换的试剂可能影响组织结构和抗原的完整性，从而导致CFP，RFP和抗体conju的淬火门控荧光。因此，较长的固定时间，可能会使淬火。荧光蛋白的淬灭也可能是由于它们的化学品的敏感性和pH如先前报道34。其他化学配方，pH值，固定剂，并孵化长度应该探讨以最小化的荧光蛋白的淬灭。
全器官transparentizing或组织清算的方法，彻底改变了容积3D成像。心脏形态发生以前的成像方法，其中涉及的连续切片的手动2D或3D重建，是费时和仪器苛刻5,6。与三维建模结合高分辨率落射显微镜（HREM）可以被施加到小鼠心脏的形态发生的研究，并提供了在发育的小鼠胚胎35小梁结构的优异的解剖描述。然而，高分辨不允许fluoresc的识别耳鼻喉科蛋白标记的细胞或从细胞35的其余部分的抗体染色的细胞。使用当前的协议，以最小的努力和高的成本效益，我们已经成功地保存在使用的Sca 文件或立方组织结算方法（ 图1 - 3）的胚胎心脏的荧光信号。用低剂量组合（10微克/克）他莫昔芬的诱导酶Cre重组事件并生成全胚胎内，并在心脏的几个克隆中，该系统可用于跟踪和研究单个心脏祖细胞的分化和细胞行为体内 （ 图2A）33。此外，具有的Cre介导的基因缺失或过表达和酶Cre介导的单细胞标记相结合，该成像系统可以被用于研究心脏形态发生过程的功能或对祖细胞分化和细胞行为功能增益遗传损失，因此提供了可靠的工具ST乌德先天性心脏缺陷的病因。
两个组织结算系统的Sca / e和三次在这项研究中使用表现出不同的信息交换的效率，从而进一步区分根据胚胎的年龄，组织厚度和组织清除时间的持续时间的系统。对于早期胚胎E9.5-E10.5，在SCA / E系统不仅呈现组织清楚，但也保护胚胎的形态，并保留了荧光信号，而CUBIC治疗导致胚胎溶解。这可能是额外的氨基醇的结果和Triton X-100的立方溶液8浓度较高。对于较老的心，在SCA / E系统未能甚至更长的培养时间彻底清除组织。立方结算解决方案呈现老组织清晰（ 图3）。然而，增加的孵化时间导致信号较弱，只有保护的内源性GFP，而RFP，CFP和抗体偶联信号输了。出于这个原因，信息交换试剂和更好的温育时间的一个更优化的配方将需要容积图像心或器官与荧光标记的更大的光谱。
这项研究表明，一个可以标记，跟踪和图像单心脏克隆结合发育的心脏心内膜/内皮细胞粘附分子标志物的整装染色。在这个系统中PECAM和DAPI的整装染色不仅有助于识别心脏内的标记细胞的细胞类型和细胞形态，也可以让心脏的形态发生过程克隆模式，迁移和行为的研究。在图2A，我们观察到的克隆8细胞OFT。在此克隆参考标记时使用细胞本的数量，细胞增殖率，可以很容易地计算出来。在使用同样的系统另一项研究中，我们确定了面向细胞分裂模式，MIGR在小梁过程33单心肌的通货膨胀格局。这个协议的研究spatiotemporally上带标记的心脏祖细胞的分化的作用或功能的获得遗传损失的影响的应用，克隆图案和细胞行为是可行的，并且将在先天性心脏缺陷的病因的研究有助于在遗传和分子水平在3D环境。此外，该协议可以应用在其它器官系统来研究形态发生。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
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