Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, induzierte pluripotente Stammzellen oder iPSCs aus Melanom-infiltrierenden Lymphozyten zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tumorimmunologie, insbesondere für die Krebsimmuntherapie, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Möglichkeit, humane iPS-Zellen aus tumorinfiltrierenden Lymphozyten zu erzeugen, eine unbegrenzte Anzahl weniger differenzierter tumorspezifischer T-Zellen für die Immuntherapie bereitstellen könnte.

Diese Technik könnte Anwendungen für die Behandlung von metastasiertem Melanom haben, da derzeit das schlechte Überleben von T-Zellen in einer Klinik die Haupteinschränkung der adaptiven T-Zelltherapie darstellt. Diese Methode kann auch bei der Untersuchung des T-Zell-Rezeptor-Repertoires in der Tumormikroumgebung nützlich sein. Das Verfahren wird von Dr. Kumiko Iwabuchi, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert.

Nach der Gewinnung des Tumormaterials wählen Sie fünf bis 20 Gramm Tumorproben aus und verwenden Sie eine Schere, um das normale, feste und feste Gewebe aus den zerbrechlichen und/oder blutigen nekrotischen Bereichen der Tumorproben zu präparieren. Zerkleinern Sie die präparierten Proben so fein wie möglich und verwenden Sie dann einen Dissoziator und ein Dissoziationskit für menschliche Tumore, um die zerkleinerten Tumorstücke gemäß den Anweisungen des Herstellers in eine Einzelzellsuspension zu dispergieren. Am Ende der Dissoziation filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie das Sieb zweimal mit zwei Millilitern RPMI 1640.

Pelletieren Sie dann die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie die Zellen wieder in 10 Millilitern frischem T-Zell-Medium. Um die Zellen nach Dichtegradient zu trennen, legen Sie zuerst 30 Milliliter 75%ige Gradientenlösung, gefolgt von 10 Millilitern 100%iger Gradientenlösung in DPBS ohne Kalzium oder Magnesium, in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Überlagern Sie dann die Zellen vorsichtig mit der Gradientenlösung, achten Sie darauf, die Schichten nicht zu stören, und zentrifugieren Sie die Probe.

Am Ende der Trennung werden die angereicherten tumorinfiltrierenden Lymphozyten oder TILs an der Grenzfläche zwischen den Gradientenlösungen in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen mit 20 bis 30 Millilitern frischem DPBS gewaschen. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 10 Millilitern frischem T-Zell-Medium, geben Sie dann zwei Milliliter TILs pro Vertiefung in fünf Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte und ergänzen Sie die TIL-Kulturen fünf Tage lang mit rekombinantem humanem IL-2 bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie am fünften Tag die Hälfte des Mediums in jeder Vertiefung und danach alle zwei bis drei Tage.

Wenn die Kulturen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen, verwenden Sie eine Pipette, um die Zellen in jeder Vertiefung vorsichtig wieder zu suspendieren, und teilen Sie die Kulturen im Verhältnis eins zu zwei in einem Milliliter frischem T-Zell-Medium, das mit rekombinantem humanem IL-2 ergänzt wird. Zur Herstellung von Mitomycin-C-behandelten SNL-Feederplatten werden zunächst SNL-Feederzellen in 10 Millilitern SNL-Feederzellmedium auf einer mit 0,1 %iger Gelatine beschichteten 10-Zentimeter-Schale kultiviert. Wenn die Zellen zu 80 bis 90 % konfluent sind, behandeln Sie die Feeder zwei Stunden und 15 Minuten lang mit Mitomycin C bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation zweimal mit fünf Millilitern DPBS. Nehmen Sie dann die Futterautomaten mit zimmerwarmem Trypsin-EDTA ab. Nach einer Minute wird die Dissoziationsreaktion mit 4,5 Millilitern frischem SNL-Feedermedium neutralisiert und die Einzelzellsuspension zur Zentrifugation in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Suspendieren Sie das Pellet zur Zählung in 10 Millilitern frischem SNL-Feeder-Zellenmedium. Dann 1,5 mal 10 in die sechs SNL-Feederzellen pro Vertiefung in 10-Zentimeter-Schalen anrichten und die Kulturen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid bis zu drei Tage lang inkubieren. Um die iPSCs mit dem Sendai-Virus zu erzeugen, übertragen Sie fünfmal 10 bis die fünften TILs pro Well auf eine neue Sechs-Well-Platte, die mit Maus-Anti-Human-CD3 in zwei Millilitern frischem T-Zell-Medium beschichtet ist, ergänzt mit rekombinantem humanem IL-2 und löslichem Maus-Anti-Human-CD28.

Aktivieren Sie die TILs im Zellkultur-Inkubator für fünf Tage. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Kulturen zum Zählen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen zu sammeln. Als nächstes wird eins mal 10 bis das fünfte TILs pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte übertragen, die mit anti-humanem CD3 in 500 Mikrolitern Reprogrammierungsmedium beschichtet ist, ergänzt mit löslichem Maus-Anti-Human-CD28 in rekombinantem humanem IL-2.

Nach 24 Stunden im Zellkultur-Inkubator zählen Sie die Zellen in jeder Vertiefung auf und bereiten Sie mehrere Volumina des Virus bei der entsprechenden Infektionsvielfalt vor. Geben Sie dann eine Mischung aus Sendai-Virusvektoren mit 10 bis 20 MOI in das entsprechende Volumen des Mediums und geben Sie das virushaltige Medium in jede Vertiefung der TILs. Zur Bestimmung der Transduktionseffizienz wird das berechnete Volumen des Sendai-Virus-GFP in eine Vertiefung mit aktivierten TILs gegeben und die Kulturen für 24 Stunden in den Inkubator zurückgestellt.

Am nächsten Tag betrachten Sie die mit dem Sendai-Virus GFP infizierten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie, um die Infektionseffizienz der Transduktion abzuschätzen. Die viral infizierten Zellen aus jeder Vertiefung werden zur Zentrifugation in ein 15-Liter-Röhrchen gepoolt und das Pellet in 0,5 Millilitern humanem embryonalem Stammzellmedium resuspendiert, das mit embryonalem Stammzellmedium von Primaten und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor ergänzt wird. Als nächstes fügen Sie den Zellen 9,5 Milliliter frisches humanes embryonales Stammzellmedium hinzu und übertragen die Suspension auf eine mit Mitomycin C behandelte SNL-Feeder-Zellplatte.

In diesem Bild sind TILs am Tag 21 der Kultur mit rekombinantem humanem IL-2 zu sehen, die bereit sind, mit anti-CD3 und CD28 aktiviert zu werden. Die TILs können bei einer Infektionsvielfalt von 20 mit dem Sendai-Virus transfiziert werden. Hier wird ein typischer pluripotenter Klon auf SNL-Feederzellen 18 bis 21 Tage nach der Sendai-Virus-Infektion gezeigt.

Wie in diesem repräsentativen Karyogramm zu sehen ist, weisen die von TIL abgeleiteten iPSCs einen normalen Karyotyp auf. Die Immunfluoreszenzfärbung zur Bestätigung der Pluripotenzmarkerexpression auf TIL-abgeleiteten iPSCs zeigt, dass diese Zellen die erwarteten Expressionsniveaus typischer Pluripotenzmarker aufweisen. Darüber hinaus sind iPSCs, die aus Melanom-TILs gewonnen werden, in der Lage, Teratome zu bilden, die eine Vielzahl von Zellen aus den drei Keimblättern enthalten.

Darüber hinaus behielten TIL-abgeleitete iPSCs ihre T-Zell-Rezeptor-Rearrangements bei, die durch Kapillarelektrophorese beurteilt wurden. Unsere erste Entwicklung, diese Technik, ebnete Forschern auf dem Gebiet der Onkologie den Weg, wirksamere Krebsimmuntherapien für Patienten mit metastasiertem Melanom zu erforschen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Proliferation und Lebensfähigkeit der T-Zellen vor einer Sendai-Virus-Infektion zu überprüfen und die Infektionseffizienz anhand der Kontur-GFP-Expression zu bewerten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche TIL-Zellen aus Melanom-TILs generiert.