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Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

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DOI:

10.3791/54456

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4. Oktober 2016

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1Neural Stem Cell Laboratory, Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Neurale Stammzellen (NSCs) beziehen sich auf Zellen, die selbst zu erneuern und differenzieren sich in die drei neuronale Abstammungslinien. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation zu bestimmen, Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen.

Zusammenfassung

Neurale Stammzellen (NSC) die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die drei Haupt neuralen Abstammungslinien erzeugen - Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozyten. NSCs und neuronale Vorläuferzellen (NPs) sind in der Regel in vitro kultiviert als Neurosphären. Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie die NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation unter klonalen Bedingungen zu bestimmen. Das Protokoll beginnt mit dem Aussäen der Zellen in einer Dichte, die zur Erzeugung von klonalen Neurosphären ermöglicht. Die Neurosphären werden dann auf chambered Deckgläser übertragen und unter klonalen Bedingungen in konditionierten Medium differenziert, die das Differenzierungspotenzial der Neurosphären maximiert. Schließlich wird der NSC Frequenz berechnet basierend auf Neurosphärenbildung und Multipotenz Fähigkeiten. Dienstprogramme dieses Protokolls umfassen die Bewertung von Kandidatenmarkern NSC, Reinigung von NSC, und die Fähigkeit, NSC von NPs zu unterscheiden. Dieses Verfahren dauert 13 Tage, um auszuführen, was viel sHorter als die derzeitigen Methoden NSC Frequenz aufzuzählen.

Einleitung

Neurale Stammzellen (NSC) sind Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS), die selbst erneuern können und multipotent. NSC werden zunächst während der Entwicklung der embryonalen Vorderhirns spezifiziert und weiterhin im erwachsenen Gehirn an bestimmten Regionen wie die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und Gyrus dentatus (DG) des Hippocampus zu persistieren. Eine Reihe von NSC Linien werden in klinischen Studien zur Behandlung von Schlaganfall und anderen neurologischen Erkrankungen wie Batten-Krankheit 1 verwendet.

NSCs und neuronale Vorläuferzellen (NPs) in Kultur als Floating-3-dimensionalen Sphäroid Strukturen genannt Neurosphären propagiert. Die Neurosphären Kultursystem wurde von Reynolds und Weiss in den frühen 1990er Jahren entwickelt, wenn sie festgestellt , dass embryonalen und adulten Rindenzellen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und basischem Fibroblasten - Wachstumsfaktor (bFGF) 2-4 dividieren kann. Neurosphären bestehen aus einer heterogenen Mischung aus cells bestehend aus Unterklassen in verschiedenen Entwicklungsstadien 5. Es ist eine Herausforderung, speziell NSCs zu studieren unter Verwendung von Neurosphären erhaltenen Daten aufgrund der Anwesenheit von Nanopartikeln. Daher ist es von entscheidender Bedeutung NSCs von Neurosphären zu bereichern. Derzeit sind vier Hauptmethoden verwendet worden für NSCs in vitro zu bereichern. Erstens ist die Verwendung von Zelloberflächenmarkern. Lewis-X (lex) und CD133 (auch als Prominin1 bekannt) sind die prominentesten Zelloberfläche NSC 6-9 Marker. Syndecan-1, Notch-1 und Integrin-Beta1 sind andere Oberflächenproteine , die für die NSCs 10 bereichern. Zweitens ist der Farbstoff Ausgrenzung. Es hat sich gezeigt , daß die Seitenpopulation Zellen, die die einzigartige Fähigkeit , die fluoreszierende DNA-bindende Farbstoff Hoechst 33342, abzupumpen haben für NSC 11 angereichert. Drittens ist die Verwendung von morphologischen Selektion. Es wurde gezeigt , dass Zellen mit einem erhöhten Zellgröße und Granularität mehr NSC beherbergen als ihre Pendants 5,12,13. Viertens ist die Zugabe von NSC survival Faktoren zu dem Kulturmedium. Es wurde gefunden , dass Zugabe von Chondroitinsulfat - Proteoglykan gezeigt und Apolipoprotein E verbessert NSC Überleben und erhöht somit NSC Frequenz 14,15. Obwohl viele Markierungen einschließlich Transkriptionsfaktoren mit NSC 16,17 keiner dieser Marker sind in der Lage zu bereichern NSC Reinheit verbunden. Aufgrund der fehlenden endgültigen NSC Marker, bleibt es eine Herausforderung , NSCs zu quantifizieren und sie von NPs in vitro zu unterscheiden.

Erste Untersuchungen verwendet , um die Neurosphärenbildungstest (NFA) NSCs 7,11,13 zu quantifizieren. In diesem Test werden dissoziierten Zellen kultiviert Neurosphären und die Anzahl der Neurosphären pro 100 Zellen erzeugt zu bilden bestimmt plattiert ist. Dieser Wert wird als der Neurosphäre Formation Unit (NFU) bezeichnet. Der NFU gleich der NSC Frequenz, wenn alle Neurosphären von NSCs entstehen. Es wurde jedoch gezeigt, dass der NFU die NSC Frequenz überschätzt als Neurosphären von beiden NS gebildet werdenCs und frühen NPs 5. Somit ist es ungenau NSCs aufzuzählen ausschließlich basierend auf Neurosphere Bildung. Es könnte möglich sein, NSC auf auf der Basis ihrer Fähigkeit zur Quantifizierung selbst zu erneuern, proliferieren und umfassend multiNeuroSphären zu erzeugen.

NSCs, die EGF und bFGF ansprechbar sind in der Regel für mindestens zehn Passagen überleben und somit umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit in Kultur 4,18-20 anzuzeigen. NPs, die auch EGF und bFGF ansprechen, könnten auch Neurosphären für einige Stellen erzeugen, aber nicht für einen längeren Zeitraum. Daher wurde es allgemein anerkannt , dass bona fide NSCs kann mit ziemlicher Genauigkeit basierend auf Neurosphere Bildung für mindestens zehn Passagen aufgezählt werden. In den meisten Studien wird jedoch die Selbsterneuerung in der Regel basierend auf gemessenen sekundären oder tertiären Neurosphärenbildung aufgrund der langen Versuchsdauer von zehn Passagen erforderlich. Daher kann die Sekundär NFA verwendet werden, um weitgehend die Selbsterneuerungsfähigkeit bet vergleichenween Populationen, aber nicht genau Frequenz NSC aufzuzählen verwendet werden.

NSCs haben eine größere proliferative Fähigkeit im Vergleich zu NPs. Diese Eigenschaft von NSCs wurde von Louis et al. die neurale koloniebildenden Zellassay (NCFCA) 21,22 - einen Test zur NSC - Enumeration zu entwickeln. In diesem Test werden für 3 Wochen kultiviert einzelne Zellen in einer Kollagen enthaltenden halbfesten Matrix. Unter diesen Kulturbedingungen wurde gezeigt, dass Zellen, die Neurosphären über 2 mm im Durchmesser sind tripotent und kann selbst zu erneuern für langfristig bilden. Diese Zellen sind als NSC definiert. Daher werden die NSC effektiv von NPs aus.

NSCs haben die Fähigkeit, in Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen zu differenzieren. Zur Differenzierung von Neurospheres sind, Wachstumsfaktoren entnommen und Serum wird zu dem Kulturmedium zugegeben. Wenn alle drei neuronalen Abstammungslinien werden in einer Neurosphären beobachtet, dann ist die Zelle, die diese Neurosphäre eingeleitet is ein NSC. Jedoch hat der Differenzierungsassay einige Einschränkungen. Zunächst werden die Kulturbedingungen für die Differenzierung verwendet werden, können nicht optimal für die Erzeugung aller drei neuronale Abstammungslinien. In der Tat kommt es in einem einzigen Neurosphere Differenzierungsprozess, signifikante Zelltod und meist Astrozyten Generation auftritt (Tham M und Ahmed S, nicht veröffentlicht). Zweitens gibt es die Frage der Klonalität. Für eine genaue Zählung von NSC, die Bildung und Differenzierung von Neurospheres haben unter klonalen Bedingungen durchgeführt werden, wobei jeder Neurosphäre aus einer einzigen Zelle entsteht. In der Masse Suspensionskulturen erfolgt die Aggregation an beiden zellulären und Neurosphere Ebenen 23-25. Daher ist es möglich, dass jeder Neurosphäre aus mehreren Zellen oder Neurosphären entstehen zu, die Neurosphären Zählen und Auswertung von Multipotenz erschwert. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die Aggregation von Zellen tritt nicht bei niedrigen Plattierungsdichte von 0,5 Zellen / & mgr; l oder weniger beträgt, und wenn Kulturplatten werden bei neu bewegtrosphere Bildung 15. So Kultivierung von Zellen bei so niedrigen Dichte Klonalität würde sicherstellen.

Derzeit ist die NCFCA die am häufigsten verwendete Methode zur Unterscheidung von NSC NPs und NSC Frequenz aufzuzählen. Die NCFCA erfordert jedoch eine relativ lange Zeit von drei Wochen. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz aufzuzählen basiert auf der Fähigkeit von NSC multiNeuroSphären zu bilden. Dieses Protokoll dauert nur 13 Tage durchzuführen. Die NCFCA sorgt für Klonalität als die Kollagenmatrix Bewegung der Neurosphären verhindert. Die Kulturbedingungen in diesem Protokoll verwendet ermöglicht auch Klonalität gesamten beibehalten werden. Zum Beispiel stellt die Verwendung von 50-Well-Kammerdeckgläser, dass die Neurosphären ohne einander zu berühren unterscheiden wird. Darüber hinaus verwenden wir konditioniertem Medium , die neurotrophen Faktoren während der Differenzierung liefert das Differenzierungspotential der Neurosphären (Abbildung 1) zu maximieren.

Protokoll

Die Behandlung von Tieren wurde in Übereinstimmung mit den IACUC und NACLAR Richtlinien und genehmigt durch das Tier - Abteilung ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11) durchgeführt.
HINWEIS: Neurosphäre Kulturen wurden aus dem Vorderhirn von embryonalen (e14) C57BL / 6 - Mäusen hergestellt , wie es zuvor 5 beschrieben.

1. Kultur der klonalen Probe Neurosphären (Tag 1)

  1. Bereiten Sie NSC Wachstumsmedium von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium / Nährstoff-F-12 (DMEM / F12) mit B27 Ergänzung (Endkonzentration: 1x) kombiniert, EGF (Endkonzentration: 20 ng / ml), bFGF (Endkonzentration: 10 ng / ml) und Penicillin / Streptomycin (Endkonzentration: 1x).
  2. E14.5 Maus Neurosphären in 1 ml NSC Wachstumsmedium und 1 ml 0,05 N Natriumhydroxid für 7 min bei RT Dissociate. Pipette Zellen nach oben und unten gelegentlich Zellen in Suspension zu halten. 1 ml 0,05 N Salzsäure neutralize die Alkali.
    HINWEIS: Neurosphäre Zellen bei 20.000 Zellen / ml in einer 10 cm Kulturschale ausgesät und kultiviert werden für 5 d bei 37 ° C, 5% CO 2. Die erwartete Rendite nach ca. 10 Millionen Zellen pro 10 cm Schale. Diese Zellen werden dann dissoziiert und bei klonaler Dichte ausgesät wie in den Schritten 1.2 und 1.3 beschrieben sind.
    1. Führen Zellzahl Trypan-Blau-Färbung und unter Verwendung eines Hämozytometers.
  3. Seed E14.5 Maus Neurosphäre Zellen bei einer Dichte von 50 Zellen / ml oder weniger in 100 & mgr; l NSC Wachstumsmedium in einer 96-Well Schale. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1 w klonalen Neurosphären zu erzeugen.
    HINWEIS: Klonalität wird während Neurosphärenbildung bei dieser Dichte gewährleistet, da die Zellen nicht in Kontakt miteinander.

2. Kultur von Neurosphären für konditionierte Medium (Tag 3)

  1. Distanzieren Neurosphären E14.5 Maus als 1.2 in Schritt beschrieben.
  2. Seed einzelne Zellen von E14.5 Maus Neurosphären in einer Dichte von 20.000 Zellen / ml in einem 10 ml NSC Wachstumsmedium in einer 10 cm Kulturschale. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 d bulk kultivierten Neurosphären zu erzeugen.

3. Herstellung von Neurosphäre konditioniertem Medium (Tag 8)

  1. Bereiten Beschichtungslösung durch Mischen von 700 & mgr; l von 0,01% Poly-L-Lysin (PLL), 70 ul 1 mg / mL Laminin und 6.230 & mgr; l Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
  2. Mantel eine 10 cm Kulturschale mit 7 ml PLL / Laminin-Lösung für 2 h bei 37 ° C.
  3. Unter Verwendung einer 10 ml serologische Pipette alle bulk kultivierten Neurosphären in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 171 × g für 1 min bei RT und entfernen Sie den Überstand vollständig.
  4. Bereiten Sie NSC Differenzierungsmedium durch DMEM / F12-Medium kombiniert mit B27 (Endkonzentration: 1x) und fötales Rinderserum (FBS) (Endkonzentration: 0,5%) Add 10 ml NSC Differenzierungsmedium zu Neurosphären. Pipette nach oben und unten ein paar Mal die Neurosphären zu resuspendieren.
  5. Absaugen PLL / Laminin aus der 10 cm Kulturschale und waschen Sie einmal mit 10 ml PBS. Übertragen alle Neurosphären an die PLL / Laminin-beschichtete 10 cm Kulturschale. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 für die Neurosphären an der Schale haften.

4. Bestimmung der NFU der Probe Neurosphären (Tag 8)

  1. Zählen Sie die Anzahl der Neurosphären (an Tag 1 ausgesäten; Abschnitt 1) ​​in jedem gebildeten gut unter dem Mikroskop.
    HINWEIS: Bestimmen Sie die Anzahl der Neurosphären pro 100 Zellen gebildet zogen, die die NFU gibt.

5. Übertragung der Probe Neurosphären auf 50-Well-Chambered Coverslip (Tag 8)

  1. Coat jede Vertiefung einer 50-Well-Kammerdeckglas mit 10 & mgr; l PLL / Laminin Beschichtungslösung für 2 h bei 37 ° C.
    HINWEIS: Bereiten Beschichtungslösung wie beschrieben inSchritt 3.1.
  2. Vorbereitung 3 x 50 mL konischen Zentrifugenröhrchen mit 30 ml PBS jeder. Mit einer sterilen Pinzette, entfernen Sie die beschichteten 50-Well-Kammerdeckglas. Tauchen Sie die gekammert Deckglas in das erste Rohr aus PBS, gefolgt von der zweiten und der dritten Röhre PBS zu waschen um die Beschichtungslösung ab.
  3. Aspirieren alle verbleibenden Flüssigkeit aus den Vertiefungen der gekammert Deckglas.
  4. Pipette vorsichtig alle Medium und Neurosphären aus jeder Vertiefung der Schale mit 96 Vertiefungen und übertragen sie auf eine einzige 10 cm Kulturschale.
  5. Unter einem Mikroskop, um eine Probe Neurosphere wählen Sie ein P10 Mikropipette mit einer 10 & mgr; l-Pipettenspitze angebracht werden. Stellen Sie sicher, dass nur ein einziger Neurosphere wird jedes Mal, aufgenommen durch die Pipette Spalte auf 2 & mgr; l zu setzen. Verwenden Sie für jede Neurosphere einer neuen Pipettenspitze.
  6. Übertragen Sie die Neurosphere auf die Mitte eine Vertiefung der beschichteten 50-Well-Kammerdeckglas.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.6 bis jede Vertiefung der chambered Deck contaIns A Neurosphere.
    HINWEIS: Die Neurosphären unter einem Mikroskop werden in einer laminaren Strömungshaube oder auf einer Benchtop platziert kommissioniert.
  8. Fügen Sie 10 & mgr; l NSC Differenzierungsmedium zu jeder Vertiefung der gekammerten Deckglas. Platzieren Sie die gekammert Deckglas in eine 10 cm Kulturschale und Pipette PBS entlang der Ränder der Schale Trocknung des NSC Differenzierungsmedium zu verhindern. Legen Sie bis zu zwei Kammern Deckgläser in einer 10 cm Kulturschale. Inkubieren der gekammert Deckglas (in 10 cm Kulturschale enthalten ist ) über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2.

6. Differenzierung der Probe Neurosphären (Tag 9)

  1. Übertragen Sie das Differenzierungsmedium von den Massen kultivierten Neurosphären (aus dem Abschnitt 3) zu einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Sicherzustellen, dass 2-3 ml Differenzierungsmedium in der Kulturschale bleibt adhärierten Zellen zu verhindern, gelöst wird. Unter Verwendung einer 20 ml sterile Spritze, vorbei an der Differenzierungsmedium durch ein 0,2 μm Filter alle Zellen oder Zelltrümmer zu entfernen.
  2. Übertragen Sie die gefilterten Differenzierungsmedium zurück in die 10 cm Kulturschale der anhaftenden Zellen enthält.
  3. Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie vorsichtig die chambered Deck auf das Differenzierungsmedium in einer umgekehrten Art und Weise, so dass die Probe Neurosphären nach unten zeigen. Inkubieren der gekammert Deck mit dem Differenzierungsmedium für 3 d bei 37 ° C, 5% CO 2.
    HINWEIS: Die Probe Neurosphären in Kontakt mit dem Differenzierungsmedium sind, aber nicht in Kontakt mit den differenzierenden Zellen unter.

7. Befestigung von Differentiated Neurosphären (Tag 12)

  1. Das Kammerdeckglas aus dem 10 cm Kulturschale mit einer sterilen Pinzette vorsichtig entfernen. Tauchen Sie vorsichtig das Deckglas in PBS das konditionierte Medium zu waschen.
  2. Ziehen Sie die Silikondichtung aus dem Deckglas ab. Führen Sie diese vorsichtig und langsam zu brechen das Deckglas zu vermeiden. Beachten Sie die Seite, wo the differenzierten Neurosphären eingehalten werden.
  3. Pipette 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) auf ein Stück eines Paraffinfilm geschnitten, um die Größe des Deckglases. Sanft legen Sie die Deck auf dem Paraffinfilm mit den nach unten in Kontakt mit dem PFA gegenüber Neurosphären. Befestigen Sie die Neurosphären für 20 min bei RT.
    Achtung: PFA ist giftig sowohl in flüssiger und Dampfform und ist brennbar. Vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen und Kontakt mit Haut und Augen. Fassen Sie PFA in einem gut belüfteten Abzug durchführen.
  4. Pipette 1 ml PBS auf ein Stück Paraffinfilm. Waschen Sie die Neurosphären durch vorsichtiges das Deckglas mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit PBS für 10 min bei Raumtemperatur platziert.
  5. Wiederholen Sie Schritt 7.4 zwei weitere Male.

8. O4 Anfärbung von Differentiated Neurosphären (Tag 12)

  1. Vorbereitung 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. Pipette 1 ml 3% BSA auf ein Stück Paraffinfilm. Blockieren Sie die Neurosphären durch sanft Placing das Deckglas (mit den Neurosphären nach unten) für 30 min bei RT mit der BSA in Kontakt.
  2. Pipette 1 ml Maus-anti-O4 IgM-Antikörper (1: 300 Verdünnung in 3% BSA) auf ein Stück eines Paraffinfilm und legen das Deckglas auf den Paraffinfilm mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit dem Antikörper. Erlauben O4 Färbung für 2 h bei RT auftreten.
  3. Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben.
  4. Pipette 1 ml grün fluoreszierenden Farbstoff konjugiert-anti-Maus-IgM sekundärem Antikörper (1: 500-Verdünnung in 3% BSA) auf ein Stück eines Paraffinfilm und legen das Deckglas auf den Paraffinfilm mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit dem Antikörper . Lassen für 1 h bei RT im Dunkeln.
    HINWEIS: Führen Sie die Immunfärbung in einer dunklen Umgebung von diesem Schritt ab.
  5. Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben.

9. TuJ1 und sauren Gliafaserproteins (GFAP) Färbungvon Differentiated Neurosphären (Tag 12)

  1. Bereiten Lösung durchdringbar durch Zugabe von Triton-X 100 (Endkonzentration: 0,5%) auf das 3% BSA. Pipette 1 ml Lösung auf ein Stück Paraffinfilm durchdringbar. Deckglas auf den Paraffinfilm mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit der permeabilisierenden Lösung für 20 min bei RT.
  2. Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben.
  3. Pipette 1 ml Maus - anti-TuJ1 IgG2a - Antikörper (1: 500 Verdünnung in 3% BSA) und Kaninchen - Anti-GFAP - IgG - Antikörper (1: 1000 Verdünnung in 3% BSA) auf ein Stück eines Paraffinfilms und Eindecken auf der Paraffinfilm mit den einander zugewandten Neurosphären nach unten mit den Antikörpern in Kontakt. Erlauben TuJ1 und GFAP-Färbung für 2 h bei RT auftreten.
    HINWEIS: Die beiden Antikörper können als eine einzige Lösung hergestellt werden.
  4. Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben.
  5. Pipette 1 ml roten Fluoreszenzfarbstoffkonjugiert-anti-Maus - IgG 2a (1: 500 - Verdünnung in 3% BSA) und fern roten Fluoreszenzfarbstoff konjugiert-anti-Kaninchen - IgG (1: 500 Verdünnung in 3% BSA) Sekundärantikörper auf ein Stück Paraffinfilm und Ort Deckglas auf den Paraffinfilm mit den einander zugewandten Neurosphären nach unten mit den Antikörpern in Kontakt. Lassen für 1 h bei RT.
    HINWEIS: Die beiden Antikörper können als eine einzige Lösung hergestellt werden.
  6. Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben.
  7. Verdünne 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Stammlösung zu 300 nM in PBS. Pipette 1 ml DAPI auf ein Stück Paraffinfilm und Eindecken auf dem Paraffinfilm mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit DAPI für 2 min bei RT für Kerne Färbung.
  8. Waschen Sie die Deck einmal mit PBS und zweimal mit deionisiertem Wasser, wie in Schritt 7.4 beschrieben. Montieren Sie das Deckglas auf einem Glasträger eine geeignete Montagemedium verwendet und erlauben O / N bei RT trocknen.

10. Imaging von Differentiated Neurosphären (Tag 13)

  1. Bild Neurosphären unter einem konfokalen Mikroskop ein 40X verwenden. Verwenden Sie die Laser bei 488 nm, 594 nm und 647 nm zu Oligodendrozyten, Neuronen und Astrozyten erkennen sind.
  2. Bestimmen Sie den Prozentsatz der unipotent, bipotent und tripotent Neurosphären.
    HINWEIS: Potency wird durch die Fähigkeit des Neurosphäre bestimmt , in die drei neuralen Abstammungslinien zu differenzieren - Oligodendrocyten, Neuronen und Astrozyten 5,14,15,26. Oligodendrozyten sind durch positive Färbung für O4 (§ 8) identifiziert. Neurone sind durch positive Färbung für TuJ1 (Abschnitt 9) identifiziert. Astrozyten sind durch positive Färbung für GFAP (Abschnitt 9) identifiziert. Ein unipotent Neurosphere differenziert sich in nur einer der Abstammung und positiv für entweder O4, GFAP oder TuJ1 Fleck sollte. Ein bipotent Neurosphere differenziert sich in zwei beliebigen Linien und sollte für O4 und GFAP oder O4 und TuJ1 oder GFAP und TuJ1 positiv färben. Ein tripotent Neurosphere verschiedeneiates in allen drei Linien und sollte positiv für O4, GFAP und TuJ1 färben.
  3. Bestimmen Sie NSC Häufigkeit in der Bevölkerung von Interesse durch die folgende Formel:
    NSC-Frequenz = (NFU x% tripotent Neurosphären) / 100%.

Ergebnisse

Wir haben dieses Protokoll verwendet , um die Fähigkeit der lex, einer bekannten Zelloberfläche NSC Marker 7, für NSCs zu bereichern zu beurteilen. Die Daten aus dieser Studie werden verwendet, um darzustellen, wie NSCs aufgezählt werden, um die klonale Assays in dem Protokoll. E14.5 Maus Neurosphäre Zellen wurden mit anti-Lex Antikörper inkubiert. Anschließend Zellen , die LeX (LEX +) und Zellen exprimieren , die LeX (LEX -) nicht exprimieren wurden bei 50 Zellen / ml durch Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) ausgesät und links klonalen Neurosphären für 1 Woche zu erzeugen. Zeitraffer-Bildgebung zeigt , dass die Neurosphären bei 50 Zellen erzeugt / mL sind klonalen (Abbildung 2). Der NFU für LeX + und - LEX - Zellen wurde bestimmt. Es wird gezeigt , dass LeX + Zellen eine deutlich höhere Neurosphere Bildungsfähigkeit haben LEX im Vergleich - Zellen (Abbildung 3 g). Die Neurosphären erzeugt wurden dann differenziertunter Bedingungen klonalen anschließend immunhistochemisch und (3a-e) abgebildet. LeX + Zellen erzeugen deutlich mehr tripotent Neurosphären als - LEX - Zellen (3f). Der NSC Frequenz wurde dann basierend auf der NFU und% der tripotent Neurosphären (Figur 3g) berechnet. Die Auswahl basiert auf LEX bereichert NSC Frequenz um mehr als 14-fach lex als NSC Marker zu validieren. Wir haben festgestellt , auch die NSC Frequenz von E14.5 Maus Neurosphären mit diesem Protokoll 27 und NCFCA 28. Beide Verfahren berichten vergleichbar NSC Frequenz von etwa 2% in E14.5 Maus-Neurospheres.

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Abbildung 1. Das Protokoll für Neurosphäre Differenzierung unter Geklonte Bedingungen. Beispielneurosphären unter klonalen Bedingungen gezüchtet werden einzeln in jedem PLL / Laminin-c platziertoated Vertiefung einer 50-Well-Kammerdeckglas und erlaubt O / N zu halten. Am selben Tag, bulk kultivierten Neurosphären werden in Differenzierungsmedium in einer PLL / Laminin-beschichtete 10 cm-Schale plattiert und O / N anhaften. Am nächsten Tag konditionierte Medium aus den kultivierten bulk Neurosphären wird gefiltert und wieder in den 10-cm-Schale gegeben. Die Probe Neurosphären werden dann auf dem konditionierten Medium umgedreht und für 3-4 Tage 28 zu unterscheiden erlaubt. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Figur 2. Wachstum eines Clonal Neurosphäre. Zellen aus E14.5 Neurosphären abgeleitet wurden dissoziiert und beimpft mit 50 Zellen / ml in 96-Well - Platte. Einzelne Zellen wurden 6 d von Zeitraffer-Bildgebung verfolgt. Bilder von one solche Zelle in eine Neurosphere wachsenden gezeigt. Beachten Sie, dass der Neurosphäre Klonalität beibehält. (A) 0 Tagen; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; wobei die erste Zahl auf den Tag bezieht, bezieht sich zweite Zahl auf den Bruchteil des Tages, und dritte Zahl bezieht sich auf den Anteil der h. 10-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken, 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Differenzierung von Geklonte Neurosphären und Zählung von NSC Frequenz. Einzelneurosphären wurden in 50-Well - Kammerdeckglas für 3 d gepflückt und differenziert. Ein repräsentatives Bild eines tripotent Neurosphere stained mit (a) DAPI und immunhistochemisch für (b) GFAP, (c) TuJ1 und (d) O4. (E) zeigt die Überlagerung von (a) - (d). Maßstabsbalken, 65 & mgr; m. (F) Die% der unipotent, bipotent und tripotent Neurosphären erzeugt LEX + und - LEX Zellen (Mittelwert ± SEM, n = 3). (G) NSC Frequenz in LeX + und - LEX. Berechnet Zellen als das Produkt von NFU und% der tripotent Neurosphären Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Wir beschreiben hee die Aufzählung von NSCs unter klonalen Bedingungen. Kritische Schritte umfassen die Verwendung von frischen NSC Wachstums- und Differenzierungsmedium und auch die Verwendung von frisch hergestelltem PLL / Laminin-Lösung zur Beschichtung der gekammert Deckgläser sowie die Kulturschalen. Dies sorgt für eine optimale Wachstum und die Differenzierung Bedingungen der Neurosphären. Die Verwendung von guter Qualität Antikörper effektiv die Neuronen und Glia erkennen, sowie die selektive Kommissionieren von klonalen Neurosphären, die nicht in Kontakt mit anderen Neurosphären sind, sind kritisch. Darüber hinaus ist es wichtig, die gepflückt Neurosphären, um sicherzustellen, nicht austrocknen. Es wird empfohlen, nach der Ernte alle 10 Neurosphären in jede Vertiefung 10 & mgr; l Differenzierungsmedium hinzuzufügen. Es ist wichtig, pro Probe ein chambered Deckglas in einem 10-cm-Schale zu verwenden, Übersprechen zwischen Neurosphären aus verschiedenen Proben zu vermeiden. Wenn zwei Deckgläser (mit jeweils Neurosphären aus unterschiedlichen Proben) sind in der platziertgleichen 10 cm Schüssel, Neurosphären aus einem Deckglas könnte Release Faktoren, die die Neigung der Neurosphären in der anderen Deck in bestimmte Abstammungslinien zu unterscheiden verändern können. Zwei Deckgläser in der gleichen 10-cm-Schale kann auch zwischen den Proben in Verwechslung führen.

Im Fall erwartet die NFU oder die NSC Frequenz niedriger als sicher, dass niedrige Passage-Nummer Neurosphären verwendet werden. Es ist auch wichtig, dass gesunde niedrige Durchgang Neurosphären zur Erzeugung konditioniertem Medium verwendet werden. Als nächstes, wenn die Neurosphären in Brunnen mit kleinem Durchmesser kultiviert werden, wie zum Beispiel in 96-Well-Platte, dann wird es schwierig sein, Neurosphären mit einer Mikropipette zu manövrieren und pflücken. In diesem Fall übertragen die Neurosphären zu einem größeren Kulturschale, wie eine 6-Well-Platte vor der Kommissionierung. Einige der aufgenommenen Neurosphären können aus der Kammerdeckglas während der Kultur und Immunfärbung abheben. Die Minimierung der Bewegung des Kammerdeckglas während der Kultur und weniger intensive Waschwährend Immunfärbung ing, würde dazu beitragen, Ablösung von Neurosphären zu vermeiden.

Erste Studien NSCs nur die NFA 7,11,13 mit quantifiziert. Allerdings überschätzt die NFA die NSC Frequenz als beide NSCs und frühen NPs Neurosphären 5 erzeugen. Louis et al. Eine andere Methode entwickelt NSCs zu quantifizieren als NCFCA 21,22 bekannt. Die NCFCA beinhaltet das Züchten einzelne Zellen in einer Kollagen-basierten Matrix Klonalität zu gewährleisten, und es war, dass nur durch NSCs gebildet Neurosphären oberhalb von 2 mm Durchmesser gezeigt. Ähnlich wie bei der NCFCA, Klonalität wird in diesem Protokoll gewährleistet. Dies wird erreicht durch Neurosphären bei klonaler Dichte und Differenzieren der Neurosphären in gekammert Deck erzeugen. Die Verwendung von gekammerten Deck verleiht eine Anzahl von Vorteilen. Das Kammerdeckglas erlaubt jede Probe Neurosphere ohne physischen Kontakt mit anderen Probe Neurosphären zu unterscheiden, wodurch Klonalität während der Differenzierung zu gewährleisten.Das Kammerdeckglas kann auf dem Differenzierungsmedium suspendiert platziert sein, die Probe Neurosphären zu erlauben, kontinuierlich und maximale Differenzierung zu konditionierenden sicherzustellen. In Abwesenheit von konditioniertem Medium und Serum während der Differenzierung, Überleben der Neurosphären abnimmt und die Neurosphären meist Astrozyten (Tham M und Ahmed S, nicht veröffentlicht) erzeugen. Darüber hinaus können die immunogefärbten Neurosphären bequem für längere Zeit und die gekammert Deck gespeichert werden können, direkt auf den Mikroskop-Objektträger aus Glas angebracht werden. Zusätzlich Abbildung der immunogefärbten Neurosphären leicht gemacht, wie man schnell die Neurosphären in dem kleinen gut chambered finden können, ein Bild aufzunehmen, und zum nächsten gut zu bewegen.

Wir haben die NSC Frequenz in E14.5 Maus Neurosphere Kultur bestimmt sowohl das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben unter Verwendung von 27 und 28 NCFCA. Die Frequenz NSC in E14.5 Maus sowohl von mir bestimmt Neurosphärenthoden sind vergleichbar. Die NCFCA aufzählt NSCs, die multi- und haben langfristige Selbsterneuerungsfähigkeit. Da die NSC Frequenz von unserem Verfahren, wie das von NCFCA vergleichbar ist, scheint das Auslesen von unserem Protokoll nicht die NSC Frequenz zu überschätzen. Die NCFCA erfordert drei Wochen abgeschlossen sein und in erster Linie beinhaltet Zelle Plattierung und mittlere Nachschub. Das hier beschriebene Protokoll erfordert 13 Tage durchzuführen und beinhaltet eine andere Reihe von Schritten, zum Beispiel Neurosphere Kommissionierung und Immunfärbung. Dieses Protokoll kann als alternative Methode dienen NSCs aufzuzählen. Die Forscher können sowohl NCFCA und dieses Protokoll verwenden NSC Frequenz in ihren Proben zu überprüfen.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist es, dass eine Reihe von wichtigen Schritte sind alle am Tag 8. Die Herstellung des konditionierten Mediums, Bestimmung der NFU Probenneurosphären durchgeführt werden, und die Übertragung von Probe Neurosphären bis zum 50-Well-Kammerdeckglas sein müssen auf da durchgeführty 8. Man könnte einige Zeit dauern, um diese Schritte auszuführen. Darüber hinaus erfordert es Praxis, diese Schritte in einer effizienten Weise durchzuführen.

Neurosphären wurden zu untersuchen NSC Funktion und Verhalten weit verbreitet. Allerdings bestehen Neurosphären sowohl von NSCs und NPS. Daher ist es wichtig, NSCs von Neurosphären zu bereichern NSC Biologie zu studieren. Derzeit Zelloberflächenmarker, Farbstoffausschluss Eigentum sowie Zellgröße und Granularität verwendet wurden für NSCs 6,7,9-13,29,30 zu bereichern. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um die Anreicherung von NSCs durch potentielle NSC Marker zu quantifizieren und die Suche nach einem endgültigen NSC Marker zu erleichtern. Vier neue Studien haben dieses Protokoll verwendet NSC Frequenz 5,14,15,26 aufzuzählen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Wir danken der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (A * STAR), Singapur, diese Forschung für die Finanzierung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL konische Zentrifugenröhrchen BD352096
konische Zentrifugenröhrchen mit 50 mL BD352070
20 mL sterile Spritze   BD300141
50 mL sterile Spritze BD300144
Fötales Rinderserum (FBS)BiowestS1810
Maus Anti-Tuj1 IgG2a AntikörperCovanceMMS-435P-100
Kaninchen Anti-GFAP IgG AntikörperDakoZ033401
Hämozytometer Hausser Scientific3100
Mikroskop an Laminar-Flow-HaubeLeicaMZ6
ObjektträgerMarienfeld-superior1000200
Maus Anti-O4 IgM Antikörper Merck MilliporeMAB345
HydromountNational DiagnosticsHS-106
MikroskopNikon EclipseTS100-F
Laminar-Flow-HaubeNuAireNU-543
96-Well-KulturschalenNUNC167008
10-cm-Kulturschalen NUNC150350
ParaffinfolieParafilmPM999
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) beim MenschenPeprotechAF-100-15
Rekombinanter humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)Peprotech100-18B
0,2 &Mikro; m Filter Sartorius Stedim16534-K
0,45 µ m FilterSartorius Stedim16555-K
1,0 N Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-AldrichS2770
1,0 N Salzsäure (HCl)Sigma-AldrichH9892
Trypan Blau Sigma-AldrichT8154
Poly-L-Lysin (PLL) Sigma-AldrichP8920
Paraformaldehyd (PFA) Pulver Sigma-AldrichP6148Giftiges
Rinderserumalbumin (BSA) Pulver Sigma-AldrichA7906
50-Well-Abdeckgläser mit Kammer Sigma-AldrichC7735
Rührplatte mit HeizfunktionStuartUC152
DMEM/F12 MediumThermo Fisher Scientific11320-033
B27 NahrungsergänzungsmittelThermo Fisher Scientific17504044
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
1x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+ und Mg2+ (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgM-AntikörperThermo Fisher ScientificA21042
Alexa Fluor 594 Anti-Maus-IgG2a-AntikörperThermo Fisher ScientificA21135
Alexa Fluor 647 Anti-Kaninchen-IgG-AntikörperThermo Fisher ScientificA31573
4',6'-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) Thermo FisherScientific D3571
ZellkulturzentrifugeThermo Fisher Scientific  RT1 75002383
PasteurpipettenThermo FisherScientific 10006021
CO2 Inkubator
Belüfteter Abzugshaube
Aspirator
Konfokales Mikroskop
Mikropipetten
Mikropipettenspitzen
Kunststoffpipetten
Mehrkanalpipetten
Glasbecher
Sterile Pinzette
pH-Messgerät

Referenzen

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