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Methodenartikel

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

11.6K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/54457

⸱

9. September 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Zusammenfassung

In - vitro - Plattformen Endothelzellen und Gefäßbiologie zu studieren , um 2D - endothelialen Zellkultur, Strömungskammern mit Polymer oder Glas basierenden Substraten und Hydrogel-basierte Rohrbildungstests weitgehend begrenzt sind. Diese Tests, während informativ, nicht rekapitulieren nicht Lumen Geometrie, richtige extrazellulären Matrix und mehrzelligen Nähe, die bei der Modulation der Gefäßfunktion eine Schlüsselrolle spielen. Dieses Manuskript beschreibt ein Spritzgussverfahren Engineered Gefäße mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 100 & mgr; m zu erzeugen. Microvessels werden durch Impfen Endothelzellen in einem mikrofluidischen Kanal innerhalb einer nativen Typ-I-Kollagen-Hydrogel eingebettet hergestellt. Durch die Integration von Bildung Parenchymzellen in der Kollagenmatrix vor dem Kanal können spezifische Gewebe-Mikroumgebungen modelliert und untersucht werden. Zusätzliche Modulationen der hydrodynamischen Eigenschaften und Medienzusammensetzung ermöglichen Steuerung von komplexen Gefäßfunktion innerhalb des gewünschten Mikro.Diese Plattform ermöglicht die Studie von perivaskulären Zellrekrutierung, Blut-Endothel-Interaktionen, Flussantwort und Gewebe-mikrovaskulären Wechselwirkungen. Ausgeführt microvessels bieten die Möglichkeit, den Einfluss von einzelnen Komponenten eines vaskulären Nische zu isolieren und zu steuern, genau seine chemischen, mechanischen und biologischen Eigenschaften der Gefäßbiologie sowohl in Gesundheit und Krankheit zu studieren.

Einleitung

Die Mikrovaskulatur in jedem Organ hilft , die Gewebemikroumgebung definieren, Gewebe - Homöostase und Entzündung regulieren, Permeabilität, Thrombose und Fibrinolyse 1,2 aufrechtzuerhalten. Mikrovaskulären Endothel, insbesondere ist die Schnittstelle zwischen der Blutströmung und dem umgebenden Gewebe und somit eine kritische Rolle spielt Gefäß- und Organfunktion in Reaktion auf Reize wie hydrodynamischen Kräfte in Modulieren und zirkulierende Cytokine und Hormone 3 bis 5. Das Verständnis der detaillierten Wechselwirkungen zwischen dem Endothel, Blut, und das umgebende Gewebe Mikroumgebung ist für die Untersuchung der Gefäßbiologie und Fortschreiten der Krankheit wichtig. Allerdings sind die Fortschritte , diese Interaktionen in das Studium wurde durch in - vitro - Tools beschränkt behindert , die in vivo mikrovaskulären Struktur rekapitulieren nicht und Funktion 6,7. Als Ergebnis hat sich das Feld und therapeutischen Fortschritt stark auf kostspielige und zeit verlassenraubend Tiermodelle , die oft nicht zum Erfolg beim Menschen 8 zu übersetzen - 10. Während in vivo - Modellen bei der Untersuchung von Krankheitsmechanismen und vaskuläre Funktionen sind von unschätzbarem Wert, sind sie komplex und fehlt oft eine genaue Kontrolle der einzelnen zellulären, biochemischen und biophysikalischen Signale.

Gefäßsystem im ganzen Körper verfügt über eine breite hierarchische Struktur in Verbindung mit expansive kapillaren Betten, optimierte Perfusion und Nährstofftransport gleichzeitig 11 bereitstellt. Zunächst Gefäßformen als primitive Plexus , die 12,13 während der frühen Entwicklung zu einem hierarchisch verzweigten Netzwerk reorganisiert. Obwohl viele der in diesen Prozessen beteiligt sind Signale gut 14 verstanden werden - 16, bleibt es schwer , wie solche Gefäßmuster 15 bestimmt wird. Im Gegenzug diesen Prozess in vitro zu rekapitulieren organisierten Gefäßnetze zu konstruieren hat Bienen schwierig. Viele existierende in vitro Plattformen Vaskulatur, wie zweidimensionale Endothelzellkulturen zu modellieren, fehlen wichtige Eigenschaften wie mehrzelligen Nähe dreidimensionale luminalen Geometrie, Durchfluss- und extrazellulären Matrix. Rohrbildungstests in 3D Hydrogele (Collagen oder Fibrin) 17-19 oder Invasionsassays 20,21 verwendet wurden 23 Endothelfunktion in 3D und ihre Wechselwirkungen mit anderen vaskulären 17,22 oder Gewebezelltypen zu untersuchen. Allerdings montiert Lumen in diesen Tests fehlt Verbunds, der hämodynamischen Strömungs und entsprechende Perfusion. Darüber hinaus verhindert die Neigung zur Gefäß Regression in diesen Rohrbildungstests 24 Langzeitkultur und Reifung , die den Grad der funktionellen Studien begrenzt, die durchgeführt werden können. Somit gibt es einen wachsenden Bedarf in vitro Plattformen der mikrovaskulären Netzwerke zu konstruieren , die in geeigneter Weise modellieren endothelial Eigenschaften und sind in der Lage Langzeitkultur.

Eine Vielzahl von vaskulären Engineering-Techniken haben in den letzten Jahren für medizinische Anwendungen entstanden bei Patienten mit Gefäßerkrankung zu ersetzen oder zu umgehen betroffenen Schiffe. Mit großem Durchmesser Gefäße aus synthetischen Materialien, wie Polyethylenterephthalat (PET), und Polytetrafluorethylen (ePTFE) , haben erhebliche therapeutische Erfolge mit Langzeitdurchgängigkeit (durchschnittlich 95% Durchgängigkeit über 5 Jahre) 25 hatte. Obwohl mit kleinem Durchmesser synthetische Transplantate (<6 mm) in der Regel Komplikationen konfrontiert wie Intimahyperplasie und Thrombopoese 26 - 28, Gewebe mit kleinem Durchmesser Transplantate mit biologischen Material entwickelt haben erhebliche Fortschritte gemacht 29,30. Trotz Fortschritten dieser Art entwickelt, Schiffe, die auf der Mikroskala haben eine Herausforderung geblieben. Um adäquat microvasculature zu modellieren, ist es notwendig, komplexe Netzwerkstrukturen mit suf zu erzeugenreichend mechanische Festigkeit Durchgängigkeit und mit einer Matrix-Zusammensetzung zu erhalten, die für die parenchymalen Zellen und Zellumbau für beide Nahrungsmittelpermeation ermöglicht.

Dieses Protokoll stellt einen neuartigen künstlichen perfundierbaren Gefäßnetz , das eine native in vivo nachahmt mit einem abstimmbaren und steuerbaren Mikroumgebung schaffen 31-34. Das beschriebene Verfahren erzeugt Engineered microvessels mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 100 & mgr; m. Ausgeführt microvessels werden hergestellt durch Perfusion Endothelzellen durch einen mikrofluidischen Kanal, der in weichen Typ eingebettet ist I-Hydrogel-Kollagen. Dieses System hat die Fähigkeit, gemusterten Netzwerke mit offenen Struktur luminalen erzeugen, replizieren multi-zellulären Interaktionen modulieren extrazellulären Matrixzusammensetzung und gelten physiologisch relevanten hämodynamischen Kräften.

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Protokoll

1. Mikrofertigung von Patterned Polydimethylsiloxane (PDMS) mit Network Design

  1. Waferherstellung eine negative Vorlage des Network Design zu erstellen
    1. Erstellen Sie ein Netzwerkmuster mit einem beliebigen Computer-Aided Design (CAD) Software. Stellen Sie sicher, dass die diagonalen Abmessung zwischen dem Einlass und Auslass zwischen den Ein- und Austritts Stauseen auf den Gehäuseeinrichtungen in Zukunft vor, um den Abstand übereinstimmen (siehe 2.1.1).
      Hinweis: Das Design des Musters selbst Brauch beruht auf den spezifischen Forschungsziele des Benutzers abhängig (Abbildung 1 zum Beispiel Muster sehen).
    2. Generieren Sie eine Maske des Netzmuster hochauflösenden Druck mit oder eine Chromphotomaske von einem kommerziellen Anbieter bestellen. Eine detailliertere Protokoll des photolithographischen Prozesses ist an anderer Stelle 35 zur Verfügung.
    3. Reinigen eines 8 "Silizium-Wafer für 5 min bei 100 W mit Sauerstoff-Plasmabehandlung.
    4. Gießen Sie genug Negativphotoresist (SU-82100 funktioniert gut) auf den Wafer, so dass die Formen einen Klecks mit einem Durchmesser von 2,5 cm widerstehen. Mit Hilfe eines Spin-Coater, drehen Sie das Wafer bei 500 Umdrehungen pro Minute mit 100 Umdrehungen pro Minute / sec Rampe und halten für 10 Sekunden. Rampe dann mit 300 rpm / sec bis 1600 rpm und 30 Sekunden halten. Hinweis: Die Geschwindigkeit und die Rampe müssen für jeden Laborbedingung optimiert werden, um eine Dicke von 150 & mgr; m Resists ergeben.
    5. Soft-bake dem Wafer bei 65 ° C für 7 min, Rampe bis zu 95 ° C mit 360 ° C / h und 45 min aufrechterhalten. Langsam auf Raumtemperatur auf der heißen Platte nach unten. Impressum das Gefäßmuster auf den beschichteten Wafer durch Belichtung mit 365 nm UV - Licht unter einer Chrom - Photomaske, mit der Exposition das Dreifache der Herstellerempfehlung (350 mJ / cm 2 für eine SU-8 Dicke von etwa 150 & mgr; m).
      Hinweis: Da SU-8 ist ein Negativ-Resist, die belichteten Bereiche (alles außer dem Musterentwurf) wird 1.1.7 in Schritt in den Entwickler unlöslich werden.
    6. Hart backen dem belichteten Wafer bei 65° C für 5 min und mit 360 ° C / h auf 95 ° C hochzufahren und für 25 Minuten halten, dann lassen Sie es langsam auf der heißen Platte auf RT abkühlen.
    7. Tauchen Sie die Wafer in SU-8-Entwickler 10 - 15 min abzuwaschen nicht belichteten Resist dann sauber mit Isopropylalkohol und trocken unter einem komprimierten Stickstoffstrom. Überprüfen Sie das Muster unter einem Lichtmikroskop die SU-8-Resist, um sicherzustellen, ist gut mit dem Wafer verbunden (suchen Sie nach unerwünschten Peeling und Blasen).
    8. Messen der Dicke der Mustermerkmale unter Verwendung eines Profilometers gemäß den Anweisungen des Herstellers 36. Während der Messwerterfassung vermeiden Bereiche der Struktur , die für die Netzwerkfunktion essentiell sind (dh Einlaß- und Auslaßleitungen) als Kontakt basierend Profilometer könnte die strukturelle Integrität der strukturierten Merkmale auf dem Wafer beeinträchtigen. Alternativ können Sie einen berührungsloses Verfahren (dh optische Profilometer) insgesamt um dieses Problem zu vermeiden.
  2. Geration von Patterned und Flachpressformen für das Collagen Molding
    Hinweis: Behandeln Sie Silane innerhalb einer chemischen Abzugshaube.
    1. Platzieren des Wafers in einem Exsikkator mit 100 ul Trichlor (3,3,3-trifluorpropyl) silan für 2 Stunden die Oberfläche silanisiert.
    2. Übertragen silanisierte Wafer in eine 120 x 120 mm im Quadrat Petrischale. Gießen gemischt und entgastem PDMS-Elastomer und Härter (10: 1 w / w-Verhältnis) über den Wafer 4 zu erreichen - 6 mm Dicke. Gießen Sie zusätzliche PDMS in eine separate 120 x 120 mm im Quadrat Petrischale flache Formen ohne Muster zu erzeugen. Härtung bei 65 ° C für 2 Stunden.
    3. Aus dem Ofen nehmen und lassen Sie die PDMS auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Mit schneiden mit einem Skalpell vorsichtig ein Quadrat um die SU-8 und langsam die PDMS-Form aus dem Wafer abzulösen. Schneiden Kanten bis 30 mm x 30 mm. Für flache Formen, schneiden PDMS ohne Prägemuster in quadratische Stücke etwa 40 mm x 40 mm gehärtet.

2. Gehäuse Devices

  1. fabricatIon von oben und unten Gehäuseteile
    1. Fabrizieren Behältergehäuse unter Verwendung von Poly (methylmethacrylat) (PMMA). die Teile von einem Standard-Maschinenwerkstatt mit CNC-gesteuerten (CNC) Fräsfunktionen Zur Herstellung und bestellen. Siehe Abbildung 1 eine schematische Darstellung der oberen und unteren Teile.
    2. Gestalten Sie das Gehäuseoberteil (1D) enthalten eine 20 mm x 20 mm und an der Unterseite des Gerätes mit einer Tiefe von 1 mm, zwei Kollagen Injektionsöffnungen (4 mm Durchmesser) auf der Oberseite des Gerätes an den Ecken des Platzes gut, zwei Ein- und Auslaufreservoirs mit 6 mm Durchmesser und vier Schraubenlöcher (3 mm Durchmesser) an den vier Ecken des Geräts.
      Anmerkung: Zusätzliche Löcher können an der Peripherie des Stücks zur Handhabung Zwecke gebohrt werden.
    3. Gestalten Sie das untere Gehäuseteil (Abbildung 1E) ein quadratisches Loch in der Mitte zu umfassen (Abmessungen 15 mm x 15 mm) mit einer umlaufenden 25 mm x 25 mmRegal mit einer Tiefe von 0,25 mm. Bohren Sie 4 Schraubenlöcher mit 4-40 Gewinde. Sicherstellen, dass die Schraubenlöcher in der unteren und oberen Teilen decken zusammen bei zukünftigen Montageschritte.

3. Mikrogefäßbauelementherstellung

  1. Herstellung von Materialien
    1. Waschen und Autoklaven zwei Sätze von Pinzette, ein Spatel aus rostfreiem Stahl, einem kleinen flachen Schraubendreher, Schrauben aus Edelstahl, und mehrere Edelstahlpassstifte. Für die Herstellung der Gefäße, auch mikro PDMS Formen Autoklaven, PDMS flach Quadrate, Glasplättchen (22 x 22 mm) und Baumwolle Stücke.
    2. Sterilisieren der PMMA Gehäuseteile in Bleichmittel für mindestens 1 Stunde, dann spülen mit autoklavierten Wasser in der Gewebekultur Haube zweimal, und an der Luft trocknen in sterilen Gewebekulturschalen (150 mm x 25 mm).
  2. Sterile Polyethylenimin-Glutaraldehyd (PEI - GA) Beschichtung
    1. Behandeln innere Vertiefungen trocken sterilisiert PMMA Stückemit Plasma etwa 1 min. 1% Polyethylenimin (PEI) auf die inneren Brunnen (die 20 mm im Quadrat und auf der Oberseite und der 25 mm im Quadrat Regal auf der Unterseite) der PMMA-Stücke für 10 min. Spülen mit sterilem H 2 O und erlauben in der Gewebekultur - Haube trocknen.
      Hinweis: Die Zeit für die Plasmabehandlung in Abhängigkeit von der verwendeten Gerätevariable ist - sollte das PEI verbreitet leicht eine hydrophile Oberfläche anzeigt. Falls nicht, können zusätzliche Plasmabehandlung erforderlich sein.
    2. Gelten 0,1% Glutaraldehyd (GA) auf PEI für 30 min Oberflächen der Stücke PMMA behandelt. Spülen Sie zweimal mit sterilem Wasser und trocknen lassen.
      Hinweis: In zukünftigen Schritten wird Kollagen anhaften kollagen Glutaraldehyd Vernetzung der beschichteten Oberfläche durch. Dies hilft, das Gel an Ort und Stelle innerhalb der Vorrichtung bei zukünftigen Montageschritte und während der gesamten Vorrichtung Kulturperiode zu sichern.
  3. Collagen Gel Vorbereitung
    1. Fabrizieren Gefäße mit 0,6% - 1% KollagenLösungen. Um Typ 0,75% Kollagen für Gefäßherstellung, mischen I - Kollagen - Stammlösung (1,5% - isoliert aus Rattenschwänzen 37) mit Natriumhydroxid (NaOH), 10x Medien Supplement (M199) und Zellkulturmedien. Halten Sie alle Lösungen auf dem Eis.
    2. Bestimmen Sie das Volumen von Kollagen durch die folgende Gleichung, wobei V ƒinal das endgültige Volumen des Gels ist erforderlich ( in der Regel 1 ml Kollagen pro Gerät ausreichend ist), V Lager Kollagen ist das Volumen der Lager Kollagen benötigt, Kollagen C Lager ist die Konzentration der Vorrats Kollagen und C ƒinal Kollagen ist die gewünschte Konzentration des Kollagens in dem Gefäß.
      figure-protocol-1
    3. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze das entsprechende Volumen an Lager Kollagen zu einem neuen 30 ml konischen Röhrchen zu übertragen. Bestimmen Sie die Volumina der Neutralisierungs NaOH (V NaOH), M199 10x Medien ergänzen(V 10 X), und Zellkulturmedien (V 1 X) wie folgt und getrennt in einem 15 ml konischen Röhrchen vermischen:
      figure-protocol-2
    4. Fügen Sie die Mischung von neutralisierenden Reagenzien (V 10 X, V NaOH, V 1 X) an den aliquotierten Kollagen, und mit einem kleinen Spatel sanft die Lösung zu mischen , bis ein homogenes Gel erhalten wird. Vermeiden Sie Blasen durch Rühren langsam und sanft eingeführt werden.
    5. (- 20 Millionen Zellen / ml beispielsweise 0,5), fügen die Zellen zu der Kollagenlösung , nachdem sie mit den neutralisierenden Reagenzien gemischt wird, und weiter rühren , bis die Zellen homogen verteilt sind , um Zellen in die Matrix in der gewünschten Konzentration einzuarbeiten.
    6. Wenn Zellen hinzugefügt werden, die Lautstärke von Zellkulturmedien das zusätzliche Volumen aufzunehmen, wie durch die folgende Gleichung bestimmt, wobei V Zellen </ sub> das erforderliche Volumen der Zellsuspension ist, C ƒinal Zelldichte die gewünschte Dichte der Zellen in dem Gefäß ist C Suspensionszelldichte in der Stammlösung , die Dichte der Zellen.
      figure-protocol-3
  4. Collagen Injection - Top Stück
    1. Legen Sie die mikro PDMS-Form in einer 100 mm x 20 mm Schale. Plasma die PDMS-Form für 1 min reinigen.
    2. Richten Sie die obere PMMA Stück auf der Oberseite der PDMS - Form , so dass die quadratischen Reservoirs auf der Form direkt unter den Ein- und Austritts Stauseen sind (siehe Abbildung 1D - gestrichelte Linien). Legen Sie die Edelstahl Passstifte in die Einlass- und Auslass-Reservoir Löcher auf der Oberseite PMMA Stück freien Zugang aus den Behältern auf das Muster zu halten.
    3. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze ~ 0,5 zu extrahieren - 0,6 ml Kollagen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Spritze verbleiben.
    4. Drücken Sie lightly mit einer Pinzette auf dem oberen Gehäuse bündig Kontakt zwischen dem Oberteil und der PDMS-Form zu gewährleisten. Injizieren Kollagen langsam durch eine Injektionsöffnung auf der Oberseite PMMA Stück. Überprüfen Sie, ob Kollagen im 20 mm x 20 mm Domäne über dem Muster füllt und leckt nicht aus.
    5. Schließen Sie das Gericht, ohne die Passstifte drängeln und lassen für 30 Minuten in einem 37 ° C Inkubator zu gelieren.
  5. Collagen Injection - Bodenstück
    1. Legen Sie ein 22 x 22 mm Deckglas in der Mitte des unteren Teils. Verwenden, um eine 1 ml Spritze ~ 0,25 ml Kollagen gleichmäßig auf den Objektträger aus Glas zu verzichten. Die PDMS flaches Quadrat über das Kollagen vorsichtig senken, die PDMS flach auf dem PMMA sichergestellt und es gibt keine eingeschlossenen Luftblasen. Erlauben bei 37 ° C für 30 min zu gelieren.
  6. Gerätemontage
    1. Nach dem Gelieren, fügen Sie genug PBS um das flache PDMS Stück auf dem Unterteil der PDMS (ca. 1 ml) zu umgeben. Verwenden einer Pinzette eine beliebige E zu entfernenxcess Kollagen an den Rändern, und langsam das PDMS Stück abziehen. Fügen Sie mehr PBS auf dem Kollagen Hydratation beizubehalten.
    2. Um das obere Stück herzustellen, verwenden Pinzette die obere PMMA Stück zu holen und es umdrehen, so dass die PDMS-Form an der Spitze ist. Fügen Sie ein paar Tropfen PBS auf die Schnittstelle, dann schnell und fest die PDMS-Form aus dem oberen PMMA Stück entfernen.
    3. Sanft Edelstahl Paßstifte von der anderen Seite des Gehäuses unter Verwendung eines anderen PMMA Pinzette entfernen. Fügen Sie mehrere Tropfen PBS auf die mikro Kollagen. Drehen Sie die PMMA-Stück über, so dass das Kollagen nach unten zeigt und legen 4 Schrauben in die Ecke Löcher.
    4. Sanft legen Sie das Oberteil auf der Oberseite des unteren Teils, auf dem Bodenstück die Schrauben mit den Eckbohrungen ausrichten. Nicht erlauben, die beiden Teile gegeneinander gleiten können. Verwenden Sie einen Schraubendreher, um die Schrauben anzuziehen eine sanfte Berührung mit. Nicht zu fest anziehen.
    5. Absaugen PBS die PMMA-Oberflächen umgeben und legen Sie eine kleine piece von Baumwolle unter einer Kante des Geräts. Mit einer Pipette entfernen Sie das PBS aus den Vorratsbehältern und ersetzen mit Zellkulturmedien. Lassen Sie das Gerät zu gelieren zusammen in einem 37 ° C Inkubator für mindestens 1 Std.
  7. Zellaussaat
    1. Kultur menschlicher Nabelvenen - Endothelzellen (HUVECs) in endothelialen Wachstumsmedium bei 37 ° C (CO 2, O 2) bis zur Konfluenz 38. Wann immer möglich, verwenden Sie zwischen den Kanälen 4 und 7.
    2. Trypsinize Endothelzellen durch mit 6 ml PBS, die Kulturflasche gewaschen und dann Zugabe von 2 ml 0,05% Trypsin bei 37 ° C um die Zellen zu dissoziieren. Lassen Sie die Zellen in Trypsin, bis die meisten der Fokaladhäsionen abgelöst haben, und die Zellen sind abgerundet (dies dauert in der Regel etwa 2 - 3 min). Stoppen Sie die Trypsin Reaktion von 4 ml endothelialer Wachstumsmedien Zugabe enthält fötalen Rinderserum (FBS). Waschen Sie die Flasche mit den Medien mehrmals die Zellen zu gewährleisten, aus dem Kolben gelöst und sammelnin einem konischen Röhrchen.
    3. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren sie bei einer Dichte von 10 Millionen Zellen pro ml. Entfernen Sie alle Zellkulturmedien von den Ein- und Austritts Stauseen. Mit Hilfe eines 200 ul Gel Lade Spitze, mit 10 & mgr; l Zellsuspension in der Mitte des Einlassreservoir. Die Zellen sollten beginnen, in das Netz fließen sofort und Mantel das Netzwerk.
    4. Nach Zugabe von 200 ul Medien gleichmäßig auf beide Behälter und lassen Zellen anhängen und verbreiten innerhalb des Netzwerks für mindestens 1 Stunde.
  8. Geräte - Kultur
    1. Kultur die Vorrichtung mit Schwerkraft angetrieben Fluss durch das Netzwerk durch Zugabe von 200 ul Zellkulturmedien zu dem Einlassreservoir und 50 & mgr; l zu dem Auslass-Reservoir. Bei dieser Art der Kultur, ersetzen Medien alle 12 Stunden endotheliale Lebensfähigkeit zu erhalten.
      Hinweis: Wenn kontinuierliche Strömung Kulturbedingungen wünschenswert sind (konstante Schubspannung zu halten, sammeln Medien am Ausgang, etc.) ein SYRinge Pumpe kann anstelle der Schwerkraft angetrieben Kultur verwendet werden.
    2. Lassen Sie die ausgesäten Endothelzellen mindestens 24 Stunden zu befestigen und zu stabilisieren, bevor kontinuierlichen Strom angelegt wird. Vor dem kontinuierlichen Fluss Setup, halten die Geräte mit der Schwerkraft angetriebenen Strömungsverhältnisse.
      HINWEIS: Die Medienbedingungen für angewandte Strömung unterscheiden sich von der Schwerkraft angetrieben Kultur. Die Zugabe eines Plasmaexpander, wie Dextran, auf das Medium stabilisiert die engineered microvessels und verhindert vaskulären Kollaps während anhaltender Perfusion 39.
    3. Medien für kontinuierlichen Fluss Setup machen, lösen sich 3,5% Dextran (70 kDa) in endothelialen Wachstumsmedien für optimale Gefäßkultur. Unter Verwendung einer sterilen Technik füllen 10 ml Spritzen mit endothelialen Wachstumsmedium mit 3,5% Dextran.
    4. Vorbereiten eines sterilen Kulturschale für die Strömung durch Löcher in der Seitenwand einer Petrischale mit einem Lötkolben schmelzen.
    5. Bringen Sie 12 "Silikonschlauch (1/32" ID) zu einem Luer-Lock-Kupplung (weiblich, 1/16 "ID) und ein 1 /16 "geraden Rohr-Rohrverbinder mit einem 1" Schlauchsegment am anderen Ende. Legen Sie eine 1/4 "20G stumpfe Nadel (von der Nadelnabe Haus) mit dem freien Ende des 1" Segment. Auch ein 3 "Schlauchsegment vorbereiten zu einem Rohr-zu-Rohr Winkel 90 ° Anschluss Gelenk befestigt (im Gehäuseeingang eingebaut werden). In den folgenden Schritten wird der längere Schlauch durch die vorbereitete Schale geschraubt werden und an die 3 "Segment über die 20 G-Nadel. Outlet Schlauch sollte Zulaufschlauch, wobei ein freies Ende anstelle eines Luer-Lock-Kupplung spiegeln. Autoclave alle Segmente vor der Verwendung.
    6. Gewinde autoklaviert Eintritts- und Austrittsrohrdurchgangslöcher in die vorbereitete Schale. Bringen Sie 3 "Segmente Innen 20 G Nadeln. Bringen Sie den Luer-Lock-Kupplung an die Medien Spritze und perfuse Medien durch den Schlauch mit der Spritzenpumpe mit einer hohen Strömungsgeschwindigkeit eingestellt. Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen im Schlauch oder Stecker sind, da diese Strömung zu dem Behälter zu behindern.
    7. Legen Sie die connector Gelenk in den Gehäuseeinlass. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussrate und beginnen Perfusion.
      ANMERKUNG: Dies kann in Abhängigkeit von der Behältergeometrie und experimentellen Bedingungen der angewandten Scherspannungen eingestellt werden. Für einen 100 & mgr; m Durchmesser Kanal, einer Flussrate von 3 & mgr; l / min gut funktioniert.
    8. Falls gewünscht, sammeln Perfusat mit Schlauch vorbereitet Auslass eine sterile 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit 500 ul Medium eingelegt in.
      Hinweis: Eine geringe Menge an Medien ist mit dem Sammelrohr hinzugefügt Blasenbildung zu verhindern, die Strömung blockieren.
    9. Je nach Strömungsgeschwindigkeit, müssen die Spritze kann nach 24 bis 36 Stunden wieder aufgefüllt werden. Dies wird durch das Entfernen des Verbinders von dem Gehäuseeinlass, Ersetzen der Spritze durchgeführt und ermöglicht Medien mit einer hohen Strömungsrate für mehrere min zu perfundieren. Diese Folge stellt sicher, daß Luftblasen werden nicht in die Rohrleitung eingeführt. Setzen Sie die Pumpe auf die gewünschte Durchflussrate für Kultur, stecken Sie den Stecker in die Gehäuseeinlass undRückkehr in den Inkubator.

4. Geräteanalyse

  1. Permeability Analyse
    1. Anwendung 40 kDa FITC-Dextran die Durchlässigkeit des Behälters in situ zu visualisieren. Legen Sie das Behältergehäuse auf einem konfokalen Mikroskop und konzentrieren sich an der Behälterebene. In 5 uM 40 kDa FITC-Dextran mit dem Einlass und Bild mit 4-facher Vergrößerung, 25 ms Belichtungszeit und bei 1 Bild pro Sekunde für 10 min.
    2. Analysieren der Bildserie mit Analysecode der Permeabilität von Dextran über die Gefäßwand in Kollagen (um / s) zu schätzen basierend auf einem Modell von Zheng et veröffentlicht. al. 31.
  2. Immunostaining & konfokale Bildanalyse
    1. Um dies zu beheben Gefäße, perfuse mit 3,7% Formaldehyd durch den Einlass 20 min und Wasch durch Perfusion PBS dreimal (20 Minuten pro Waschgang). Block unspezifische Antikörperbindung mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Triton X-100 pedurch das Netzwerk für 1 h rfused. Perfundieren primären Antikörperlösungen über Nacht bei 4 ° C und waschen dreimal mit PBS. Perfuse sekundären Antikörperlösungen für 1 bis 2 h und waschen wieder mit PBS auf die gleiche Weise.
    2. Immunofluoreszenz nehmen Bilder von Mikrogefäßen in situ ein konfokales Mikroskop mit einem z-Schritt von 1 & mgr; m verwendet wird . Bild die microvessels bei einer Vergrößerung von 4X, 10X oder 20X.
      Hinweis: Die Vergrößerung des 4X liefert globale Netzwerk Strukturinformationen, während 10X und 20X vergrößerten Bildern zelluläre Details liefern wird, wie Dehnung, Kreuzung Bildung usw.
    3. Analysieren Sie die Bildstapeln mit ImageJ mit Z Projektionen (Bild / Stacks / Z-Projekt), Querschnitte (Bild / Stacks / Orthogonal-Ansicht) und 3D-Rekonstruktionen (Bild / Stacks / 3D-Projekt).
  3. Rasterelektronenmikroskopie Imaging
    1. Für die Elektronenmikroskopie - Analyse, fix in situ durch Perfusion halber Stärke Karnovsky des Solution (2% Paraformaldehyd / 2,5% Glutaraldehyd in 0,2 M Cacodylatpuffer) über Nacht. Zerlegen Sie den Behälter und sorgfältig trennen die beiden Stücke. Schneiden Kanten und tauchen vollständig in der Fixierungslösung für mehrere Tage.
    2. Tauchen Sie den dicken oberen Teil des Behälters in 25% Glutaraldehyd für 20 min und spülen dreimal mit PBS (2 min jeweils). Entwässern in serielle ethanol Waschungen mit 50%, 70%, 85% (2 min jeweils) und zwei Waschungen in 100% Ethanol (jeweils 5 min).
    3. Bereiten Sie die Probe für die Analyse mit weiteren Dehydratisierung durch Trocknen am kritischen Punkt gemäß dem Protokoll des Herstellers 40. Sputter Mantel des Gefäßes mit Gold-Palladium (7 nm) und zu analysieren, unter einem Rasterelektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 5 kV, Fleckgrße 3.

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Ergebnisse

Die konstruierte Schiff Plattform schafft funktionelle microvasculature in einem natürlichem Kollagen Typ I Matrix eingebettet und ermöglicht eine strenge Kontrolle der zellulären, biophysikalische und biochemische Umgebung in vitro. Engineered microvessels, humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) herzustellen sind durch die kollagen eingebettet mikrofluidischen Netzwerk durchbluteten, wo sie legen ein Patent Lumen und konfluenten Endothel zu bilden. Wie in 1A-C<...

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Diskussion

Engineered microvessels sind ein in vitro - Modell , wo physiologische Eigenschaften wie luminalen Geometrie, hydrodynamischen Kräfte und mehrzelligen Wechselwirkungen vorhanden und abstimmbaren sind. Diese Art von Plattform ist in leistungsstark , dass es bietet die Möglichkeit , endothelial Verhalten in einer Vielzahl von Kontexten zu modellieren und zu studieren , wo die in vitro Kulturbedingungen können zu der der Mikroumgebung in Frage abgestimmt werden. Zum Beispiel werden die Antriebsmechanismen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren möchten die Lynn und Mike Garvey Imaging Labor am Institut für Stammzell und Regenerative Medizin, sowie die Washington Nanofabrication Einrichtung an der Universität von Washington zu bestätigen. Sie erkennen auch die finanzielle Unterstützung des National Institute of Health gewährt DP2DK102258 (zu YZ) und die Ausbildung gewährt T32EB001650 (bis SSK und MAR) und T32HL007312 (MAR).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Wafer Fabrication
AutoGlow PlasmasystemAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc PWM32 Spin Coater 
ABM Contact AlignerAB-M
Alpha Step ProfilometerTencorAlpha Step 200
SU-8 EntwicklerMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8" SiliziumWafer World Inc.
Tisch-Mikromustergenerator HeidelbergInstrumentsμ PG 101Zur Herstellung von Fotomasken
HeizplatteVWR97042-646
IspropylalkoholAvantor Performance Materials9088
Petrischalen (120 x 120 mm, quadratisch)Sigma-AldrichZ617679
Trichlor(3,3,3-trifluorpropyl)silanSigma-AldrichMKBG3805V
Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerbasis und HärterDow CorningSylgard 184Gemischt bei 10:1 (w/w)
VakuumexsikkatorSigma-AldrichZ119024-1EA
OfenVWR9120976
Device Fabrication and Culture
Poly(methylmethacrylat) (PMMA)Plexiglas
Corona-BehandlerElectro-Technic Products, Inc.BD-20Handgerät für die Plasmabehandlung von PMMA-Geräten und PDMS-Formen
LötkolbenWeller WTCPS
Edelstahl Fachwerkkopf Schlitz MaschinenschraubeMcMaster-Carr 91785A096
Edelstahl-PassstifteMcMaster-Carr 93600A060
Pinzette Miltex24-572Jede ähnliche Pinzette kann verwendet werden
Spatel (Mikrolöffel)Elektronenmikroskopie Dienstleistungen62410-01
SchraubendreherJeder Schlitzschraubendreher kann verwendet werden, autoklavierte
Glasdeckgläser (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
BleachClorox4460030966
Petrischalen (150 x 25 mm)Corning430599
Petrischalen (100 x 20 mm)Corning2909
Baumwolle, in 1 cm x 3 cm große StückeAutoklaviertes
Polyethylenimin (PEI)Sigma-AldrichP3143Wasser in Zellkultur auf 1 % verdünnen
GlutaraldehydSigma-AldrichG6257Wasser in Zellkultur auf 0,1 % verdünnen
Steriles H2OAutoklaviertes DI H2O
Typ I Kollagen, gelöst in 0,1% EssigsäureIsoliert aus Rattenschwänzen, wie beschrieben in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml SpritzeBD309659
10 ml SpritzeBD309604
15 ml konische RöhrchenCorning352097
30 ml konische RöhrchenCorning352098
M199 10x MedienLife Technologies11825-015
1 N NaOH (steril)Sigma-Aldrich415413Verdünnung auf 1 N in Wasser in Zellkulturqualität
HUVECsLonza
CC-3124
TrypsinCorning25-052-CI
Fötales Rinderserum (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Dextran aus Leuconostoc spp. (70  kDa)Sigma-Aldrich31390
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Corning21-031-CV
HämozytometerHausser Scientific Co.3200
Gel-LadespitzenVWR37001-152
18 G Blunt Fill NadelBD 305180
20 g Edelstahl DosiernadelMCMASTER-Carr75165A123
Tygon 1/32" ID, 3/32" OD SilikonschlauchCole-ParmerEW-95702-00
1/16" Rohr-zu-Rohr-KupplungMcMaster-Carr5116K165
90° Winkelverbinder, Rohr-zu-RohrMcMaster-Carr5121K901
Luer-Lock-Kupplung (weiblich, 1/16" ID)McMaster-Carr51525K211
Kunststoffzange mit BackengriffenElektronenmikroskopie Dienstleistungen72971
DoppelspritzenpumpeHarvard Apparatus70-4505
5 ml Polystyrol-RundbodenröhrchenFisher Scientific14-959-2A
Device Analysis
FormaldehydSigma-AldrichF8775
RinderserumalbuminSigma-AldrichA8806-5G
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Kaninchen anti-hCD31Abcamab324571:25 Arbeitsverdünnung
FITC-konjugierter Anti-von-Willebrand-Faktor-AntikörperAbcamab88221:100 Arbeitsverdünnung
Ziege Anti-Kaninchen 568 SekundärantikörperThermofisher ScientificA-110111:100 Arbeitsverdünnung
HoeschtThermofisher ScientificH1399Resuspendiert in DMSO
NatriumcacodylatSigma-AldrichC0250Zur Herstellung von 0,2 M Cacodylatpuffer
EthanolVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa FITC-konjugiertes DextranSigma-AldrichFD40S 
Zusätzliche Kulturreagenzien 
CHIR-99021Selleck ChemS2924niedermolekularer GSK-3-Inhibitor
Humaner rekombinanter VEGFPeprotech100-20
Humaner rekombinanter bFGFPeprotechAF-100-18B
geschnitten In In Endotheliale Wachstumsmedien Lonza

Referenzen

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