Methodenartikel

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

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DOI:

10.3791/54372

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16. Dezember 2016

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1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren (TFs). Wir haben zunächst einen Reporter-Screen mit MEFs von humanen CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) doppeltransgenen Mäusen entwickelt. CD34+-Zellen dieser Mäuse markieren H2B-Histone mit GFP und hören nach Zugabe von Doxycyclin (DOX) auf zu markieren. MEFS wurden mit Kandidaten-TFs transduziert und dann auf das Auftreten von GFP+-Zellen beobachtet, die auf den Erwerb eines hämatopoetischen oder endothelialen Zellschicksals hinweisen würden. Ausgehend von 18 Kandidaten-TFs und durch einen Prozess der kombinatorischen Eliminierung erhielten wir eine minimale Anzahl von Faktoren, die den höchsten Prozentsatz an GFP+-Zellen induzieren würden. Wir stellten fest, dass Gata2, Gfi1b und cFos notwendig waren und die Zugabe von Etv6 die optimale Induktion lieferte. Eine Reihe von Genexpressionsanalysen, die zu verschiedenen Zeitpunkten während des Reprogrammierungsprozesses durchgeführt wurden, zeigten, dass diese Zellen eine Vorläuferzelle zu durchlaufen schienen, die einen endothelialen zu hämatopoetischen Übergang (EHT) durchlief. Als solcher ahmt dieser Reprogrammierungsprozess die Entwicklungshämatopoese "in einer Schale" nach und ermöglicht die Untersuchung der Hämatopoese in vitro und eine Plattform, um die Mechanismen zu identifizieren, die dieser Spezifikation zugrunde liegen. Diese Methodik bietet auch einen Rahmen für die Translation dieser Arbeit in das menschliche System in der Hoffnung, eine alternative Quelle für patientenspezifische hämatopoetische Stammzellen (HSCs) für eine Reihe von Anwendungen in der Behandlung und Erforschung hämatologischer Erkrankungen zu generieren.

Einleitung

Hämatopoese ist ein komplexer Prozess , bei dem Entwicklungs hämatopoetischer Stammzellen (HSZ) vorhanden hemogenic Endothel abgeschnürt in einer Vielzahl von embryonalen hämatopoetischen Stätten wie die Aorta-Gonad-Mesonephros und der Plazenta 1,2. Die Unfähigkeit zur Kultur HSCs in vitro verhindert , dass die eingehende Analyse dieses Prozesses sowie die klinische Anwendung dieser Studien. Zur Umgehung dieser Einschränkung, frühere Studien haben versucht abzuleiten HSZ de novo entweder über die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSCs) 3, oder induzierte Plastizität in somatischen Zellen und gerichtete Differenzierung mit Neuprogrammierung Medien 4,5. Diese Studien jedoch erzeugen keine klinisch sicher engraftable Zellen oder erlauben Studie der endgültigen Entwicklung Hämatopoese "in einer Schale."

Das neue Werk von Yamanaka etabliert und Kollegen pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) aus somatischen Fibroblasten p induziert zu erzeugen,rovides einen Rahmen für die Transkriptionsfaktor (TF) basierend Überexpression Strategien in Reprogrammierung des Zellschicksals 6,7. Diese Arbeit hat aufgefordert, die Ermittler in mehreren Bereichen Zelltypen der Wahl über TF Reprogrammierung von leicht zugänglichen somatischen Zellen zu erzeugen. Das Ziel der hier beschriebenen Umprogrammierung Strategie ist eine hemogenic Prozess von Maus somatischen Zellen zu induzieren , unter Verwendung eines TF basierend Umprogrammierung Ansatz mit dem Ziel , diese Erkenntnisse auf das menschliche System des Übersetzens patientenspezifischen Fibroblasten um umprogrammieren humanen Hämatopoese in vitro zu studieren und erzeugen patientenspezifische Blutprodukte für Krankheitsmodelle, Drogentests und Stammzelltransplantation.

Der erste Schritt richtige Umprogrammierung in diesem Maus-System, um sicherzustellen, war ein Reporter Linie zu entwickeln, die als Auslese für CD34-Expression, ein bekannter Marker in endothelialen Vorläuferzellen und HSZ serviert. Dazu wurden die huCD34-tTA und TetO-H2BGFP transgene Mauslinien verwendet, um generate doppelt transgenen embryonalen Maus - Fibroblasten (MEF), bezeichnet nun 34 / H2BGFP, die 8 bei Aktivierung des CD34 - Promotors grün fluoreszieren. Dies erlaubt Screenen einer Vielzahl von TFs bekannt an verschiedenen Punkten während des hämatopoetischen Spezifikation und Entwicklung benötigt werden. Beginnend mit 18 TFs in pMX retrovial Vektoren (bestimmt durch die Literatur Bergbau und Profilierung von GFP etikettenhalt HSZ aus dem zuvor 34 beschrieben / H2BGFP Mäuse), 34 / H2BGFP MEFs wurden transduziert mit allen Faktoren und kultiviert auf AFT024 HSC tragende Stromazellen. Nach der Erkennung von 34 / H2BGFP Aktivierung wurde identifiziert TFs wurden anschließend von der Umprogrammierung Cocktail bis die optimale Menge von TFs für Reporter Aktivierung entfernt. Nach diesem ersten Bildschirm wurden die Faktoren, die zu einem DOX induzierbaren pFUW Vektorsystem übertragen steuerbaren Expression der TFs zu ermöglichen. Da diese beiden DOX steuerbare Systeme inkompatibel sind (die 34 / H2BGFP Zellen und die pFUW induzierbarer Vektoren), MEFs ausWildtyp C57BL / 6-Mäuse wurden erforderlich. Es war auch notwendig, eine geeignete Mikroumgebung zur Verfügung zu stellen hemogenesis fortzufahren und schaffen multilineage clonogene Vorläufern zu ermöglichen.

Aktuelle Studien somatischen Zellen in hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) haben vielfältige Erfolgsstufen 9-11 erfüllt umprogrammieren versuchen. Bis heute ist die Erzeugung von Maus und Mensch transplantierbaren HSPCs mit langfristigen und sich selbst erneuernde repopulating Fähigkeit wurde mit dem gleichen Satz von TFs nicht erreicht. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Beschreibung der zuvor festgelegten Strategie zu reproduzierbar hemogenesis MEFs induzieren. Wir zeigen , dass die Einführung eines minimalen Satz von TFs (GATA2, Gfi1b, cFos und ETV6) ist in der Lage ein komplexes Entwicklungsprogramm in vitro angestiftet , die eine Plattform kann weiter durch die Entwicklung der Hämatopoese und klinische Anwendung von hämatopoetischen Neuprogrammierung bietet 12 untersucht werden.

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Protokoll

Ethik-Anweisung: Maus-Zelllinien sind im Anschluss an die Tierpflege Richtlinien der Icahn School of Medicine am Berg Sinai abgeleitet und sollte in Übereinstimmung mit jedem Host Institution durchgeführt werden.

1. Maus embryonale Fibroblasten (MEF) Isolierung von C57BL / 6-Mäuse

  1. Richten Sie timed Paarung 13. Sobald ein Vaginalpfropfens sichtbar ist, sollten Sie diesen Tag 0,5.
  2. Trennen Sie die angeschlossen Weibchen am Stecker Datum und überprüfen sie auf Tag 10-11 Schwangerschaft zu bestätigen.
  3. Am Tag 13,5-14,5 schwangere weibliche Mäuse über CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte einschläfern.
  4. Tränken Sie schwangere Frau Bauch mit 70% Ethanol, sezieren die Bauchhöhle mit einer sterilen Schere und Pinzette auf der Mittellinie, und operativ entfernen die Gebärmutterhörner mit den 14 Embryonen. Nehmen Sie die Embryonen vorsichtig aus, während die restlichen Bauchgewebe abzuschneiden.
    HINWEIS: Wiederherstellen etwa 8 Embryonen mit 4 auf jeder Seite.
  5. Legen Sie die Gebärmutter-hORNs die Embryonen in einer 10 cm-Schale mit 5-10 ml steriler gekühlter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) enthält.
  6. Mit einer sterilen Schere und Pinzette, machen einen Einschnitt entlang der Gebärmutterhörner die Säcke zu isolieren, um die Embryonen tragen. Übertragen Sie die Säcke zu einem neuen 10-cm-Schale mit 5-10 ml sterilem PBS gekühlt und auf Eis.
  7. Legen Sie ein paar der Säcke in eine neue 10 cm-Schale mit 5-10 ml sterilem PBS gekühlt. Mit einer sterilen Schere und Pinzette vorsichtig die Säcke aufgeschnitten (ohne zu tief schneiden), um die Embryonen zu vermeiden, Piercing.
  8. Trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta durch die Nabelschnur zu schneiden.
  9. Übertragen Sie die Embryonen auf eine neue 10 cm-Schale mit 5-10 ml gekühlter PBS und verlassen auf dem Eis, während die restlichen Dissektionen Abschluss.
  10. Enthaupten die Embryonen mit einer sterilen Pinzette. Schneiden Sie vorsichtig die Mittellinie des Embryos mit einer sterilen Schere und Pinzette nach unten, von der enthaupteten Bereich Starten des Bauches zu öffnen. Position Zange unterhalb ter inneren Organe (einschließlich des Herzens, der Leber und Lunge) und kratzen sie 15 aus.
  11. Schneiden Sie das verbleibende Gewebe in kleine Stücke mit einer Schere und Pinzette und in ein 50 ml konischen Röhrchen mit 10 ml Trypsin.
  12. Pipettieren nach oben und unten mit einer 10-ml-Pipette 20-30 mal das Gewebe zu mischen und trennen.
  13. Inkubieren des Gewebes und Trypsin Mischung in einem 37 ° C Wasserbad für 45 min, wirbelnde gelegentlich.
  14. Pipettieren nach oben und unten mit einer 10-ml-Pipette für etwa 5 Minuten um den Inhalt zu mischen.
  15. Hinzufügen trypsiniert Zellen Volumen Standard Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) zu 3x, 10 ug / ml Penicillin / Streptomycin (P / S), und 1 mM L-Glutamin (L-GLUT) in 10-cm-Schalen (~ 10 ml) und die Kultur bei 37 ° C bis zur Konfluenz (ca. 2-4 Tage). Kultur etwa 1-2 Embryonen pro 10 cm Schale.
    HINWEIS: Freeze-Zellen einmal Platten konfluent sind. Gefrorene Zellen können aufgetaut werden und agierten 2 weitere Male. Die Zellen können alternativgeteilt 2 mal vor dem Einfrieren, und dann noch einmal nach dem Auftauen.

2. virale Produktion

  1. 293T-Zellen in 10 cm-Platten mit 10 ml DMEM mit 10% FBS erweitern, 1% P / S und 1% L-GLUT zur Transfektion.
    1. Trypsinize 293T-Zellen mit 2 ml Trypsin, für 5 min bei 37 ° C inkubieren, sammeln die Zellen in 15-ml-Röhrchen, Schleudern bei 300 g, und die Platte in geeigneter Weise (10 ml pro 10 cm Schale).
  2. 24 Stunden vor der Transfektion aufgeteilt konfluenten 10 cm-Platte von 293T-Zellen 1: 6 und Samen in 10 cm Gelatine (0,1% Gelatine in PBS) Platten.
    HINWEIS: 4 Platten pro Virus benötigt werden.
    1. Zu beschichten Platten in Gelatine, fügen mindestens 2 ml der 0,1% igen Gelatinelösung zu beschichten, die Unterseite 10 cm-Platten. bei 37 ° C inkubieren mindestens 20 min. Absaugen Gelatine vor der Zellen auf die Platten hinzufügen.
  3. In einem 15-ml-Röhrchen, fügen Sie 84 ug Plasmid (zB GATA2, Gfi1b, cFos oder ETV6 (subkloniert in die pFUW-TetO vectoder 16) oder FUW-M2rtTA 17), 84 & mgr; g psPAX2, und 42 & mgr; g pMD2.G. Wasser (H 2 O) , um das Volumen auf 2 ml zu begrenzen . Bereiten Sie eine Röhre für jeden Faktor (zB. GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 und FUW-M2rtTA).
  4. Nach Eintragen von 250 ul 2 M CaCl 2 in jedes Röhrchen 2 ml der Mischung aus 84 & mgr; g des ausgewählten Gen enthält (GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 oder FUW-M2rtTA) + 84 & mgr; g psPAX2 + 42 & mgr; g pMD2.G + H 2 O .
  5. Mit Hilfe einer Pasteur - Pipette der Pipettierhilfen eingefügt in, Blasen Freisetzung in die 2,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 - Gemisch. Da die Blasen mit der Spitze eines P1000 gegen die Glaspipette wird erzeugt werden, legen und langsam auszuwerfen 2 ml 100 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethansulfonsäure (BES), Kochsalzlösung auf der Pasteur-Pipette 1 ml auf einmal.
  6. Inkubieren alle Rohre in der Kulturhaube bei Raumtemperatur für mindestens 15 min.
    HINWEIS: Die 4,25 ml Mischung (jetzt DNA + H 2 O + 2M CaCl 2 + BES Salzlösung) aussehen wird leicht bewölkt.
  7. Wenn die Mischung brütet, absaugen Medien aus 293T-Platten und 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-Glutamin + 25 nM Chloroquin hinzufügen.
    HINWEIS: Diese Medien nicht P / S enthalten.
  8. Nach mindestens 15 min Inkubation (oder bis Medien auf 293T - Zellen zu verändern), fügen Sie die 4,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES Salzmischung fallen weise auf die 293T - Zellen pro Röhrchen gleichmäßig über 4 Zellenplatten verteilen (also etwas mehr als 1 ml des Gemisches pro Platte).
  9. Inkubieren Platten über Nacht (O / N) bei 37 ° C.
  10. 24 Stunden nach der Inkubation ersetzen Medien auf allen Platten mit 4 ml Standard DMEM (siehe Schritt 1.15).
  11. Halten Zellen in einem 32 ° C Inkubator von nun an.
  12. 24 Stunden nach dem Schritt 2.10, sammeln Medien in separate 50-ml-Röhrchen. Ersetzen Sie die gesammelten Medien von jeder Platte mit 4 ml Standard DMEM.
    HINWEIS: 4 Platten pro anfänglichen Rohr Mischung Ergebnisse in 16 ml gesammelt Medien.
    1. EINN ach 12 h Inkubation sammeln Medien wieder in die gleichen 50-ml-Röhrchen und ersetzen mit weiteren 4 ml Standard DMEM.
    2. Nach 12 h Inkubation, die Medien zu sammeln und zu den gleichen 50-ml-Röhrchen hinzufügen.
      HINWEIS: jedes Rohr sollte nun enthalten etwa 48 ml Medium, das Virus.
  13. das gesammelte Virus, erste Filter die gesammelten Medien durch 0,45 & mgr; M Low-Protein-Bindung Filter zu konzentrieren.
  14. Gießen die gefilterten Medien mit Virus in virale Konzentration Zentrifugenröhrchen (ca. 16 ml auf einmal).
  15. Spin bei 4.000 × g bei 4 ° C für 25 min und Durchfluss entfernen.
    HINWEIS: Ein kleines Volumen konzentrierter Medien und Virus wird in den Filter sichtbar.
  16. Fügen Sie weitere 16 ml der gefilterten virushaltigen Medien zu dem konzentrierten Medien + Virus Volumen im Filter verbleibende und mischen durch das Rohr zu invertieren.
  17. Spinnrohr wieder bei 4.000 × g bei 4 ° C für 25 min und Durchfluss verwerfen.
  18. Die restlichen gefiltertSammlung der konzentrierten Medien + Virus Volumen links im Filter und mischen durch den Schlauch zu invertieren.
  19. Spin erneut bei 4.000 × g bei 4 ° C für 10-20 min (abhängig von dem Volumen in dem Filter) und sicherzustellen, dass das verbleibende Volumen von konzentriertem Medium + Virus in dem Filter nach links beträgt etwa 1 ml. Wenn mehr als 1 ml konzentrierter Medien + Virus im Filter bleibt, drehen wieder bei 4.000 × g für 1 min und wiederholen, bis 1 ml im Filter verbleibt.
  20. Aliquot 200 ul des konzentrierten Virus in 1,5-ml-Röhrchen und Einfrieren bei -80 ° C oder sofort ab.

3. MEF Reprogrammierung

  1. Pre-Mantel 6 Well-Platten mit 0,5 ml 0,1% Gelatine in PBS pro Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Gelatine den gesamten Bereich des Bohrlochs erstreckt. Legen Sie in einem 37 ° C Inkubator und Inkubation für mindestens 20 min. Nach der Inkubation der Platten zu entfernen und die Gelatine absaugen.
  2. Platte MEFs mit Standard DMEM mit einer Dichte von 25.000 Zellen pro Vertiefung (150.000 Zellenpro 6-Well-Platte) auf der gelierten 6-Well-Platte (n) aus Schritt 3.1 und ermöglichen O / N in einem 37 ° C Inkubator absetzen.
  3. Bereiten Sie eine 100 ul-Virus-Cocktail durch Mischen von 50 & mgr; l M2rtTA und die restlichen 50 ul einer Mischung aus GATA2, Gfi1b, cFos und ETV6 (12,5 ul jeweils).
  4. Absaugen Medien von MEFs und 2 mL Standard DMEM mit 8 ug / ml Hexadimethrinbromid.
  5. O / N bei 37 ° C transduzieren jede Vertiefung der MEF-Platten mit 15 ul des Cocktail-Virus und brüten.
    Hinweis: Dies ist Tag 0 der Reprogrammierung.
  6. Am Tag 1 nach 16-20 h Inkubation ersetzen Medien mit 2 ml frischem Standard DMEM mit 1 ug ergänzt / ml DOX pro Vertiefung.
  7. Bereiten hämatopoetischen Kulturmedien mit Hydrocortison supplementiert (10 -6 M), 100 ng / mL Stammzellfaktor (SCF), 100 ng / ml Fms-verwandte Tyrosinkinase 3 - Ligand (Flt3L), 20 ng / ml Interleukin-3 (IL- 3) 20 ng / ml Interleukin-6 (IL-6) und 1 & mgr; g / ml DOX.
  8. Am Tag 4 aspirate Medien aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS pro Vertiefung.
  9. Absaugen PBS distanzieren Zellen unter Verwendung von 1 ml 0,05% Trypsin pro Vertiefung und die Zellen zu sammeln.
  10. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer, Spin bei 300 g für 5 min, Resuspension in 12 ml hämatopoetischen Medien in Schritt 3.7 beschriebenen und Platte 60.000 Zellen pro 6-Well-Platte auf 0,1% Gelatine beschichtete Platten (2 ml pro Vertiefung, 10.000 Zellen pro Vertiefung ).
  11. Ersetzen Medien mit frischen hämatopoetischen supplementierten Nährböden alle 6 Tage für die Dauer der Kultur (35-36 Tage).
  12. Analysieren Sie entweder Zwischenzellen oder Schwellen hämatopoetischen-ähnlichen Zellen über Immunfärbung 12, FACS - Analyse 8,12, qRT-PCR 12 und mRNA - Sequenzierung 12 den Erwerb von hemogenic endothelialen oder HSC-ähnliche Markierungen und die Genexpression zu bestätigen.

4. Plazentare Aggregation und koloniebildende Einheit (CFU) Assays in Methylcellulose

  1. Präparieren Plazenten von schwangeren C57BL / 6 - Mäuse wie zuvor beschrieben 18 bei E12,5 und halten Gewebe auf Eis.
  2. Um 19 Plazenta Dissoziation beginnen, waschen Plazentagewebe in 2-5 ml 0,2% Kollagenase Typ I in PBS mit 20% FBS und mechanisch mit einer 18G Nadel distanziere durch Passagierung die Plazenta und PBS durch die Nadel einer 5 - ml - Spritze angebracht in mindestens dreimal.
  3. Nach der mechanischen Dissoziation, halten für 1,5 Std Plazentazellen in 2-5 ml Kollagenase-Lösung bei 37 ° C.
  4. Passage-Zellen durch 20-25 G Nadeln auf 5 ml Spritzen mehrmals angebracht weiter distanzieren mechanisch die Plazentazellen.
  5. Filter Einzelzellsuspensionen durch 70 um Zellsiebe.
  6. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und bestrahlen bei 2.000 cGy für mitotische Inaktivierung 20.
  7. 10 ml hämatopoetischen Nährmedien mit 100 ng / ml SCF ergänzt, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, und 10 ng / ml Thrombopoietin (TPO) auf eine 10 cm Gericht.
    HINWEIS: DOX ist in diesem Stadium nicht erforderlich.
  8. Legen Sie ein 0,65-um-Filter direkt auf das hämatopoetische Kulturmedien in der Schale, so dass sie zu schweben ein Flüssigkeits-Gas-Schnittstelle zu schaffen und die Schale beiseite stellen.
  9. Dissoziieren Tag 25 transduziert MEFs (abgeleitet von Schritt 3.11) als 3,8 bis 3,10 in den Schritten und mit 167.000 Zellen der Plazenta-Aggregate aus Schritt 4.6 33.000 der transduzierten MEFs mischen (1: 6-Verhältnis).
  10. Ein Aggregat 18,21, erste Spin - Down der MEF und Plazenta - Zellmischung aus Schritt 4.9 für 5 Minuten bei 300 x g zu erzeugen. Absaugen Medien und Resuspendieren der pelletierten Zellen in 30-50 ul Standard DMEM eine P200-Pipette, die Einzelzellsuspension in die 200 ul nonbevelled Pipettenspitze zu ziehen.
  11. Verschließen Sie die Pipettenspitze mit Paraffinfilm. Legen Sie die blockierten Spitze in einen 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Spin-down für 5 Minuten bei 300 g so ein Pellet bildet sich an der überdachten Ende der Spitze.
  12. Die Spitze aus dem 15-ml-Röhrchen sorgfältig und Ortdie Spitze auf das Ende der P200 Pipette. Entsorgen Sie die Paraffinfilm und extrudieren des Zellpellets auf das Floating-Filter aus Schritt 4.8.
    HINWEIS: Platte höchstens 3 Aggregate pro Filter.
  13. Kultur die Aggregate auf den schwebenden 0,65 um Filter für 4-5 Tage in 37 ° C mit 5% CO 2.
  14. Sammle die Aggregate (höchstens 3 pro Filter) mit einem Zellschaber, kombiniert sie und Verdau mit 0,2% Kollagenase, nach dem gleichen Protokoll wie bei den ganzen Plazenten getan, um die Zellen dissoziiert (Schritte 4,2-4,5).
  15. Nach Dissoziation, waschen Sie die Aggregate mit 2-5 ml PBS mit 5% FBS und Zellen bei 300 g für 5 min Spin-Down.
  16. Resuspendieren der Aggregate in 500 & mgr; l DMEM ohne FBS, P / S, oder L-GLUT. Nehmen Sie das 500 & mgr; l Aufwirbelung und fügen Sie ihn in 3 ml 1% Methyl Medien, ergänzt mit 10 / ml TPO ng, sorgfältig die Bildung von Blasen zu vermeiden. Platte gleichen Volumen dieser Mischung in 3 35 x 10 mm nicht behandelte Kulturschalen fürCFU - Assays 12.
  17. Als Kontrolle wurden bestrahlte Kultur plazentalen Aggregate ohne 4-5 Tage in umprogrammiert MEFs Mischen und in CFU-Assays wie oben 4,7-4,16 in Schritten beschrieben.
    HINWEIS: Diese Aggregate allein keine Kolonien bilden.
  18. Zählen hämatopoetische Kolonien manuell unter dem Mikroskop nach 10-14 Tagen Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  19. Cytospin 22 nahm Kolonien morphologischen Phänotyps von einzelnen Zellen zu zeigen.

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Ergebnisse

Hämatopoese ist ein komplexer Entwicklungsprozess, in verschiedenen embryonalen Standorten beginnt. Hemogenic Endothelzellen befinden sich in diesen Seiten und führen zu HSZ über Zelle 23 Knospung. Dieser Prozess derzeit nicht durch das Platzieren HSZ oder hämatopoetische Vorläufer in Kultur reproduziert werden, wobei eine Methode erforderlich , diese Zellen in vitro , um irgendwie zu erhalten, entweder durch HSPC Expansion ex vivo oder Generation de novo...

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Diskussion

Erzeugen HSPCs de novo aus leicht erreichbar somatischen Zellen bietet eine einzigartige Methode der Hämatopoese in vitro zu untersuchen und die Möglichkeit, potentiell diese Technologie auf das menschliche System anzuwenden. Diese Übersetzung würde ein neues Werkzeug zu studieren menschliche hämatologische Erkrankung in einer Schale zu erzeugen, sowie Drogentestplattformen und Gen-Targeting-Möglichkeiten bieten zu zahlreichen Erkrankungen mit neuartiger Therapeutika oder HSC-Transplantationen behandel...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein NHLBI-Stipendium an K.M. und I.R.L. (1RO1HL119404) unterstützt. Carlos-Filipe Pereira erhielt ein Revson Senior Biomedical Fellowship. Wir danken der Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility und S. D'Souza für die Unterstützung mit Materialien und Protokollen. Wir danken auch den Einrichtungen für Durchflusszytometrie, Genomik und Maus am Mount Sinai.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMInvitrogen11965-092
0,45 μ M FilterCorning430625
Amicon Ultra ZentrifugalfilterMilliporeUFC900324
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-122
L-GlutaminInvitrogen25030-081
FBSGemini's Benchmark100-106
PBSLife Technologies14190-144
18 G NadelnBD305195
20 G NadelnBD305175
25 G NadelnBD305125
Kollagenase Typ ISigmaC0130-100MG
TrypLE ExpressInvitrogen12605-010
Myelocult MedienStammzelltechnologienM5300
SCFForschung & Technik D Systems455-MC
Flt3LR & D Systems427-FL
IL-3R & D Systems403-ML
IL-6R & D Systems406-ML
TPOR & D Systems488-TO
DoxycyclinSigmaD9891-1G
Polybren (Hexadimethrinbromid)SigmaAL-118
Durapore 0,65 μ M MembranfilterMilliporeDVPP14250
Methylcellulose MedienStammzelltechnologienMethocult M3434
HydrocortisonStammzelltechnologien07904
C57BL/6 MäuseThe Jackson Laboratory000664
GelatineSigmaG-1890 100g
pFUW-tetOAddgenePlasmid #20321
Gata2OrigeneMR226728
Gfi1bOrigeneMR204861
cFos AddgenePlasmid #19259
Etv6OrigeneMR207053
psPAX2AddgenePlasmid #12260
pMD2.GAddgenePlasmid #12259
CaCl2SigmaC5670-100g
FUW-M2rtTAAddgenePlasmid #20342
35 mm x 10 mm Kultur GeschirrThermo Scientific171099

Referenzen

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