Nachweis des pH-abhängige Aktivität von<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; und<em&gt; In Vivo</em

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt biophysikalischen, biochemischen und molekularen Techniken , um die Chaperon - Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren pH - Bedingungen zu charakterisieren. Diese Verfahren wurden für andere Säureschutz Chaperone wie HdeA erfolgreich angewendet und kann modifiziert werden, um andere Chaperone und Belastungsbedingungen zu arbeiten.

Zusammenfassung

Bakterien werden häufig auf Umweltveränderungen ausgesetzt ist, wie beispielsweise Veränderungen in pH, Temperatur, Redox-Status, Lichtexponierung oder mechanische Kraft. Viele dieser Bedingungen verursachen Proteins in der Zelle entfaltet und nachteilige Auswirkungen auf das Überleben des Organismus. Eine Gruppe von unabhängigen, Stress spezifische molekulare Chaperone gezeigt wesentliche Rolle für das Überleben dieser Stressbedingungen wurden spielen. Während vollständig gefaltet und Chaperon-inaktiv vor Stress, diese Proteine ​​schnell entfalten und werden Chaperon-aktiv unter bestimmten Stressbedingungen. Einmal aktiviert, wobei diese bedingt ungeordneten Chaperone binden an eine Vielzahl von unterschiedlichen aggregationsanfällig Proteine, verhindern ihre Aggregation und entweder direkt oder indirekt Protein bei der Rückkehr in Nichtstressbedingungen Rückfaltungs erleichtern. Der primäre Ansatz ein detaillierteres Verständnis über den Mechanismus ihrer Aktivierung und Client-Erkennung für die Gewinnung umfasst die Reinigung und subsequent Charakterisierung dieser Proteine in vitro - Assays unter Verwendung von Chaperon. Follow-up - in - vivo - Stress - Tests sind absolut notwendig , um unabhängig die in - vitro - Ergebnisse bestätigt werden können .

Dieses Protokoll beschreibt in vitro und in vivo - Verfahren der Chaperon - Aktivität von E. Charakterisierung coli HdeB, ein säureaktivierter Chaperon. Lichtstreuungsmessungen wurden als bequeme Auslese für HdeB Fähigkeit verwendet , um säureinduzierte Aggregation eines etablierten Modell Client Protein, MDH, in vitro zu verhindern. Analytische Ultrazentrifugation Experimente wurden angewandt, um die Komplexbildung zwischen HdeB und ihrem Kunden Protein LDH zeigen, Licht in das Schicksal von Client-Proteine ​​nach ihrer Rückkehr in Nicht-Stress-Bedingungen zu vergießen. Die enzymatische Aktivität Assays der Client-Proteine ​​wurden durchgeführt, um die Auswirkungen von HdeB auf pH-induzierte Client-Inaktivierung und Reaktivierung zu überwachen. Schließlich wurden die Überlebensstudien verwendet monitor den Einfluss von Chaperon - Funktion des HdeB in vivo.

Einleitung

Eine gemeinsame natürliche Umgebung , in der mikrobiellen Krankheitserregern Entfaltungsbedingungen Säure-induzierte Protein erleben , ist die Säugetier-Magen (pH - Bereich 1-4), deren sauren pH - Wert dient als eine wirksame Barriere gegen Krankheitserreger in Lebensmitteln ^1. Proteinentfaltung und Aggregation, die durch Aminosäure-Seitenkette Protonierung verursacht wird, beeinflusst biologische Prozesse, Schäden Zellstrukturen und letztendlich verursacht Zelltod ^1,2. Da der pH - Wert der bakteriellen Periplasma fast augenblicklich mit dem Umwelt pH äquilibriert durch die freie Diffusion von Protonen durch die poröse äußere Membran periplasmatische und inneren Membranproteine von Gram-negativen Bakterien sind die empfindlichsten Zellkomponenten unter sauren Stressbedingungen ^3. Um ihre periplasmatischen Proteom gegen eine schnelle Säure-vermittelte Schädigung, Gram-negative Bakterien verwenden, um die säureaktivierten periplasmatischen Chaperonen HdeA und HdeB schützen. HdeA ist eine bedingt ungeordnet Chaperon ^{4,5: Bei neutralem pH - Wert, ist HdeA vorhanden als gefaltete, Chaperon-inaktive Dimer. Bei einem pH - Verschiebung unter pH 3 wird HdeA die Chaperon - Funktion aktiviert schnell 6,7. Die Aktivierung von HdeA erfordert grundlegenden strukturellen Veränderungen, einschließlich der Dissoziation in Monomere, und die teilweise der Monomere Entfaltung 6-8. Einmal aktiviert, bindet HdeA an Proteine, die unter sauren Bedingungen entfalten. Es verhindert effektiv ihre Aggregation sowohl bei der Inkubation bei niedrigem pH-Wert sowie bei pH Neutralisation. Nach der Rückkehr auf pH 7,0, erleichtert HdeA die Neufaltung seiner Client - Proteine in einem ATP-unabhängige Art und Weise und wandelt wieder in seine dimere, Chaperon-inaktive Konformation 9. In ähnlicher Weise ist die homologe Chaperon HdeB auch Chaperon-inactive bei pH 7,0. Im Gegensatz HdeA jedoch erreicht HdeB die Chaperonaktivität seine scheinbare Maximum bei pH 4,0, Bedingungen , unter denen HdeB noch weitgehend gefaltet und dimeren 10. Außerdem senken, ferner mit den pH-Wert causes die Inaktivierung von HdeB. Diese Ergebnisse legen nahe, dass trotz ihrer umfangreichen Homologie, HdeA und HdeB in der Art ihrer funktionellen Aktivierung unterscheiden und ihnen so einen breiten pH-Bereich mit ihren Schutz Chaperon-Funktion zu decken. Einem anderen Chaperon, die in der Säurebeständigkeit von E. beteiligt ist coli ist die zytoplasmatischen Hsp31, die wiederhergestellt werden entfaltete Client - Proteine bis neutralen Bedingungen zu stabilisieren scheint. Die genaue Art der Hsp31-Aktion hat sich jedoch blieb rätselhaft 12. Da die anderen enteropathogenen Bakterien, wie Salmonella , die hdeAB Operon fehlt, ist es sehr wahrscheinlich , dass andere noch nicht identifizierte periplasmatischen Chaperonen könnte existieren , die in der Säurebeständigkeit dieser Bakterien 11 beteiligt sind.}

Die Protokolle hier vorgestellten erlauben die pH-abhängige Aktivität von Chaperon HdeB in vitro und in vivo ¹⁰ zu überwachen und angewendet werden kann , andere Chaperone zu untersuchenwie Hsp31. Alternativ kann das komplexe Netzwerk von Transkriptionsfaktoren, die die Expression steuern hdeAB potentiell durch den Assay in vivo Stress untersucht werden. Um die Chaperon - Funktion von Proteinen in vivo verschiedene Versuchsanordnungen charakterisieren können angewendet werden. Ein Weg ist die Proteinentfaltungsstressbedingungen anzuwenden und phänotypisch mutante Stämme zu charakterisieren, die entweder das interessierende Gen überexprimieren oder eine Deletion des Gens tragen. Proteom - Studien können durchgeführt werden , um festzustellen , welche Proteine nicht mehr Aggregat unter Stressbedingungen , wenn das Chaperon vorhanden ist, oder der Einfluss eines Chaperons auf einem bestimmten Enzym kann bei Stress - Bedingungen unter Verwendung von enzymatischen Assays ^14-16 bestimmt werden. In dieser Studie haben wir uns für HdeB in einer rpoH Deletionsstamms überexprimiert, die den Hitzeschock - Sigma - Faktor 32 fehlt RpoH den Ausdruck aller wichtigen E. steuert coli Chaperone und deren Löschung ist bekannt sens zu erhöhenitivity auf Umweltstressbedingungen , die Proteinentfaltung ¹⁵ verursachen. Die in - vivo - Chaperon - Aktivität von HdeB wurde durch Überwachung ihrer Fähigkeit bestimmt , den pH - Empfindlichkeit des Δ rpoH Stamm zu unterdrücken. Insgesamt ist die hier vorgestellten Protokolle einen schnellen und einfachen Ansatz liefern die Aktivität eines säureaktivierten Chaperon in vitro als auch in der in vivo - Kontext zu charakterisieren.

Protokoll

1. Expression und Reinigung von periplasmatischen HdeB

HINWEIS: HdeB wurde in E. ausgedrückt coli - Zellen , die das Plasmid pTrc- hdeB ¹⁰ und gereinigt aus dem Periplasma auf Polymyxin Lyse beherbergen.

1. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von E. coli - Zellen , die das Plasmid pTrc- hdeB ¹⁰ in 30 ml LB , enthaltend 200 ug / ml Ampicillin (LB _Amp) beherbergt. Beimpfen von vier 1 l - Kulturen von LB _Amp wachsen und sie bei 37 ° C und 200 rpm bis OD _600nm von 0,7 erreicht ist. Dann fügen 300 uM IPTG die Expression von HdeB zu induzieren und die Wachstumstemperatur auf 30 ° C ab.
2. Nach 5 h Proteinexpression bei 30 ° C, Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 xg für 5 min bei 4 ° C.
3. Wasche das Zellpellet mit 100 ml die Zellen erneut bei 8.000 xg für 5 min bei 4 ° C A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) und zentrifugieren puffern.
4. Anschließend resuspendierendas Zellpellet in 80 ml Puffer A, enthaltend 1 mg / ml Polymyxin-Sulfat. Für eine effiziente Zerstörung der äußeren Membran, rühren Sie vorsichtig die Suspension für 1 Stunde bei 4 ° C.
5. Zentrifuge die cytoplasmatische Fraktion und Zelltrümmer zu entfernen, die Suspension für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C. Dies resultiert in ~ 60 ml Überstand mit dem löslichen HdeB enthält.
6. Dialysieren des Überstandes des periplasmatischen Extrakt über Nacht gegen 150x Volumen Puffer B enthält (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0), um eine Dialysemembran mit 6 kDa MW mit cut-off. Konzentriere die Proteine ​​auf 15 ml unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 3 kDa. Filtern die Proteinlösung eine 0,2 um Porenfilter.
7. Anwenden, die das Protein auf eine Anionenaustauscher-Chromatographiesäule (Säulenvolumen 5 ml), die mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml / min mit 5 Säulenvolumina Puffer B äquilibriert wurde. Sobald das Protein auf die Säule geladen wird, Waschen der Säule mit Puffer B für 10 min beieine Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml / min. Elute HdeB mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in Puffer B über einen Zeitraum von 50 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml / min ^6.
8. Identifizieren Fraktionen, die HdeB 15% SDS-PAGE. Mischen Sie 20 ul Probe mit 5 ul 5x reduziert SDS-Ladepuffer. Last 10 ul auf das Gel, und führen in Tris-Glycin-Puffer (14,4 g / l Glycin, 2,9 g / L Tris, 1 g / L Natriumdodecylsulfat, pH 8,3). Führen Sie das Gel bei 150 V, bis der Bromphenol Band nahe dem Boden des Gels (~ 45 min) gewandert ist.
9. Pool aller HdeB enthaltenden Fraktionen, bei 4 ° C dialysiert über Nacht gegen 4 L HdeB Aufbewahrungspuffer (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) und konzentriert, um das Protein zu etwa 300 & mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht cut-off von 3 kDa. Bestimmen Sie die Konzentration von HdeB bei 280 nm unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε _280nm = 15.595 M ^-1 cm ^-1. Bereiten Sie 100 ul Aliquots und gratfreiezie die Aliquots in flüssigem Stickstoff.
   HINWEIS: HdeB kann für mindestens 6 Monate bei -70 ° C gelagert werden.

2. Chaperone Aktivitätstest Thermisch Mit Ausklappen Malatdehydrogenase (MDH)

HINWEIS: Der Einfluß von gereinigtem HdeB auf die Aggregation von thermisch porcine mitochondriale Malat-Dehydrogenase (MDH) bei verschiedenen pH-Werten wurde Entfalten überwacht, wie weiter unten beschrieben. Alle aufgelisteten Proteinkonzentrationen beziehen sich auf die Monomer-Konzentration.

1. Zur Herstellung von MDH, dialysieren MDH bei 4 ° C über Nacht gegen 4 l Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) und konzentriert, um das Protein zu etwa 100 & mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa.
   HINWEIS: Eine sorgfältige Dialyse von MDH ist erforderlich, da MDH als Ammoniumsulfatlösung geliefert wird.
2. Zum Entfernen von Aggregaten, zentrifugieren Sie das Protein für 20 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Bestimmen MDH-Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε _{280 nm = 7.950 M ^-1 cm ^-1). Bereiten Sie 50 ul Aliquots von MDH und Flash-gefrieren die Aliquots für die Lagerung.}
3. Platz 1 ml Quarzküvette in ein Fluoreszenz-Spektralphotometer mit temperaturgesteuerten Probenhalter und Rührer ausgestattet war. Set λ _{ex / em} bis 350 nm.
4. Fügen geeignete Volumina von vorgewärmten (43 ° C) Puffer D (150 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl) zu den gewünschten pH-Werte (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) in die Küvette und set die Temperatur in den Küvettenhalter bis 43 ° C. Das Gesamtvolumen beträgt 1,000 & mgr; l.
5. Hinzufügen 12,5 uM HdeB (oder alternativ das gleiche Volumen an HdeB Speicherpuffer für den Puffersteuerung) zu dem Puffer, gefolgt von der Zugabe von 0,5 uM MDH. Beginnen Lichtstreuung zu überwachen. Inkubieren Sie die Reaktion für 360 sec ausreicht, damit der MDH Entfaltung.
6. Erhöhen Sie den pH - Wert auf 7 durch Zugabe von 0,16-0,34 Volumen von 2 M ungepufferte K ₂ HPO ₄ und weiterhin reCording Lichtstreuung für eine weitere 440 sec.
7. Gesetzt, das Ausmaß der MDH-Aggregation, die in Abwesenheit des Chaperons an einem definierten Zeitpunkt nach der Neutralisation aufgenommen wird (hier nach 500 sec, wenn die maximale Lichtstreuung von MDH beobachtet wurde) auf 100%. Normalisieren HdeB Aktivität zu dem Lichtstreuungssignal von MDH in Abwesenheit von HdeB bei jeder angegebenen pH-Wert.

3. Nachweis von HdeB-LDH-Komplexbildung durch Analytische Ultrazentrifugation (AUC)

HINWEIS: Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente von HdeB allein oder im Komplex mit thermisch Lactatdehydrogenase Entfaltung (LDH) wurden einer analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt werden.

1. Zur Herstellung von LDH, dialysieren LDH bei 4 ° C über Nacht gegen 4 l Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) und konzentriert, um das Protein zu etwa 200 & mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa.
   HINWEIS: Eine sorgfältige Dialyse von LDH als LD erforderlichH wird als Ammoniumsulfat-Lösung zugeführt.
2. Zum Entfernen von Aggregaten, zentrifugieren LDH für 20 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Bestimmen LDH - Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε _{280 nm} = 43.680 M ^-1 cm ^-1). Bereiten Sie 50 ul Aliquots von LDH und Flash-gefrieren die Aliquots für die Lagerung.
3. Inkubieren 3 uM LDH in Gegenwart und Abwesenheit von 30 uM HdeB in Puffer D (pH 4 bzw. 7) für 15 min bei 41 ° C.
   HINWEIS: Die Inkubation von LDH bei höheren Temperaturen führt zu seiner vollständigen Aggregation und keine Chaperon Wirkung HdeB beobachtet werden.
4. Lassen Sie die Proben abkühlen auf Raumtemperatur. Dann laden Proben in Zellen mit einem Standard-Sektor 2-Kanal-Mittelstücke mit 1,2 cm Weglänge. Laden der Zellen in der Ultrazentrifuge und Äquilibrieren auf 22 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Sedimentation.
5. Spin-Proben bei 22 ° C und 167.000 xg in dem jeweiligen Rotor für 12 h und überwachen die Sedimentation des Proteins kontinuierlich bei 280 nm. Wie zuvor gezeigt, wird das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, wenn das übertragene Lichtintensität jedes Kanals gemessen wird, anstatt Extinktion. Dies verbessert auch die Qualität der nachfolgenden Datenanpassung.
6. Führen Sie die Datenanalyse mit SEDFIT (Version 15.01b Dezember 2015), mit der kontinuierlichen c (n) Verteilungsmodell ^17. Ein Tutorial beschreibt , wie SEDFIT verwenden können in Bezug ¹⁸ zu finden.
   1. Stellen Sie das Konfidenzniveau für die ME (Maximum Entropy) Regularisierung bis 0,7.
7. Berechnen Puffer Dichte sowie die Viskosität unter Verwendung SEDNTERP ^19. Zur Abschätzung der Menge von aggregiertem Protein Client, Vergleichen der Integrale von sedimentierten LDH in pH 4 bis pH 7 als Referenz.
   HINWEIS: Die Integration der Sedimentationsverteilungsmuster Plots können direkt in SEDFIT erfolgen. Alternative Software Sedimentationsgeschwindigkeits Daten analysieren kann in einer aktuellen Bewertung ²⁰ gefunden werden.

4. Überwachung MDH Inaktivierung und Reaktivierung in Gegenwart von HdeB

HINWEIS: Der Einfluß von gereinigtem HdeB auf die Neufaltung von ungefalteten pH-MDH wurde durch Überwachung MDH-Aktivität bei Neutralisation bestimmt.

1. Inkubieren 1 uM MDH in Puffer D bei den gewünschten pH-Werte (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) für 1 h bei 37 ° C in Abwesenheit oder Anwesenheit von 25 uM HdeB. Dann verschieben sich die Temperatur auf 20 ° C für 10 min.
   NOTE: No MDH Neufaltung wurde in Gegenwart von HdeB beobachtet, selbst wenn MDH bei Temperaturen höher als 37 ° C inkubiert.
2. Zur Rückfaltung von denaturiertem Säure MDH, neutralisieren die Proben auf pH 7 durch Zugabe von 0,13-0,42 Volumen von 0,5 M Natriumphosphat, pH 8,0 initiieren.
3. Nach Inkubation für 2 h bei 20 ° C, MDH - Aktivität zu bestimmen durch Überwachung der Abnahme von NADH bei 340 nm ^9.
   HINWEIS: MDH katalysiert die NADH-abhängige Reduktion von Oxalacetat zu L-Malat.
   1. Mischungs 50 ul der Inkubation der Reaktion mit 950 & mgr; l Assaypuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 1 mM Oxalacetat und 150 & mgr; M NADH).
      HINWEIS: Die Endkonzentration des MDH in dem Assaypuffer sollte 44 nm betragen.
   2. Überwachen Sie die Änderung der Absorption mit einem Spektralphotometer, ausgestattet mit einem Steuerblock Peltier Temperatur auf 20 ° C.
   3. Bericht des MDH-Aktivität im Vergleich zu 44 nM nativem MDH, die bei pH 7,0 gehalten wurde.

5. Wirkung von HdeB Überexpression auf E. coli Überleben unter Säurestress

HINWEIS: E. coli MG1655 genomische DNA wurde mit einem veröffentlichten Protokoll ²¹ isoliert.

1. Amplify hdeB von E. coli MG1655 durch PCR - Primer hdeB mit - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT und hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
2. Eingerichtet , um die PCR - Reaktion in 50 ul wie folgt: 10 & mgr; l 5x - Polymerase - Puffer, 200 uM dNTPs, 0,5 uM Primer JUD2, 0,5 uM Primer JUD5, 150 ng genomische DNA MG1655, 0,5 ul DNA - Polymerase, fügen ddH ₂ O auf 50 & mgr; l.
3. Führen Amplifikation hdeB wie folgt: Schritt 1: 5 min bei 95 ° C, 1 Zyklus; Schritt 2: 30 sec bei 95 ° C, 30 sec bei 55 ° C, 30 sec bei 72 ° C, 40 Zyklen; Schritt 3: 10 min bei 72 ° C.
4. Klon resultierende PCR - Fragment in die EcoR I und BamH I - Stellen des Plasmids pBAD18 Verwendung von Standardverfahren für Restriktionsstelle Klonen. Man reinige das Plasmid ein Plasmid Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Überprüfen Sie die resultierende Plasmid durch Sequenzierung ^10.
5. Transformieren Sie das Plasmid, das HdeB oder die leeren Vektorkontrolle pBAD18 in den Stamm BB7224 (Δ rpoH) (Genotyp: F ^-, λ ^-, e14 ^- [araD139] _{B / r} [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 araD ⁺ rpoH :: kan ^{+; 16)} unter Verwendung von chemisch kompetenten Zellen.
   HINWEIS: Dieser Stamm ist temperaturempfindlich.
6. Nach 45 sec Hitzeschock bei 42 ° C und vor der Beschichtung, Inkubation Zellen bei 30 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute. Führen Sie einzelne Kolonie Streifen-outs der positiven Klone und Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur in 50 ml LB - _Amp und pflegen die Zellen bei 200 Umdrehungen pro Minute und 30 ° C.
7. Verdünnte Nacht - Kulturen 40-fach in 25 ml LB _Amp und wachsen die Bakterien in Gegenwart von 0,5% Arabinose (Ara) bei 30 ° C und 200 rpm bis zu einer OD _600nm = 1,0 bis HdeB Proteinexpression induzieren.
8. Für die pH-Verschiebung Experimenten verwenden LBDurch Zugabe geeigneter Mengen von 5 M HCl: Amp + Ara die Zellen zu OD _{600 nm} von 0,5 und passen sich den jeweiligen pH - Werte (pH 2,0, pH 3,0 und pH 4,0 hier) zu verdünnen.
9. Nach den angegebenen Zeitpunkten (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), um die Kulturen durch Zugabe der entsprechenden Mengen von 5 M NaOH neutralisiert.
10. Überwachen des Wachstums der neutralisierten Kulturen in Flüssigkultur für 12 Stunden bei 30 ° C unter Verwendung von OD-Messungen.

Ergebnisse

HdeA und HdeB sind E. homolog coli - Proteine, bekannt periplasmatische Proteine gegen Säurestressbedingungen ¹⁰ zu schützen. Unsere Arbeit ergab, dass ähnlich wie HdeA, HdeB fungiert auch als eine Säure molekularen Chaperon aktiviert. Jedoch im Gegensatz zu HdeA, HdeB Funktionen bei einem pH, der noch potentiell bakterizide, aber deutlich höher als der pH - Optimum von HdeA ^6,9,10,22. Um den pH - Optimum von HdeB der Chaperon - Aktivität in vi...

Diskussion

Um den Mechanismus der Aktivierung und Chaperon-Funktion HdeB große Mengen HdeB zu studieren muss exprimiert und gereinigt werden. Eine Anzahl von Expressionsvektorsysteme sind für die Herstellung von großen Mengen eines Zielproteins, einschließlich pTrc oder pBAD-Vektoren zur Verfügung, von denen beide in dieser Studie verwendet wurden. Die Promotoren sind leicht zugänglich für E. coli - RNA - Polymerase und somit HdeB stark upregulated Ausdruck erlauben in jedem E. coli - Stamm. Dieser Aspekt i...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NEB10-beta E. coli Zellen	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Bouillon Mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnologie	I2481C50
Natriumchlorid	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B-Sulfat	ICN Biomedicals Inc.
0,2 &Mikro; m porensteriler Spritzenvorsatzfilter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malatdehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Kaliumphosphat (monobasisch)	Fisher Scientific	BP362-500
Kalium Phosphat (zweibasisch)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 Fluoreszenzspektrophotometer	Hitachi	FL25
Oxalacetat	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Natriumphosphat monobasisch	Sigma	S9390-2.5KG
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma	S397-500
Laktatdehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytische Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	392764
Tafelstück, 12 mm, Epon Anthrazit gefüllt	Beckman Schar	306493
AN-50 Ti Rotor, analytisch, 8-fach	Beckman Schar	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	zur Plasmidaufreinigung (Protokoll 5.1)
L-Arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycin	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluoreszenzzellküvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonukleotide	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP-Set	Invitrogen	10297018
Salzsäure	Fisher Scientific	A144-212
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Zentrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 Spektralphotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysemembran MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Zentrifugalfiltereinheiten 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermocycler	Thermo Fisher	4375786