Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Durchführung einer subtraktiven Musterung von lebenden Zellmonoschichten auf einer Oberfläche. Dies wird durch eine lokale und selektive Lyse adhärenter Zellen mit einer mikrofluidischen Sonde (MFP) erreicht. Das aus lokalen Regionen gewonnene Zelllysat kann für die nachgelagerte Analyse verwendet werden, was molekulare Profiling-Studien ermöglicht.

Abstract

Die mikrofluidischen Sonde (MFP) erleichtert auf biologische Substrate lokale Chemie Durchführung von Nano- Flüssigkeitsmengen zu beschränken. Verwendung einer bestimmten Implementierung des MFP, die hierarchische hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC) werden mehrere Flüssigkeiten in Kontakt mit einem Substrat gebracht gleichzeitig. Lokale chemische Wirkung und flüssige Formgebung der hHFC verwendet wird, wird ausgenutzt, indem lokal Lyse und Entfernen von Zellen Zellmuster zu erzeugen. Durch Verwendung des Scan-Fähigkeit des MFP, benutzerdefinierte Muster der Zellmonoschichten erzeugt werden. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, Echtzeit und räumlich kontrollierten Zell Strukturierung, die eine selektive Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionsstudien ermöglichen kann.

Introduction

In ihrer natürlichen Umgebung wahrnehmen Zellen in biologischen Geweben eine Reihe von biochemischen und physikalischen Signale lenken ihr Wachstum, Organisation und Entwicklung. Diese Hinweise zu verstehen, müssen selektive Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Dies erfordert die Entwicklung von Verfahren zur Strukturierung Zellmonolayern. Methoden zur geometrisch getrennten verschiedenen Zelltypen in Kultur (Strukturierung) ermöglichen breite Studien von physikalischen und chemischen Signale in der Zellbiologie. Die meisten der derzeitigen Ansätze zur Strukturierung Zellschichten ^{von 1 bis 4} sind abhängig von Ablagern zell Adhäsionsproteine ​​auf Oberflächen oder mit mikrofabrizierten Schablonen für das selektive Wachstum auf Substraten. Im Gegensatz dazu zeigen wir hier ein Verfahren zur schnellen Musterzellmonolayern in situ, dh Zellen in Kultur, die von Zellen in ausgewählten Bereichen der Monoschicht entfernt werden . Methoden, die solche subtraktiven Strukturierungs ⁵ durchführen ^{- 9} usually erfordern spezielle Substrate, Oberflächenbehandlung, komplexe Operation, physikalischen Kontakt oder Ablation mittels eines Lasers, unbeabsichtigt die lebenden Zellen zu beeinflussen. Wir verwenden hier eine mikrofluidische Sonde (MFP) ^10,11, ein berührungsloses Scannen mikrofluidischen Technologie , die hydrodynamisch eine Flüssigkeit auf ein Substrat beschränkt. Ein wichtiger Bestandteil des MFP ist der mikrostrukturierten Kopf enthält Mikrokanäle (Abbildung 1). Die zugehörige Plattform besteht aus Spritzenpumpen für die Flüssigkeitssteuerung, Stufen zur Abtaststeuerung und ein invertiertes Mikroskop zur Visualisierung und Rückkopplung (Abbildung 2). In seiner Grundkonfiguration umfasst das MFP Kopf zwei Mikrokanäle mit Öffnungen an der Spitze, eine Verarbeitungsflüssigkeit und die andere zum Absaugen der injizierten Behandlungsflüssigkeit zusammen mit einigen Tauchflüssigkeit (3A) eine zur Injektion. Während MFP Betrieb ist der Scheitelpunkt in einem festen Abstand von dem Substrat. Wenn die Absaugströmungsleitung Rate (Qa) ist sufficiently höher als die Einspritzströmungsgeschwindigkeit (Q _i), das heißt Q _a: Q _i ≥ 2,5, wird die Behandlungsflüssigkeit auf dem Substrat beschränkt. Dies führt zu einer hydrodynamischen Strömungs Confinement (HFC). Der Bereich, in dem die Behandlungsflüssigkeit in direktem Kontakt mit dem Substrat ist, wird die Aufstandsfläche bezeichnet. Bei typischen Betriebsbedingungen, die Strömung der Behandlungsflüssigkeit innerhalb der HFC durch eine niedrige Reynoldszahl gekennzeichnet ist (Re ≈ 10 ^-2) und eine hohe Peclet - Zahl (Pe ≈ 10 ^2). Dies bedeutet, Flüssigkeit fließt in laminaren Regime mit Konvektion die primäre Form der Massentransfer von chemischen Spezies zu sein. ^{14 -} Die numerischen und analytischen Modelle zur Strömungshaft sind an anderer Stelle ¹² beschrieben.

In dieser Arbeit verwenden wir den Ansatz der gleichzeitig mehrere Verarbeitungsflüssigkeiten zu beschränken, die hierarchische HFC (hHFC) ¹⁴ bezeichnet wird. Zur Umsetzung hHFC mit dem MFP, zwei additional Öffnungen benötigt, um eine sekundäre Quelle der Einspritzung und Aspiration zu liefern. Dies ermöglicht es uns, eine Flüssigkeit, die in einer zweiten Flüssigkeit zu begrenzen. Die inneren (processing) Flüssigkeit Vorteile werden die von Streu Ablagerungen auf dem Substrat durch die äußere (Abschirmung) Flüssigkeit abgeschirmt. Darüber hinaus ermöglicht hHFC Betrieb in zwei Modi: (i) die verschachtelten Modus, in dem die Behandlungsflüssigkeit in den inneren HFC Kontakt mit der Oberfläche (3B), und (ii) der gedrängten Modus, in dem die innere Flüssigkeit verliert den Kontakt und nur die äußere Flüssigkeit in Kontakt mit dem Substrat (3C). Die Umschaltung zwischen den beiden Betriebsarten ermöglicht es Benutzern zu bewirken oder Bearbeiten des Substrats zu stoppen , und wird durch Steuern des Kopf-an-Oberfläche erzielt Spalt oder durch das Verhältnis zwischen den Einspritzströme ändert (Q _i2 / Q _i1). Für eine gegebene Kanalgeometrie kann die Aufstandsfläche der Behandlungsflüssigkeit auf dem Substrat durch Modulieren Strömungsbedingungen (3D) gesteuert werden. Sodium hydroxid (NaOH) wird als die innere Behandlungsflüssigkeit verwendet, um die Zellen zu lysieren und das Lysat kontinuierlich von der Oberfläche angesaugt wird. Da die chemischen Wirkungen der Verarbeitungsflüssigkeit auf die innere HFC Fußabdruck lokalisiert sind, bleiben die benachbarten Zellen ungestörte, die Raum-Zeit-Studien von Zell-Zell-Wechselwirkungen ermöglicht. Die Scan - Funktionalität des MFP ermöglicht die Erstellung von benutzerdefinierten Geometrien von Zellmuster (Abbildung 4). Ferner nimmt die Wahl der NaOH als Behandlungsflüssigkeit stromabwärts der DNA - Analyse (Abbildung 7).

Protocol

1. MFP Leiter und Plattform Reinigung und Vorbereitung

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet vertikal orientierten Silizium-Glas - Hybrid - MFP ^15,16 leitet. Die Siliciumkomponente des Kopfes enthält die Mikrokanäle, die bis zu einer Tiefe von 100 um geätzt werden. Die geätzte Silizium auf Glas geklebt anodische Bonden verwendet wird. Die Kanalausführung umfasst ein Muster von sechs Kanälen aus, jeweils zwei für die Injektion und Aspiration und zwei zum Einspritzen der Eintauchflüssigkeit (Abbildung 1). Die Kanäle zum Injizieren Tauchflüssigkeit verwendet aufzufüllen die Medien die biologische Probe umgibt, wodurch Verluste durch Aspiration und Verdunstung zu vermeiden. Die inneren Kanäle und äußeren Kanäle in der aktuellen Arbeit verwendet werden, sind 100 × 100 & mgr; m und 200 × 100 & mgr; m auf. Nach der Herstellung und Verarbeitung, MFP Köpfe mit klaren Kanäle und poliert Scheiteln erhalten.

1. Herstellung der Pumpstation und Fluid-Gerät
   1. Verwenden Sie Kapillaren mit einem 1/16 '' (1,59 mm) Außendurchmesser und 0,02 '' (0,51 mm) Innendurchmesser für alle Schläuche an den Spritzen verbunden. Vary Kapillarengröße auf Anwendung basiert und erhalten die entsprechenden Anschlüsse und Armaturen der MFP-Kopf mit den Spritzen zu verbinden. Verwenden Sie Reinstwasser wo Verdünnungen notwendig sind.
   2. Saubere Spritzen (250-500 & mgr; l Volumen) und Spritzenkolben durch Beschallung in 0,5% Bleichlösung in Reinstwasser vor to- und Post-Experimente mit lebenden Zellen. Spülen Sie sie gründlich mit Wasser. Füllen Sie sie mit Wasser mit ihren Spitzen vollständig in ein Wasserbad getaucht und Absaugen des Kolbens verwendet wird. Spülen Sie die Flüssigkeit, während sie innerhalb des Wasserbades mit dem Spritzenwelle die Dichtung am Ausgang der Spritze zu kontaktieren. Wiederholen Sie aspirieren und Spülung, bis keine Luftblasen in der Spritze Spalten gesehen.
   3. Schließen Sie Spritzen an die Spritzenpumpen mit Luer-Lock-Anschlüsse. Verwenden Sie ein Schaltventil auf die montiertePumpen der Flüssigkeit aus der Spritze auf einen von zwei Kapillaren zu richten entweder an den MFP Kopf oder an den Flüssigkeitsbehälter (Abbildung 6) führt. (Wenn kein Schaltventil zur Verfügung siehe Abschnitt 1.4.4). Purge beide Kapillaren mit Wasser aus den Spritzen bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 10 bis 50 & mgr; l / min, abhängig von der Größe der Spritze, bis etwa 10 & mgr; l Wasser werden in den Spritzen links.
   4. Pre-setzen Sie die gespülten Kapillaren in einen geeigneten mikrofluidischen Stecker / Adapter, der mit den Kanal Vias im Kopf - Schnittstellen (zB M1 - Anschluss - siehe Materialien).
2. MFP Kopf Vorbereitung
   1. Reinigen Sie den MFP Kopf durch Beschallung mit Glaswaren Reinigungsmittel für Standard-Reinigungs oder 0,5% Bleichmittel für strenge Reinigung, für 5 min. Purge Kanäle mit Wasser durch den Scheitelpunkt in Wasser getaucht und Anlegen von Vakuum an die Vias.
   2. Untersuchen Sie Kanäle unter einem Stereomikroskop für mögliche Hindernisse (Verstopfung) und reTorf den vorherigen Schritt, falls erforderlich.
   3. Montieren Sie den sauberen Kopf auf dem Kopfhalter und schrauben Sie den Stecker mit dem vorher eingesetzten und gespült Schlauch auf den Kopf. Schrauben Sie den Kopfhalter auf die Z-Stufe, die für die Kontrolle der Spaltabstand zwischen dem Kopf und der Zellschicht verwendet wird.
3. Kalibrieren der Scan - Stufen des MFP - Plattform
   1. Führen Endpunkt Kalibrierung der X-, Y- und Z-Phasen vor den Kopf zu verbinden mit der Plattform, nach dem Protokoll des Herstellers mit einem geeigneten Software-Schnittstelle. Kalibrierte Stufen Genauigkeit sorgen für die MFP-Kopf bei der Positionierung.
   2. Erhalten eines rohen Null Spaltabstand (Nullstellen) durch den MFP-Kopf über eine Kammer gleiten, ohne Zellen zu bringen und langsam in 5 & mgr; m Stufen hinabsteigen. Sonde nach Kontakt mit dem Substrat, sollte Newtonsche Ringe beobachtet werden. Dies ist eine grobe Schätzung. Eine genaue Position ist nach dem Einstellen der Koplanarität der Sonde Spitze zum substrat erhalten werdene.
   3. Um Koplanarität der Sonde Spitze zu gewährleisten, stellen Sie die Neigung des Kopfes eines Goniometers (an der Schnittstelle des Kopfes und die Z-Stufe) verwendet wird. Wenn gebildet sicherzustellen , dass die Newtonsche Ringe symmetrisch sind (Abbildung 1). Bewegen Sie den MFP Kopf 20 & mgr; m entfernt von dem Substrat und passen Neigung Goniometer verwendet wird. Wiederholen Sie absteigen, Nullstellen und Neigungsverstellung, bis die Newtonsche Ringe sind symmetrisch auf Kontakt. Mit eingestellt Neigung, stellen Sie die z-Position, die Ringe als Null symmetrische Newton erzeugt.
      HINWEIS: Die Z-Stufe steuert den Kopf-zu-Substrat - Abstand, während der XY - Tisch das Abtasten des Substrats (2) steuert. Eine detaillierte Erklärung finden Sie in unserer früheren Arbeit ¹⁴ zu finden.
4. Chemische Präparate für die lokale Entfernung von Zellschichten
   Achtung: Gegebenenfalls Verwendung Sicherheitsausrüstung (zB Nitril - Handschuhe, Schutzbrille) für die Chemikalien vorbereitet. Verwenden Sie einen Rauch hood gegebenenfalls zur Herstellung von Lösungen. Bereiten Sie alle Chemikalien und Puffer mit Reinstwasser als Verdünnungsmittel.
   1. Vorbereitung 50 mM NaOH - Lösung als Behandlungsflüssigkeit für die inneren Einspritzkanal (i2 mit Strömungs Q _I2 in Abbildung 1).
   2. Bereiten Sie die Extraktionspufferlösung für die äußeren Einspritz (i1 mit Strömungs Q _I1 in 1) erforderlich ist , bestehend aus 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5% Tween 20 und 10 uM Rhodamin B in 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan bei pH 8. Zur Spülung verwenden Wasser in den Streben Spritzen.
   3. Filtern Sie alle Lösungen, die eine 0,2 & mgr; m Spritzenfilter. Degas alle gefilterten Lösungen einen Exsikkator, bis die gelöste Luft Anschlag auf die Oberfläche mit sprudelnden.
   4. Mit der Ablaufleitung an den Spritzenpumpen verbunden sind, spülen Sie das Restwasser und aspirieren die entgasten Lösungen in die Injektionsspritzen bei 40 & mgr; l / min, bis die Spritzen voll sind (250 oder 500 & mgr; l).Dadurch wird sichergestellt, blasenfreie Füllung der Spritzen, Anschlüsse und Kapillaren. Die Spritze-Umschaltventil-Zwei Kapillarsystem ermöglicht Füllung der Mitte experiment Spritzen. In Ermangelung eines solchen Schaltventil, trennen Sie die Kapillaren aus dem Kopf und füllen die Kapillaren und die Spritze durch die entgaste Lösungen abgesaugt, bevor sie den Kopf wieder anschließen.
   5. die Verarbeitung Aspirieren und Flüssigkeiten durch die Kapillaren ermöglicht die Verwendung von kleinen Mengen während des Betriebs abgeschirmt werden. Wenn die Chemikalien in großen Mengen hergestellt werden, füllen Spritzen mit den erforderlichen Lösungen direkt. Zum Beispiel, dass die Bestrebung Spritzen Wasser enthalten, können mit diesem Ansatz gefüllt werden.
   6. Spülen Sie die Kapillaren an den MFP Kopf mit den Flüssigkeiten für jeden Kanal zugewiesen, wie in 1.4.1 und 1.4.2 definiert.
      HINWEIS: Die Extraktionspufferlösung schirmt das NaOH in der inneren Einschluss und der Rhodamin-Komponente in dem Puffer ermöglicht die Visualisierung von the hHFC während des Betriebs.
   7. Wenn die Zellen über konfluent sind, mit Zellaggregate auf der kultivierten Fläche erscheinen, ergänzen das Extraktionspuffer mit 10% Proteinase K. Diese ergänzt die Wirkung von NaOH auf diese Aggregate durch denaturierte Proteine ​​auflösen als das Lysat die Bestrebung Kanäle gelangt. Dies verhindert ein Verstopfen der Kanäle während des Betriebes.
5. Herstellung von Zellmonoschichten auf chamber slides
   Achtung: Verwenden Sie eine Zellkultur Haube für die Kultivierung von Zellen und Griff Ausrüstung gemäß Vorschriften der Biosicherheitsbeauftragten des Labors festgelegt. Hinweis besonderen Anforderungen bestimmter Zelllinien und Anpassung Protokoll und Geräte entsprechend.
   1. Verwendung der Zellkultur - Inkubatoren (bei ​​5% CO ₂ und bei 37 ºC) für die Kultur und Expansion von Zellen strukturiert werden. Führen Sie die Erweiterung mit Standard - Zellkulturprotokolle ^17,18 in T - Kolben. Verwenden Kulturmedien nach Anforderungen der spezifischen cell Leitung (zB Serum und Antibiotikum ergänzt DMEM zur Kultivierung von MCF7 und MDAMB 231).
   2. Bei Erreichen in den Kulturflaschen Zellkonfluenz, trypsinize und Zellen und seed 2 × 10 ⁵ Zellen / cm ² in jeder der 2-Kammer - Objektträger zur Strukturierung und die Kultur mehr als 48 Stunden zu sammeln. Verwenden Sie die Zellen in einer der Kammern als eine Kontrolle für das Zellwachstum und Lebensfähigkeit.
   3. Zellkonfluenz an den Kammer gleitet, Inkubation der Zellen für 45 min mit 500 ul Zell-tracker Farbstofflösung (zB grün - CMFDA oder orange - CMRA) Bei Erreichen von 10 & mgr; M Konzentration hergestellt in Serum-freiem Medium. Dies wird für die Zell Visualisierung während der Strukturierung erfolgen. Waschen Sie die markierten Zellen mit PBS, indem Sie vorsichtig jede Kammer mit einer Pipette gespült und anschließend Kultur die Zellen in serumhaltigem Medium für die Musterexperimente.
   4. Besorgen Sie sich ein Referenzbild der Zelle-tracker-gefärbten Zelloberfläche zum Zwecke der Zellzählung. Dies geschieht, um sicherzustellen,Konfluenz der Zellschicht. Darüber hinaus dient es als Hilfe für die Quantifizierung Experimente wenn Probenrückgewinnung und die DNA-Analyse Ziele sind.
      HINWEIS: In dem Fall, dass die Lebensfähigkeit der Zellen während der Strukturierung beurteilt werden wird, können die Zellen mit einem Live / Dead Zytotoxizität Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt werden.

2. Erstellen der Hierarchical hydrodynamischem Fluss Confinement (hHFC)

1. Bewegen Sie den MFP über die Zellschicht zu einem Spaltabstand von 50 & mgr; m aus dem Glasträger. Dieser Spaltabstand während sichergestellt Kontakt des hHFC erklärt auch einschichtige Oberfläche und Dickenvariation.
2. Injizieren NaOH bei 6 bzw. 8 & mgr; l / min durch i2. Bewerten Sie anderen Flussraten (dh Q _I1, Q _A1 und Q _A2) 3 , um die Flussregeln in Abbildung verwendet wird .
3. Modulieren der Größe des inneren HFC durch das Verhältnis von Q _I2 / _I1 Q Ändern der Injektionsspritzen verwendet wird .Beispielsweise verwenden , um eine Q _I1 zwischen 1,3 & mgr; l / min und 4 & mgr; l / min, mit dem Q _I2 bei 8 & mgr; l Fest / min, die aus 150 in einer NaOH - Bilanz führt - 300 Zellen (100 bis 200 & mgr; m ² / Zelle) ( Figur 3D).
4. Injizieren Vollmedium von den äußersten Öffnungen auf dem MFP Kopf mit einer Strömungsrate von 20 & mgr; l / min für die Verdampfung der Medien zu berücksichtigen, und Aspiration während des Betriebs des hHFC.

3. Patterning-Zellmonolayern hHFC Verwendung

Hinweis: Die Scanmuster legt die Bereiche der Zellschicht, wo die Zellen extrahiert werden (subtraktiven Strukturierung), die restlichen Zellen verlassen spezifische biologische Fragen zu studieren. Dieses Muster kann gerade Linien oder eine Reihe von Punkten, beispielsweise. Komplexe Muster erfordern Entwurf eines geeigneten Abtasttrajektorie. Zum Beispiel stellt ein kariertes Abtastbahn ein Gitter von Zellflächen (beispielsweise in 4A gezeigt ), die die Wirkung verschiedener Stimuli an Zellen in verschiedenen Plätzen studieren würde es ermöglichen, während in enger Nachbarschaft zu sein. Diese Muster können die Kontrolle über die XY-Stufen der Plattform erstellt werden, in dem die Steuerungssoftware Scripting von Scan-Trajektorien für die MFP-Kopf über die Zellschicht ermöglicht.

1. Die Bühne Software den Sondenkopf über der Zellschicht in benutzerdefinierten Muster (durch Setzen X, Y und Z-Koordinaten) bei einer Abtastgeschwindigkeit von 10 um / s zu einem Spaltabstand von 50 & mgr; m abzutasten.
2. Mit der verschachtelten hHFC in Betrieb und in Kontakt mit der Monoschicht, scannen Sie den MFP mit einer Flugbahn des gewünschten Musters strukturiert Zellentfernung zu bewirken.
3. Für eine Co-Kultur nach dem ersten Typ Entfernung Zelle, eine andere Zelllinie Samen, die Lücken zu füllen, mit den Methoden in Kapitel 1.5. Bewegen zwischen verschachtelten und kniff Modi (durch Spaltabstand zu erhöhen, zum Beispiel) Zellentfernung zu steuern.
   HINWEIS: Die Scan-Geschwindigkeit müssen möglicherweise Untersu seingated für andere Zelllinien. Die Scan-Geschwindigkeit in dieser Demonstration Effekte komplette Zellentnahme über die gescannten Bereiche für die verwendeten Zelllinien verwendet.

4. Downstream Processing zur Probenahme und DNA-Amplifikation

1. Bereiten Sie die Probenentnahmestation für Downstream-Analyse des Lysats. Für die Probenentnahmestation, verwenden Sie ein 3D-8-Streifen PCR Rohrhalter gedruckt. Alternativ wählen Sie einen geeigneten Rohrhalter als diesen Adapter zu dienen, die im Scanbereich montiert wird der Kopf außerhalb des Substrats fähig ist. Wischen den Rohrhalter mit 70% Ethanol oder einer anderen Oberfläche Dekontaminations basierend auf der Stringenz für die Anwendung erwünscht ist. Verwenden Sie einen magnetischen Clip auf dem Rohrhalter es auf den Substrathalter zu befestigen.
2. Nach der Probenentnahmestation vorbereiten, positionieren Sie den MFP Kopf 100 & mgr; m von der einschichtigen. Beginnen Sie den hHFC mit 50 mM NaOH-Lösung als Behandlungsflüssigkeit für die innere Injektionskanal mit Durchflussraten von 1 Betrieb, 6, -7 Und -17,5 & mgr; l / min für Q _I1, Q _I2, Q _A1 und _A2 Q beziehungsweise.
   1. Sobald die Strömungs Confinement (in ca. 10 sec) stabilisiert hat, steigen Sie den Sondenkopf mit einem Spaltabstand von 50 & mgr; m durchzuführen NaOH basierten lokalen Lyse des ausgewählten Subpopulation von Zellen mit dem hHFC. Nach Lyse der Subpopulation abgeschlossen ist (ca. 30 sec pro Stellfläche), richten den Kopf in Richtung der Rohre in der Entnahmestation. Werfen Sie die gesammelten Lysat in die PCR - Röhrchen direkt (Abbildung 6).
3. Zur Weiterverarbeitung des Lysats, neutralisieren zuerst den pH-Wert der Lösung durch das Lysat mit Tris-Puffer Mischen (1: 1). Nach der Neutralisierung Wärme für 30 Minuten das Lysat bis 95 ºC. Dann direkt das Lysat in ein Standard-qPCR-Workflow laden, wie durch Lieferanten des Gerätes eingestellt.

Results

Das beschriebene Protokoll zur schnellen subtraktive Musterbildung von Zellmonoschichten demonstriert eine Mehrkomponenten MFP - Plattform (1 und 2). Das Protokoll verwendet die hierarchische hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC; Abbildung 3) , um lokal zu behandeln und zu entfernen Zellen aus Zellmonolayern mit NaOH als Verarbeitungsflüssigkeit. Die hHFC Konfiguration umfasst eine innere und eine äußere HFC HFC. Die beschränkte NaOH in der inneren hHFC führt chemische Wirkung und Scherung auf den Zellen in Kontakt. Innerhalb dieser Ausleuchtzone werden die Zellen homogen auf die chemische Einwirkung von NaOH ausgesetzt, Konvektion angetriebene Massentransfer aufgrund innerhalb und mit vernachlässigbarer Diffusion zu dem Bereich außerhalb der Begrenzung. Die Scher auf die Zellen auf der anderen Seite, kann durch Variieren der Strömungsrate des NaOH verändert werden. Um die Betriebsparameter zu vereinfachen, haben wir uns für chemische Wirkung die dominante Mechanismus der Zellentnahme im Vergleich zur Scher zu machen. Nachschätzen die Scherkraft durch die hHFC auf die Oberfläche aufgebracht wird, ein Finite-Elemente-Modell wurde mit Comsol Multiphysics 5.0 gebaut. Simulationen wurden mit dem CFD-Modul für laminare Strömungen laufen. Zwei Einlassrandbedingungen zu den Einspritzöffnungen der Geometrie und zwei Austrittsrandbedingungen an die Bestrebung Öffnungen (Abbildung 5) wurden für den Bereich der Strömungsraten und Abmessungen der Öffnung in der aktuellen Demonstration verwendet angewendet. In dem Modell erhalten, diktierte die Flussregeln der Scherprofil, während die Strömungsgeschwindigkeiten die Größe der Scher auf der Oberfläche definiert. Praktisch bestimmt eine Kombination von beiden, wenn die hHFC Kontakte an der Oberfläche. Wenn man sich diese Faktoren im Auge, setzen wir für den Betrieb eine Reihe von Durchflussraten, um herauszufinden, um chemisch dominante Zellentfernung zu erhalten. Um eine hHFC zu erzeugen, verwenden wir den Fluss der Regel von insgesamt Streben nach Injektionsflussrate-Verhältnis von 3,5. Die anderen Flussregeln verwendet wurden definiert innerhalb der Aspiration Kanäle zu verstopfen, zu minimieren,was durch denaturierte Proteine ​​verursacht werden das Festhalten an den Kanaloberflächen. Verwendung des entwickelten Modells, fanden wir Strömungsgeschwindigkeiten von 5 bis 10 & mgr; l / min übersetzen zu einer Scherspannung zwischen 1 und 3 N / m ^2. Ohne die chemische Wirkung von NaOH, beispielsweise im Falle der Extraktionspuffer, würde die Scherspannung nicht hoch genug sein , um die Zellen ¹⁹ zu entfernen. Innerhalb des beobachteten Bereichs, bemerken wir , dass Betrieb bei höheren Flußraten ist praktischer zu Störungen im Strömungspfad aufgrund bei niedrigen Strömungsraten aspiration (dh Q _I2 <4 & mgr; l / min) aufgrund von Zelltrümmern in den Kanälen.

In Anbetracht der untersuchten Scherprofil und praktischen Erwägungen Strömungs NaOH Raten (Q _I2) von 6 und 8 & mgr; l / min für die Musterungsexperimente und Q _I1, Q _A1 und Q _A2 entsprechend den Flussregeln in Abbildung 3 gezeigt ist, verwendet. Das Verhältnis Injektionsströme (Q _I2 / Q _I1) ermöglicht us , um die Größe des durch Autebert erarbeitet hHFC Fußabdruck (3D und 4B), mit dem zugrunde liegenden Prinzip modulieren et al. ^14. Unter Verwendung der flüssigen Formfähigkeit des hHFC gekoppelt mit hochauflösenden Scan - Fähigkeit von MFP - Plattform zeigen wir , lebenden Zellen Gittergenerierung bei mehreren Skalen und zeigen weiterhin die Anwendung des bestimmten Protokolls in den Entwicklungs Co-Kulturen (4C).

Die Plattform ermöglicht es uns auch, Probenlysat Retrieval für Downstream-Analyse durchzuführen. Um die Qualität des erhaltenen Lysats zeigen, probierten wir lokal lysierten Zellen aus einem und fünf Fußabdrücke in zwei unabhängigen Experimenten, die Veränderung der DNA - Mengen zeigt , aus dem Lysat gewonnen (Abbildung 7). Hier stellen wir amplifizierte im Lysat unter Verwendung von β-Actin-Primer DNA enthielt (vorwärts: GGATGCAGAAGGAGATCACT und Reverse: CGATCCACACGGAGTACTTG ) Unter Verwendung von 4 ul des neutralisierten Lysats in jeder PCR-Reaktion.

Abbildung 1. Module des MFP - Plattform und den Kopf. (A) Die operativen Module der Plattform umfassen Spritzen, Motortische und einen Controller motorisiert. Der MFP ist mit einem motorisierten Z-Stufe verbunden, um den Spaltabstand zwischen dem Kopf und dem Substrat zu steuern, und der Substrathalter zu dem X- und Y-Motorstufen, welche die Scansystem befestigt ist. (B) Der MFP Kopf fluidischen Vias hat die Pumpstation zu verbinden, Befestigungslöcher , den Kopf auf die Z-Bühne zu montieren, und die Kanäle, die die polierte Spitze austritt. Die Spitze wird coplanar zu der Zellkultursubstrat. Symmetric Newton'schen Ringe kann beobachtet werden, wenn die Spitze und das Substrat koplanar sind und in Kontakt. p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. MFP - Plattform. Die hochauflösende Scan - Plattform ist mit einem bearbeiteten Kopfhalter Schnittstelle mit dem hochpräzisen motorisierte Z-Bühne. Der Substrathalter wird auf der XY Bühne für Abtastzwecke verbunden. Zur Gewinnung des Lysats für nachgeschaltete Analyse, eine 3D gedruckt Meßstation eingeklipst magnetisch an der Seite des Substrathalters (in Einschub gezeigt). Spritzenpumpen, ein inverses Mikroskop, Steuerungen und Displays rund um die Plattform befinden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Hierarchical hydrodynamischen Strömungs Confinement (hHFC) für räumliche und zeitliche Kontrolle der Zellentfernung. (A) Schematische Darstellung eines einzelnen HFC. (B) Verschachtelte und (C) eingeklemmt Modus von hHFC Betrieb. (D) Bild des Fußabdrucks für zwei unterschiedliche Einspritz- / Absaugströmungsleitung Verhältnisse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Muster der Zellmonolayern des MFP verwendet wird . (A) Cell-Grid - Generation durch programmierte Abtastung des MFP auf einem MDA-MB-231 Zellschicht. Die Zellen wurden mit grünen Zelle-tracker Farbstoff gefärbt. (B) Die Grundfläche für die verschiedenen Injektionsverhältnisse (n) Auf einer MCF7 Zellmonolayer. Die schematische Darstellung zeigt die erwartete Variation in der Form des inneren HFC mit einer Änderung in n. (C) Patterned Co-Kultur durch subtraktive Strukturierung von einschichtigen MCF7 gefolgt durch Impfen MDA-MB-231 - Zellen in den Regionen abgezogen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Schubspannung auf der Oberfläche , wenn hHFC. Die Scherbeanspruchung auf die Oberfläche steigt linear mit der inneren Einspritzflussrate anwenden. Die höchste Scherpunkt zwischen den beiden inneren Öffnungen (unten rechts im Bild), wo die Verarbeitungsflüssigkeit begrenzt (rote Fließlinien, links oben kleines Bild) gefunden. Die Abmessungen der Öffnung in der Finite-Elemente-Modell verwendet werden, sind 200, 100, 100 und 200 & mgr; m für i1, i2, a1und A2. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Betriebsarten der MFP - Plattform zur Durchführung Zellentnahme und Strukturierung. (A) Schematische Darstellung des Strömungswegs für die subtraktive Strukturierung durch Zell - Lyse. Der Einfachheit halber sind nur eine von jeder Injektion und Aspiration Strömungswege dargestellt. Die Spritzen werden mit dem Ablassventil in den Pumpen gefüllt. i1 und i2 sind zum Einspritzen von Extraktionspuffer und NaOH verwendet wurden. (B) Schematische Darstellung des Strömungswegs für Lysat Erholung. Dieser Strömungspfad nach der Sammlung von Zellysat für die Analyse unter Verwendung des Strömungswegs in (A) aktiviert wird. Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Downstream - Analyse von DNA aus Zelllysat qPCR verwendet wird . (A) Amplification Plots von DNA in Lysat von 5 Fußabdrücke extrahiert (5 fp) und 1 - Bilanz (1 fp). Die Kontrollen wurden in beiden Fällen nach Lysat Sammlung extrahiert. (B) Schmelzkurven von DNA aus dem Lysat verstärkt , um die Qualität der extrahierten DNA zeigt. qPCR wurde durchgeführt (N = 2, n = 3) , um das β-Aktin - Gen zu verstärken. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung S1. Eine skalierte Bild von Kanaldesign für den 6-Kanal - MFP Kopfzur Strukturierung von Experimenten verwendet. Kanäle die hHFC Durchführung sind 200, 100, 100, 200 & mgr; m breit und 100 & mgr; m tief. Die beiden äußersten Kanäle, die Eintauchflüssigkeit aufzufüllen sind 500 & mgr; m breit und 100 & mgr; m tief. Eine GSD - Datei für das gleiche Design hat sich als Ergänzung zu diesem Artikel zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Wir präsentieren ein vielseitiges Protokoll für die subtraktiven Strukturierung von Zellmonolayern, die schnelle Erzeugung von räumlich definierten Zellstrukturen ermöglicht. Selektive Lyse der Zellmonolayer wird mit NaOH als Verarbeitungsflüssigkeit in hHFC durchgeführt. Die NaOH denaturiert augenblicklich die Proteine ​​in der Zellmembran enthalten ist. Wir empfehlen die Verwendung von 50 mM NaOH-Konzentration der Weiterverarbeitung des Lysats zu gewährleisten. Diese Konzentration kann für eine schnellere Zellentfernung erhöht werden, Lysat Downstream Processing kein Ziel ist. Die hHFC stellt sicher, dass die nicht verarbeitete Umgebung der Zellschicht unbeeinflusst bleiben und sind entweder das Muster erweitert oder andere Eigenschaften der Zellen Sondieren.

Die Rate der Zellentfernung ist eine Funktion sowohl der Chemie und Scherung durch die Strömung dargestellt. Wir wählen einen Arbeitsbereich von Flussraten Chemie dominante Zellentfernung zu haben. Scangeschwindigkeiten von 10 - 20 & #181; m / sec eine NaOH Injektionsflussrate von 6 unter Verwendung von - 8 ul / min verwendet werden, 'schnelle' subtraktiven Strukturierungs zu erleichtern. Die rasante Geschwindigkeit der Zellentfernung behandelt einige Herausforderungen durch Oberflächendruck basierend Musterung ^20,21 nähert. Diese Verfahren erfordern einen Mechanismus Wachstum von Zellen zu begrenzen, in räumlich definierten Bereichen, beispielsweise durch selektive Abscheidung von Zelladhäsionsproteinen via Mikrokontaktdrucken und anschließender Aussaat von Zellen, um das Muster zu erhalten. Sie zeichnen sich durch geringen Durchsatz begrenzt und erfordern mehrere aufeinanderfolgende Schritte zur Mustererzeugung sowie ein neues für jedes Muster Schablone / Stempel. Das beschriebene Verfahren erfordert nicht selektives Wachstum von Zellen auf definierte Bereiche und mehrere Einschränkungen überwindet durch subtraktive Strukturierung im Gegensatz zum Drucken ausgeführt wird, während keine zusätzliche Behandlung des Zellkultursubstrat erfordern.

Mit dem Protokoll in diesem Dokument beschriebenen, den Durchsatz von Musterzellmonolayernerhöht wird, während sofortiges visuelles Feedback des erzeugten Muster zu erhalten. Dies erleichtert die Echtzeit-Änderung der Muster. Eine solche Steuerung kann in Szenarien, in denen die Lebensfähigkeit der Zellen auf einer gegebenen Oberfläche nicht homogen ist von entscheidender Bedeutung sein. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass der gleiche Kopf und der Chemie verwendet werden können, mehrere Muster zu erzeugen, wodurch die Anzahl der Schritte zu reduzieren bei der Erzeugung einer strukturierten Zellschicht beteiligt.

Die Abmessungen der Kanäle in dem Kopf und der Kopfgeometrie kann entsprechend den Anforderungen der Anwendung geändert werden, wodurch die Kontrolle über die Auflösung der Strukturierung ermöglichen. Alle Versuche in der aktuellen Arbeit wurden unter Verwendung eines MFP Kopf mit festen Öffnungsabmessungen durchgeführt, und zwar mit inneren Öffnungen bei 100 × 100 & mgr; m und äußeren Öffnungen bei 200 × 100 & mgr; m. Dieses Design mit größeren äußeren Öffnungen wurde ohne ein Verstopfen der Öffnungen kontinuierlichen Betrieb des hHFC sicherzustellen ausgewählt vonStreuzelltrümmer. Wir haben getestet Köpfe mit inneren Abmessungen der Öffnung 50 × 50 & mgr; m und 50 & mgr; m Abstand zwischen ihnen, mit erfolgreichen Ergebnissen in Zellentnahme. Die Verwendung von kleineren Öffnungen, bis zu 10 × 10 & mgr; m mit 10 & mgr; m Abstand, würde die Skalierung auf eine kleinere Stellfläche Größe (~ 30 × 30 & mgr; m) ermöglichen, wodurch eine höhere Auflösung bei der Muster ermöglicht. Wir beobachteten operativen Fragen mit Öffnungsgrößen kleiner als 10 & mgr; m aufgrund von Partikeln zu verstopfen. Wegen solcher Betriebsschwierigkeiten, 100 & mgr; m ist die Strombegrenzung der Auflösung und somit eine Begrenzung der beschriebenen Technik. Allerdings können wir dies mit der flüssigen Formgebung Fähigkeit des hHFC adressieren. Wir haben gezeigt , dass die Auflösung der Zellentfernung kann durch Steuern Q _I2 / Q _I1 (Abbildung 4b) und die Spitze-zu-Substrat - Spalt ^10,14 für einen gegebenen Satz von Öffnungsabmessungen abgestimmt werden. Die Stadien in der aktuellen Arbeit verwendet hat eine minimale Schrittweite von 100 nm.Eine Kombination dieser steuerbaren Parameter kann die räumliche Auflösung der Zellentnahme in Bezug auf die Stellfläche Größe und Tastweite verbessern.

Wenn gemusterten Kokulturen erwünscht sind spezifische Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, sequenziellen seeding und Strukturieren kann unter Verwendung des beschriebenen Protokolls durchgeführt werden. Schließlich können amplifizierbare DNA von hoher Qualität aus dem Lysat erhalten werden, wie ersichtlich , durch die singuläre Peaks in der DNA Schmelze Kurve (siehe Abbildung 7). Wir untersuchten eine DNA-Menge von etwa 1,6 aus einem einzigen Fußabdruck ng (etwa 300 Zellen) unter Verwendung von qPCR, die theoretische Erwartung nahe ist (6-8 pg / Zelle). Dies deutet auf eine Menge der extrahierten DNA geeignet für verschiedene nachfolgende Prozesse, während die Verwendung von irgendwelchen DNA Isolationsmethoden vermieden. Dies eröffnet Möglichkeiten für die DNA-Analyse-basierten von kultivierten Zellen lokale Sondierung. Die Fähigkeit von hHFC Flüssigkeiten zu formen können auch lebende Zellen und Proteine ​​verwendet werden auf ac abzuscheidentiviert Oberflächen, die in Kombination mit dem subtraktive Strukturierung und sequenzielle Kokultivierung in diesem Protokoll vorgestellt ermöglicht die Erstellung von komplexen Zell- und Zell-Matrix-Muster auf Kultursubstraten. Die Vielseitigkeit und die Kontrolle zur Verfügung gestellt von hHFC-basierten subtraktiven Strukturierung von Zellmonolayern und die Möglichkeit, auf den extrahierten Zellen DNA-Analyse durchzuführen, stellt ein leistungsfähiges neues Werkzeug für Biologen setzen ortsaufgelöste Untersuchungen Wechselwirkungen zwischen Zelle durchzuführen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Microfluidic Probe (MFP)			Silikon/Glas-Hybrid-Sondenkopf mit siliziumstrukturierten Kanälen. Fertigung im eigenen Haus bei IBM Research - Zü reichhaltige
Lab Tek II Kammer-Objektträger mit 2 Kammern	ThermoFisher scientific, USA	154461	2-Kammer-Objektträger für die Zellkultur, wobei jede Kammer eine Fläche von 4 cm2 bietet und bis zu 3 ml Medienvolumen
Chemikalien und Zelllinien
Natriumhydroxid, Tris-Cl, Ethylendiamintetraessigsäure, Rhodamin B	SigmaAldrich Chemikalien, USA	S5881, 252859,  E9884, R6626	Chemikalien zur Verarbeitung und Abschirmung von Flüssigkeiten
Proteinase K	Qiagen, Deutschland	19131	Protease zum Verdau von entschärften Proteinen
Deconex 16 Plus	Bohrer Chemie, Schweiz		Universalreiniger für Laborverbrauchsmaterialien. Wird für die nicht strenge Reinigung verwendet.
DNA weg	ThermoFisher scientific, USA	7010	Oberflächendekontaminationsmittel, das DNA und DNAasen denaturiert.
DMEM, hoher Glukosegehalt, GLUTAMAX-Ergänzung	ThermoFisher scientific, USA	10566-016	Kulturmedium für Epithelzellen.
CellTracker Green CMFDA Farbstoff	ThermoFisher scientific, USA	C7025	Membran permein Farbstoff für die Lebendzellmarkierung. Farbstoff 72 Stunden lang aktiv.
CellTracker Orange CMRA-Farbstoff	ThermoFisher scientific, USA	C34551
β-Aktin-Genom-Primer für qPCR	Integrierte DNA-Technologien, USA		Benutzerdefinierte Oligos für die DNA-Qualitätsvalidierung und qPCR.
MCF7 Brustkarzinomzellen	ATCC, USA	ATCC HTB-22	Zelllinien, die zur Herstellung von Co-Kulturen verwendet werden.
MDA-MB-231 Brustkrebszellen	ATCC, USA	ATCC HTB-26
Ausrüstung und fluidische Verbindungen
Motorisierte Hochpräzisionstische	Kundenspezifische bearbeitete Komponenten.  Linearachsenmotoren von LANG GmBH, Deutschland	Kundenspezifische Linearachsentische der LT-Serie	3 & mal; LT für 3 Achsen. LSTEP-Controller für die Verbindung von Tischen und PC über den RS 232-Port.
Spritzen	Hamilton, Schweiz	1700 TLLX Serie	Austauschbar mit Spritzen anderer Hersteller mit einem 250-500 & micro; L-Reihe.
Nemesys Niederdruck-Spritzenpumpen	cetoni GmbH, Deutschland		Bestandteil einer Pumpstation.
M1-Rundsteckverbinder	Dolomit-Mikrofluidik, Vereinigtes Königreich	3000051	Schnittstelle zwischen Durchkontaktierungen im MFP-Kopf und den Rohren
Kipp-/Drehtisch-Goniometer	OptoSigma, USA	KKD-25C	Goniometer zur Anpassung der Koplanarität der MFP Apex
DS Fi2 HD Farbkamera (CCD)	Nikon, Schweiz		Gesteuert mit DS-U3 Controller Unit
Software
Win - Commander	LANG GmBH, Deutschland		Bühnensteuerungssoftware.
Qmix Elements	cetoni GmbH, Deutschland		Software zur Steuerung von Pumpen.
NIS Elements	Nikon, Schweiz		Grundlagenforschungsmodul für Bildaufnahme und -analyse.