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Methodenartikel

Experimentelle Infektion mit

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DOI:

10.3791/54554

⸱

16. November 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD 50 Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Zusammenfassung

L. monocytogenes ist ein gram-positive Bakterien , die eine Ursache der durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten beim Menschen ist. Experimentelle Infektion von Mäusen mit diesem Erreger hat sich auf die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunzellen und spezifische Zytokine in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger sehr informativ gewesen. Produktion von IFN-γ durch angeborene Zellen während der Infektion mit subletalen L. monocytogenes ist wichtig für Makrophagen und frühe Kontrolle des Krankheitserregers 1-3 aktiviert. Zusätzlich kann durch adaptive Speicher Lymphozyten IFN-γ - Produktion ist wichtig zur Grundierung , die Aktivierung von angeborenen Zellen nach Reinfektion 4. Die L. monocytogenes - Infektionsmodell dient somit als großes Werkzeug für die Untersuchung , ob neue Therapien , die IFN-γ Produktion haben einen Einfluss auf die IFN-γ - Antworten in vivo und haben produktive biologische Effekte wie die Erhöhung der bakteriellen Clearance oder die Verbesserung der das Überleben der Mäuse zu erhöhen sind so konzipiert, vonInfektion. Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für den Umgang mit der EGD Stamm von L. monocytogenes intraperitoneale Infektionen von C57BL / 6J - Mäusen zu führen und IFN-γ - Produktion durch NK - Zellen, NKT - Zellen und adaptive Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie zu messen. Außerdem werden Verfahren beschrieben: (1) wachsen, und die Bakterien zur Inokulation herzustellen, (2) Messung der Keimbelastung in der Milz und in der Leber, und (3) das Überleben der Tiere zu messen Endpunkten. Repräsentative Daten sind vorgesehen , um auch veranschaulichen , wie dieses Infektionsmodell verwendet werden kann , um die Wirkung von spezifischen Mitteln auf IFN-γ Reaktionen auf L. monocytogenes und das Überleben der Mäuse aus dieser Infektion zu testen.

Einleitung

IFN-γ ist ein Zytokin , das für die Vermittlung von Immunität gegen intrazelluläre Pathogene und zur Steuerung des Tumorwachstums 5 entscheidend. Die Bedeutung dieses Zytokin in bakteriellen Resistenz ist in der Beobachtung offensichtlich , die mit Mutationen in der IFN-γ - Signalweg sind sehr anfällig für eine Infektion mit Mykobakterien und Salmonellen 6 Menschen. In ähnlicher Weise defizienten Mäusen entweder IFN-γ oder die IFN-γ - Rezeptor zeigen Defekte im Widerstand gegen Mykobakterien 7-9 und andere intrazelluläre Pathogene einschließlich L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, S. typhimurium 13 und bestimmte Viren 11. Neben der Bekämpfung von Krankheitserregern, IFN-γ spielt eine entscheidende Rolle bei der Wirtsverteidigung gegen Tumoren 14. Obwohl höhere Produktion von IFN-γ im Rahmen einer Infektion oder Krebs nützlich ist, verlängerte Produktion dieses Zytokins wurde t verknüpfto der Entwicklung von systemischer Autoimmunität 15-17 und der Beschleunigung von Diabetes Typ I in dem nicht-fettleibigen diabetischen Maus - Modell 18.

Die Hauptquellen von IFN-γ sind : NK - Zellen, NKT - Zellen, γδ - T - Zellen, T - Helfer 1 (Th1) -Zellen, und zytotoxischen T - Lymphozyten (CTL) 5,19,20. IFN-γ erhöht sowohl angeborenen und erworbenen Immunität durch: (1) Hochregulieren Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I und II-Expression, (2) die Expression von co-stimulatorischen Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen zu erhöhen, (3) Verbesserung der Makrophagen Phagozytose und die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und mikrobizide Faktoren (beispielsweise Stickstoffmonoxid und reaktive Sauerstoffspezies), (4) die Förderung der Differenzierung von naiven CD4 + T - Zellen in Th1 - Effektorzellen, (5) Förderung der Antikörperklasse Umschaltung auf Immunglobulin ( Ig) 2a und IgG3 (in der Maus), (6) Induzierung der Produktion von Chemokinen Immunzellen-Stellen von i zu rekrutierennfection und (7) Verbesserung der NK - Zellen und CTL - Antworten 5,19. Aufgrund der entscheidenden Bedeutung der IFN-γ in der Wirtsantwort auf Pathogene und Tumore, rekombinantes IFN-γ wurde als Behandlung für verschiedene Infektionen und Malignitäten (in 19 überprüft) getestet. Da jedoch die systemische Verabreichung von IFN-γ oder Th1 Zytokin Förderung Interleukin-12 (IL-12) mit Nebenwirkungen verbunden ist und dosisabhängige Toxizität 19,21 besteht ein Interesse alternative Strategien bei der Entwicklung von IFN-γ - Produktion zu erhöhen , indem Immunzellen. Entwicklung neuer Biologika und kleinen Molekülen erfordert in vivo Screening - Tools zu testen , ob solche Mittel während einer Immunantwort IFN-γ Produktion zu erhöhen , und ob dies in einer sinnvollen biologischen Wirkungen wie Erhöhung der das Überleben der Tiere.

Experimentelle Infektion von Mäusen mit dem grampositiven Bakterium L. monocytogenes ist ein Instrumental - Modell seitEntschlüsselung der Rolle von IFN-γ in Wirtsimmunität gegen intrazelluläre Erreger 1,22. Infektion von Mäusen mit dem Pathogen intravenös oder intraperitoneal (ip) führt zur schnellen Verbreitung der Bakterien an der Milz und der Leber, wo sie von Makrophagen und Hepatozyten mit peak bakterielle Belastungen in der Milz internalisiert zwischen 3 und 4 Tage auftretenden post- Infektion 1,3,22. Produktion von IFN-γ durch NK - Zellen ist wichtig für die Makrophagenaktivierung und frühen Widerstand gegen den Erreger 3; jedoch bei hohen Infektionsdosen, die Produktion von IFN-γ kann auch auf Erreger - Clearance 23 schädlich sein. NKT - Zellen sind auch eine Quelle von IFN-γ in der Milz und Leber während der frühen Kontrolle von Pathogenen 2,24 und diese Produktion wurde 2 gezeigt , IFN-γ - Produktion durch andere Zelltypen , einschließlich NK - Zellen verstärken. Auf der anderen Seite, die später wirkenden adaptive T - Lymphozyten, CD8 + T - Zellen in partidere sind wichtig für das Spiel des Erregers zu vermitteln und den Schutz gegen eine erneute Infektion 1,4,22 bereitstellt.

Diese Infektionsmodell wurde für eine Reihe von Gründen für Forscher attraktiv war ( beschrieben in 1). Erstens, eine Infektion mit dem Pathogen ist in hohem Maße reproduzierbar und induziert eine starke Th1 und zellulären Immunantwort. Zweitens, während subletalen Infektion wird bakterielle Belastung in der Leber und der Milz konzentriert, wo es kann leicht gemessen werden. Drittens kann der Erreger sicher unter Biosafety Level 2 (BSL2) Bedingungen behandelt werden. Viertens der Organismus und die Immunantwort, dass es weitgehend charakterisiert worden erzeugt. Schließlich wurde eine Vielzahl von Mutanten und genetisch veränderte Stämme entwickelt, die für die Verwendung zur Verfügung stehen.

Beschrieben ist hier ein Basisprotokoll für die Impfung von C57BL / 6J - Mäuse mit dem EGD Stamm von L. monocytogenes und 25 für IFN Messung - γ reAntworten von NK, NKT und adaptive Lymphozyten nach der Infektion. Beschrieben ist , wie bakterielle Belastung in der Milz und Leber nach subletalen Infektion zu messen , und die Überlebensstudien nach der Infektion durchgeführt werden mit einer modifizierten LD 50 -Dosis des Pathogens. Schließlich werden repräsentative Daten gezeigt, wie kann dieses Protokoll verwendet werden , um die Wirkung neuer Therapien auf IFN-γ - Antworten und das Überleben der Mäuse zum Screening von L. monocytogenes Infektion.

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Protokoll

Sicherheitserklärung

Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit lebenden L. monocytogenes. Der Erreger wird durch geschultes Personal sicher unter BSL2 Bedingungen behandelt, die nicht immunsupprimierten. Menschen mit geschwächtem Immunsystem sind schwangere Frauen, ältere Menschen und Personen, die HIV-infiziert sind oder chronischen Erkrankungen, die Behandlung mit einer immunsuppressiven Therapie erfordern. Das Personal sollte eine Schutzlaborkittel oder Kittel, Handschuhe, Maske und Augenschutz don während infizierte Handhabung von Proben. Die hierin beschriebene Arbeit wurde unter BSL2 Bedingungen, unter einem Zertifikat ausgeführt (# 32876), die von der University Health Network (UHN) Biosicherheitsbehörde ausgestellt worden. Karkassen von infizierten Mäusen oder nicht in Anspruch genommenen Gewebe wurden doppelt verpackt und in Biohazard Abfall entsorgt. Käfige aus infizierten Mäuse wurden auch durch Autoklavieren dekontaminiert.

Ethikerklärung

Die Mäuse wurden in einem Quara gehalten und infiziertenntine Raum innerhalb UHN Tiereinrichtungen und wurden in Übereinstimmung mit den von der kanadischen Rat festgelegten Leitlinien für die Tierpflege betreut. Alle Verfahren an Mäusen wurden unter Verwendung von Tieren Protokoll # 3214 durchgeführt, die von der UHN Tierpflegeausschuss genehmigt wurde. Aus ethischen Überlegungen wurde der Tod nicht als Endpunkt für das Überleben Studien verwendet. Die modifizierte LD 50 -Dosis hier für L. monocytogenes - Infektion berichtet wurde bestimmt die Dosis sein , bei der 50% der Mäuse spezifischen Endpunkte erreicht, die in das Körpergewicht einer 20% igen Verlust besteht oder zumindest zwei der folgenden klinischen Symptome zeigt: Lethargie, gekräuselte Fell, gekrümmte Haltung, erschwerte Atmung, dumpf oder eingesunkene Augen. Die Mäuse wurden euthanasiert , wenn sie Endpunkte durch Einwirkung von Kohlendioxid erreicht (CO 2) nach UHN Anlage Richtlinien.

1. Herstellung von Glycerol Stocks für Langzeitlagerung

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt , wie Glycerin Aktien derEGD Stamm von L. monocytogenes sind von einem ursprünglichen Glycerolstammlösung hergestellt. Die Schritte, die das Potenzial zur Erzeugung von Aerosolen haben sollte innerhalb von einem zertifizierten Biosicherheitswerkbank (BSC) durchgeführt werden.

  1. Bereiten Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Agar-Platten für das Bakterienwachstum. Hierzu 3,8% hinzufügen (w / v) BHI broth und 1,5% (w / v) Agar destilliert , um Doppel - H 2 O (ddH 2 O). Autoklav Flüssigkeit. Sobald der Agar auf 50 ° C abkühlt, Flüssigkeit in bakterielle Petrischalen (25 ml / Schale) verzichten und für 1 h in der BSC Platten trocken (offene) lassen.
    HINWEIS: Transfer BHI - Agar in ein 50 ° C Wasserbad nach Autoklavierung Verfestigung vor dem Gießen Platten zu vermeiden. Shop BHI-Platten bei 4 ° C den Kopf (mit Medienseite oben) bis zur Verwendung.
  2. Bereiten Flüssigkeit BHI-Medien. Dazu mischen 3,8% (w / v) BHI broth in ddH 2 O. Autoclave.
  3. Entfernen Sie gefrorene Glycerolstammlösung der L. monocytogenes EGD - Stamm aus dem -80 ° C einfrierenr und Auftauen auf Raumtemperatur.
  4. Tauchen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze in der aufgetauten Glycerin auf Lager und sofort Streifen die Spitze hin und her über einen Abschnitt einer BHI-Platte. Dies ist der Hauptstrecke.
  5. Drehen Sie die Platte um 90 ° C und mit einer frischen Pipettenspitze, ziehen durch die erste Streifen und verteilt es auf die nächste ¼ der Platte (dies ist die Sekundär Streifen). Wiederholen Sie noch einmal auf die tertiäre Streifen machen.
  6. Drehen Sie den Kopf Platte und Inkubation bei 37 ° C über Nacht. Einzelne einheitliche Kolonien sollten in den letzten Satz von Streifen und sichtbar zwischen 16 und 24 Stunden erhalten werden.
  7. Dispense 10 ml steriler BHI-Brühe in ein steriles 50 ml Röhrchen entlüftet. Wählen Sie eine Kolonie von L. monocytogenes von der Platte mit einer sterilen Pipettenspitze und impfen die Brühe. Inkubieren Sie die Kultur in einem 37 ° C - Orbital Schüttelinkubator über Nacht oder bis OD 600 = 1,0 mit Einstellungen bei 225 Umdrehungen pro Minute (rpm).
    HINWEIS: Glas oder Einweg - plaTox-Erlenmeyerkolben können auch zur Kultur Bakterien verwendet werden. Unabhängig von der Art von Behälter verwendet wird, sicherstellen, dass es steril ist, entlüftet, und dass das Volumen der Kultur nicht mehr als 20% des Gesamtvolumens des Behälters geeignete Belüftung der Bakterien zu gewährleisten.
  8. Bereiten Glycerin Bestände durch sterile 100% Glycerin mit über Nacht Bakterienflüssigkultur Mischen in einem Verhältnis 1: 1. Verteilen das bakterielle / Glycerin Mischung in 2 ml Kryoröhrchen (500 & mgr; l / Röhrchen) und Transfer Phiolen bis -80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
    HINWEIS: Bead Lager Methoden können auch anstelle von Glycerin Aktien verwendet werden , um Bakterien zu speichern. Durch dieses Verfahren werden poröse Mikrokugeln mit einer Reinkultur von L. monocytogenes inokuliert und bei -80 ° C gelagert. Jede Perle kann verwendet werden, um eine frische Kultur zur Beimpfung nach Bedarf. Siehe Materialliste für weitere Informationen.

2. Bestimmung der Wachstumskurve von L. monocytogenes in Tag Kultur

HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird beschrieben , wie die Wachstumskurve für L. monocytogenes zu erzeugen , die verwendet wird , um die Kolonie bildenden Einheiten (KBE) für Infektionsstudien zu schätzen. Alle Schritte, die das Potenzial haben, Aerosole erzeugen sollte innerhalb von einem zertifizierten BSC durchgeführt werden.

  1. Nehmen Sie 100 & mgr; l der Übernachtkultur erzeugt in Schritt von 1,7 bis 10 ml BHI Medium in einem 50 ml-Röhrchen entlüftet und wachsen in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C (225 rpm, bei 45 ° Winkel geneigt). Verwenden Sie eine nicht-geimpften Röhrchen als Kontrolle.
  2. Nehmen Sie 0.5 ml Proben der Kultur in stündlichen Intervallen (1, 2, 3, 4, 5, 6 h, etc.). Verdünnte jedes Aliquot 1: 1 (v / v) mit BHI Medium in einer Kunststoffküvette. Pipette nach oben und unten zu mischen. Messen der optischen Dichte (OD) bei 600 nm (OD 600) unter Verwendung eines Spektrometers. Weiter Bakterien bis OD 600 = 1 kultiviert werden .
  3. Zur gleichen Zeit, nehmen Sie eine 100 ul-Probe der Kultur und verdünnt mit 900 & mgr; l BHI Medium in einem sterilen 1,5 ml microcentrifuge Rohr (das ist die 10 -1 Verdünnung). Zentrifugieren Sie die Bakterien bei 6000 × g für 5 min und den Überstand aspirieren.
  4. Waschen Bakterien zweimal durch das Pellet in 1 ml BHI-Medium resuspendiert, für 5 min bei 6000 xg zentrifugiert und dann der Überstand abgesaugt. Das Pellet in 1 ml BHI-Medien. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnungsreihe dieser Probe in BHI - Medien (10 -2 bis 10 -9). Striches 100 ul jeder Verdünnungsmittel auf separate BHI-Agar-Platten. Inkubieren Platten über Nacht bei 37 ° C in einem Inkubator.
  5. Am nächsten Tag holen Platten, die zwischen 30 haben - 300 Kolonien. Entsorgen Sie den Rest. Zählen Sie die Kolonien auf diesen Platten. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel von Zählungen in einem Aliquot erhalten , die bei OD 600 = 0,84 genommen wurde. In diesem Beispiel wird eine der Platten (dh 10 -6 Verdünnung) hatte Koloniezahlen zwischen 30 bis 300 und wurde für die CFU / ml Berechnung verwendet.
    HINWEIS: Die Platten mit einer größerenals 300 Kolonien nicht verwendet werden, da macht Überfüllung Bakterienwachstum verhindern kann, und auch schwierig, zu erkennen und einzelne Kolonien Aufzählen es. Platten mit Zahlen <30 sind ebenfalls nicht verwendet, weil kleine Fehler in Verdünnungstechnik oder das Vorhandensein von Verunreinigungen einen großen Einfluss auf die Genauigkeit der Zählungen am unteren Ende des Bereichs aufweisen.
  6. Unterteilen, die Anzahl der Kolonien, die durch das Volumen plattiert und dann mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren, um die CFU / ml-Wert für eine bestimmte Verdünnung zu erhalten. In dem Beispiel in Tabelle 1, bei der Zählung der 10 -6 Verdünnung war 70. Diesen Wert um 0,1 ml der CFU / ml - Wert für die verdünnte Kultur zu erhalten. Dann multiplizieren Sie mit dem Verdünnungsfaktor diesen Wert (10 6) , um die KBE / ml Wert der unverdünnten Kultur zu erhalten (7,0 x 10 8).
  7. Plotten die OD 600 (y-Achse) gegen die Zeit in Stunden (x-Achse) 26 der logarithmischen Phase des Wachstums zu identifizieren.
    Hinweis: Dieses Wachstum curve stellt eine Schätzung der CFU / ml des Tages Kultur, wenn zu einem bestimmten OD-Wert gezüchtet. Wählen Sie eine OD 600 das Lesen , die in der logarithmischen Wachstumsphase ist , die als Ziel OD 600 für den Anbau von Tag Kulturen verwendet werden können. Diese Daten können nun verwendet werden, um die CFU in einer Kultur zu schätzen, für die Herstellung des Inokulums (Verfahren 3).

3. Vorbereitung des Inokulums für experimentelle Infektion mit L. monocytogenes

HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird die Herstellung des infektiösen Inokulum von einem Tag Kultur , die von einer Übernachtkultur (hergestellt in Verfahren 2) gestartet wurde. Alle diese Schritte werden in der BSC durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.

  1. Berechnung der Anzahl der CFU für Infektion benötigt basierend auf der Anzahl von Mäusen und experimentelles Design der Studie. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von BHI Medien in einen sterilen belüftet Erlenmeyerkolben oder Kulturröhrchen.
    HINWEIS: Die CFU von Bakterien prepared hängt von der Art des Experiments abhängig sein durchgeführt. Für das Studium NK und NKT - Zell - Reaktionen während der Infektion, wird jede Maus mit 10 5 CFU von Bakterien (Verfahren 6) beimpft. Wenn das Studium adaptive T - Zell - Reaktionen auf eine Infektion oder Messung bakterielle Belastung wird jede Maus mit 2 x 10 4 CFU von Bakterien (Verfahren 8) inokuliert. Wenn das Überleben Endpunkte zu studieren, wird jede Maus mit der LD 50 Dosis des Erregers (die 10 5 CFU ist für Männer und 1,5 x 10 5 CFU für Frauen, siehe Prozedur 9) beimpft.
  2. Impfen das Röhrchen mit BHI-Medien mit 100 ul über Nacht Kultur. Die Kultur in einem 37 ° C orbital Schüttelinkubator inkubieren (225 rpm) bis Ziel OD 600 erreicht ist . Übertragen Kultur Inhalt in ein steriles Zentrifugenröhrchen.
  3. Zentrifuge Bakterien in einem Pellet für 5 min bei 6000 xg unter Verwendung einer Zentrifuge. Saugen Sie den Überstand eines Vakuums in eine Falle Kolben, der Bleiche befestigt werden.
  4. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), (5 min bei 6000 xg) zwischen Zentrifugieren.
  5. Aspirieren dem zweiten Waschen und verdünnte Bakterien bei der entsprechenden Konzentration in 1x PBS die CFU von Interesse für jede Maus in einem 200 ul-Volumen zu liefern.
    HINWEIS: Es ist am besten , eine kommerzielle Quelle für sterile 1x PBS zum Waschen Bakterien zu verwenden und für die Herstellung des Inokulums, da Laborglaswaren immunologische Verunreinigungen wie Lipopolysacchariden einführen kann.

4. Experimentelle Infektion von Mäusen mit L. monocytogenes

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt , wie Mäuse in Verfahren hergestellt , mit dem Impfstoff zu infizieren 3 und wie die CFU in dem Inokulum geliefert zu überprüfen. Handhabung von Mäusen und Injektionen werden in einer BSC durchgeführt.

  1. Um eine ausreichende Anzahl von männlichen oder weiblichen C57BL / 6J-Mäuse für Ihr Experiment. Bestellen Sie auch Mäuse als nicht infizierte Kontrollen zu dienen.
  2. Lassen Mäusefür 1 Woche vor bakterieller Inokulation akklimatisieren.
    Hinweis: Dies ist , weil der Stress im Zusammenhang mit Transport der Tiere eine vorübergehende Erhöhung der Stresshormonproduktion und Lymphopenie 27,28 auslösen können.
  3. Am Tag der Inokulation ein Ausgangskörpergewicht für jede Maus erhalten und im Labor-Notebook aufzeichnen.
  4. In der BSC, mischen, um die Bakteriensuspension nach oben und unten mit einer sterilen Pipette, um sicherzustellen, dass die Bakterien gleichmäßig verteilt werden und dann 200 & mgr; l des Inokulums in ein 1 ml Sicherheit entwickelt Spritze mit einer 25 G-Nadel ausgestattet aufzunehmen.
  5. Injizieren Sie eine Maus ip mit 200 ul vorbereitet Inokulum (zB 10 5 CFU für NK - Zell - Infektion, Verfahren 6). Für dieses Verfahren Scruff Mäuse mit der weniger dominanten Hand durch die lose Haut greifen um die Schultern des Maus. Nachdem er sich vergewissert, dass die Maus gut zurückhaltend ist, injizieren die Maus im unteren Quadranten des Abdomens, nur lateral der midline die Blase zu vermeiden.
  6. Entsorgen Sie die Nadel und Spritze in einem Biohazard Behälter für spitze Gegenstände.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,6, bis alle Mäuse injiziert werden. Führen Sie ähnliche Schritte mit 1x PBS injizierten Mäusen (nicht infizierte Kontrollen).
    HINWEIS: Da die CFU eine Schätzung auf der Wachstumskurve basiert, ist es auch ratsam , die eigentliche CFU in dem Inokulum zu überprüfen. Dazu bereiten 3-4 verschiedenen Verdünnungen des hergestellten Inokulum (10-fach-Verdünnungsreihe verwendet wird), die Sie in zählbare Kolonien führt zu erwarten. Striches 100 ul jeder Verdünnungsmittel auf eine BHI-Agar-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Zählen Sie die Kolonien und berechnen die tatsächliche KBE / ml, wie in Verfahren 2 beschrieben.

5. Vorbereitung Hitze getötete L. monocytogenes für Immunforschung

Hinweis: Alle Schritte , die das Potenzial haben , zu erzeugen Aerosole innerhalb des BSC durchgeführt werden.

  1. Wachsen Tag Kultur , bis die OD 600 Werte einwieder erreicht wird, die in der logarithmischen Phase sind. Dispense Kultur in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Die Röhrchen in ein 70 ° C in einem Wasserbad für 1 h Bakterien abzutöten.
  3. Waschen Bakterien zweimal mit 1x PBS wie in den Schritten 3.3 und 3.4. Resuspendieren in sterilem kompletten RPMI Medium fötales Kälberserum (FCS) enthält , (Supplemental Datei 1 für Rezept sehen) in einer Konzentration von 4 x 10 & sup6 ; / ml. Aliquotieren abgetötete Bakterien in 2 ml sterile Kryoröhrchen und bei -80 ° C.
  4. Bestätigen Sie den Tod der Bakterien durch die Verbreitung 100 ul durch Hitze abgetötete Bakterien Vorbereitung auf BHI-Agar-Platten und über Nacht bei 37 ° C inkubiert werden.
    Hinweis: Diese Hitze abgetötete Bakterien sollten zur Stimulierung der Lymphozyten in Kultur in Verfahren 8. bereit sein , wenn es irgendwelche Kolonien sind auf der BHI Agar - Platte, wiederholen Hitze-Tötung Verfahren.

6. Messung der IFN-γ Antworten von NK und NKT-Zellen während der Infektion

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt , wie die IFN-γ - Antworten von NK und NKT - Zellen in Mäusen , die mit 10 5 CFU der L. monocytogenes nach der Infektion bei 24 Stunden zu messen. Diese Dosis wird verwendet, da es robust IFN-γ - Antworten von NK und NKT - Zellen in der Milz 24 induziert. Führen Sie alle Schritte des BSC. Um die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten, halten Zellen auf Eis, wann immer möglich und eiskalter Puffer verwenden.

  1. Impfen Mäuse wie in Verfahren 4 mit 10 5 CFU der L. monocytogenes beschrieben. Zur gleichen Zeit, zu injizieren nicht infizierten Kontrollmäusen mit einem gleichen Volumen von PBS 1x ip.
  2. Euthanize Mäuse bei 24 Stunden nach der Inokulation durch CO 2 Inhalation gemäß gültiger Richtlinien.
  3. Legen Sie jede Maus auf der rechten Seite und benetzen Sie die Haut mit 70% Ethanol eine Squeeze-Flasche mit.
  4. Mit aseptischen oder sterilen Pinzette und zäh-schneiden Schere, einzuschneiden die Haut direkt unter der Unterseite des Brustkorbs.
  5. Abspritzendie freiliegende Muskelschicht mit 70% Ethanol. Die Milz sollte unterhalb der Muskelschicht (offenen Pfeil in Abbildung 1) zu sehen sein.
  6. Mit aseptischen oder sterilen Pinzette und einer feinen Schere, einzuschneiden die Muskelschicht der Milz zu offenbaren. packen Sie vorsichtig die Milz mit der Zange und verwenden feinen Schere die Milz entfernt von umgebenden Bindegewebe zu schneiden.
  7. Legen Sie die Milz in einem 15 ml konischen Röhrchen mit steriler 1x PBS.
  8. Halb füllen sterile Petrischalen mit sterilen 1x PBS. Distanzieren die Milz durch einen 70 & mgr; m Nylon Zelle Sieb in die Petrischale mit dem flachen Ende einer sterilen 3 ml Spritze.
  9. Übertragen Sie die Splenozyten-Suspension in einem sauberen sterilen 15 ml konischen Röhrchen mit einer sterilen 10 ml serologische Pipette.
  10. Zentrifuge Proben bei 335 × g für 10 min bei 4 ° C.
  11. Saugen Sie den Überstand in einen Kolben Falle mit Bleichlauge. Lösen des Zellpellets durch das Rohr mit einem Finger Ausklopfen oder durch das untere Rohr ziehenhin und her entlang einer gewellten Oberfläche (zB Lüftungsluftstroms in der BSC).
  12. Lyse roter Blutkörperchen von 1,5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer hinzugefügt werden (siehe Zusatz Datei 1 für Rezept) zu jeder Milz. Nach genau 1 Minute und 15 Sekunden, um das Rohr mit 1x PBS füllen die Zell-Lyse zu stoppen.
  13. Zentrifugen Zellen wie in Schritt 6.10 beschrieben. Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 10 ml fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Buffer (sterile 1x PBS 2% FCS enthält).
  14. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Dazu nehmen zwei Aliquots der Zellsuspension zum Zählen. Werden 15 ul jeder Zellsuspension in einem gleichen Volumen von Trypan Blau (0,04%, hergestellt von 0,4% Trypanblau-Lösung in ddH 2 O verdünnt). Last 15 ul jeder Zelle / Trypanblau Suspension in die Kammer des Hämozytometer (dh eine in der oberen Kammer, eine in der unteren Kammer).
  15. Mit Hilfe eines Mikroskops, zählen alle nicht-blauen Zellen infünf große Quadrate des zentralen Gitters in jeder Kammer (Abbildung 2). Nehmen Sie diese Zählung und teilen sie durch 10 die Anzahl der Zellen in 10 6 / ml zu erhalten. In dem Beispiel in Abbildung 2 wird der Zählwert 215 - Zellen in den 5 Quadrate; Daher ist die Zellkonzentration von 21,5 x 10 & sup6 ; / ml. Der Mittelwert der Zellkonzentrationen von den beiden Proben erhalten.
  16. Seed 1 x 10 6 Zellen pro Well / Fleck in einer 96-Well - Rundbodenplatte für die Durchflusszytometrie Färbung. Achten Sie darauf, auch Zellen für die ungefärbten und Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen Saatgut. Siehe empfohlene Durchflusszytometrie Färbung Tafel in Tabelle 2.
    HINWEIS: Für die folgenden Schritte, empfiehlt es sich Zellen auf Eis oder bei 4 ° C zu halten und Zellen aus Licht mit einer Folie zu schützen , wenn Fluorochrome vorhanden sind. Eine Mehrkanalpipette kann verwendet werden, Flüssigkeiten in 96-Well-Färbeplatten verzichtet die Verarbeitung zu beschleunigen. Achten Sie darauf, nicht das Zellpellet zu stören, wennAbsaugen der Überstand der zentrifugierten Platte. Färbung kann auch in FACS-Röhrchen durchgeführt werden, wenn die Zentrifuge nicht mit Plattenadapter angebracht ist. Alle Zentrifuge Schritte von diesem Zeitpunkt an werden bei 456 g für 5 min bei 4 ° C durchgeführt.
  17. Zentrifugieren Sie die Platte und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit FACS-Puffer. Eine Waschlösung wird durch Zugabe von 200 & mgr; l FACS-Puffer in jede Vertiefung, Zentrifugieren der Platte gemacht, und dann Absaugen der Überstand.
  18. Führen Sie Blockierungsschritt 50 & mgr; l durch Zugabe / Vertiefung FACS-Puffer mit anti-Maus-CD16 / CD32 (gereinigtes Fc-Block) (0,5 ug). Inkubiere Zellen bei 4 ° C für 15 min. Wasche einmal Zellen in 1x PBS, wie oben beschrieben.
  19. 100 l Lebensfähigkeit Farbstoff (fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff verdünnt 1: 1000 in 1x PBS) zu den Zellen. Stain-Zellen bei 4 ° C im Dunkeln (im Kühlschrank) für 30 min. Wasche die Zellen zweimal in FACS-Puffer wie oben beschrieben.
  20. Nach einem zweiten Wasch, 100 & mgr; l der Zelloberflächen-Antikörper oder Tetramere in die jeweiligen Vertiefungen nach to die Färbung Tafel in Tabelle 2 beschrieben. Stain-Zellen bei 4 ° C im Dunkeln (im Kühlschrank) für 30 min. Zu dieser Zeit fügen auch Antikörper zur Färbung von einzelnen positiven und FMO Kontrollen.
    HINWEIS: In Bezug auf einzelne positive Kontrollen wird es entweder auf den Einsatz Splenozyten empfohlen , die mit verschiedenen Fluorochrom Versionen des CD4 - Antikörper oder kommerziellen Ausgleich Perlen gefärbt sind , die mit den in der Platte verwendeten Antikörpern gefärbt werden. Vor diesen Färbeverfahren Durchführung alle FACS-Antikörper sollten in Teststudien titriert werden, um eine optimale Konzentrationen für die Färbung bestimmen.
  21. Zweimal waschen Zellen in Puffer FACS wie oben beschrieben und dann Zellen beheben , indem sie in 50 ul 4% Paraformaldehyd (16% Paraformaldehyd Lager verdünnt in ddH 2 O) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur resuspendieren. ACHTUNG: Der Paraformaldehyd ist giftig und sollte nur im Abzug gehandhabt werden.
  22. Waschen Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer, Zentrifugieren dazwischen. Die Zellen in FACS-Puffer. Weiter zum nächsten Schritt oder Speicherzellen in den Kühlschrank vor Licht geschützt für bis zu drei Tage.
  23. Centrifuge Zellen, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 ul 1x Permeabilisierungs / Waschpuffer (Perm / Wash-Puffer), Zentrifugieren dazwischen. Die Perm / Wash Buffer wird von einem 10 - fach Lager , hergestellt durch Verdünnen von 1: 9 (v / v) in ddH 2 O.
  24. Nach dem zweiten Waschen, Resuspendieren der Zellen in 150 ul Perm / Wash Buffer und bei 4 ° C im Dunkeln für 15 min inkubiert.
  25. Centrifuge Zellen wieder und dann den Überstand aspirieren. Resuspendiere Zellen in 50 ul 1x Perm / Waschpuffer anti-IFN-γ enthält, und in der Dunkelheit bei 4 ° C für 1 Stunde inkubiert.
  26. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x Perm / Waschpuffer, Zentrifugieren dazwischen. Die Zellen in 250 ul Puffer FACS und dann übertragen Zellen FACS-Röhrchen.
  27. Gehen Zytometrie Erwerb fließen ein Fluss cytomet miter , dass eine geeignete Laserkonfiguration und Filtersatz Fluorochrome in der Färbungstafel in Tabelle 2 29 beschrieben verwendet , zu unterscheiden. Sammeln Sie mindestens 200.000 Ereignissen pro Probe und 10.000 Ereignisse für Kompensationssteuerungen.
  28. Bewerben Kompensationsmatrix und Analyse von Daten Durchflusszytometrie - Analyse - Software unter Verwendung von 30.

7. Messung von bakterielle Belastung in der Milz und Leber zum Zeitpunkt der Peak-Infektion

HINWEIS: Alle Schritte innerhalb eines BSC durchgeführt werden , sofern nicht anders angegeben.

  1. Beimpfen von Mäusen , die mit 2 x 10 & sup4 ; CFU des Pathogens IP 4 in beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Verfahren.
  2. Am Tag 3 nach der Infektion vorbereiten sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils 500 ul eiskaltem sterilen 0,1% Triton X-100 in 1x PBS und 0,2 bis 0,3 g 1,5-2 mm säuregewaschen sterile Glasperlen. Wiegen Sie jedes Röhrchen.
    HINWEIS: Glasperlen werden Säure durch incu gewaschenin 10% Essigsäure Beize in einem Becherglas auf einem Magnetrührer 1 Stunde. Diese Kügelchen werden dann mit ddH 2 O zu entfernen Säure ausgiebig gewaschen, luftgetrocknet und dann vor der Verwendung im Autoklaven behandelt.
  3. Euthanize Mäuse durch CO 2 Exposition.
  4. Für Präparation von Organen, lag das Tier auf dem Rücken auf einem Sezieren Brett und Stift, um die Schenkel der Maus auf dem Brett mit 25 G Nadeln. Desinfizieren Sie die Haut, indem sie mit 70% Ethanol zu benetzen.
  5. Mit einer sterilen harten Schnitt Schere, machen einen Mittelschnitt in der Haut von der Leiste bis in die Mitte der Brust und dann von der Mitte der Leiste auf jedem Knie und aus der Mitte der Brust zu jedem Ellbogen. Blunt sezieren und die Haut reflektieren, es öffnen Pinning 25 G Nadeln.
  6. Desinfizieren Muskelschicht, indem sie es mit 70% Ethanol benetzt und dann steril einer feinen Schere in der Bauchwand einen Mittelschnitt machen mit. Besorgen Sie sich die Xiphoidbasis mit einer Pinzette. Dann die gleichen feinen Schere verwenden, stellen Schnitte in der Bauchwand von der xiphoid process seitlich auf jeder Seite nach dem Brustkorb, direkt unterhalb der Membran, die Leber zu offenbaren.
  7. Schneiden Sie ein ~ 100 mg Stück der Leber (mit dem gleichen Lappen für alle Mäuse) mit einer sterilen Schere und legen Sie sie in einem vorgewogen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  8. Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Organe auf der linken Seite der Bauchhöhle zur Seite schieben, um die Milz zu visualisieren. packen Sie vorsichtig die Milz mit einer Pinzette und lassen Sie ihn aus der Bauchhöhle durch das umgebende Bindegewebe Wegschneiden.
  9. Legen Sie die Milz in der vorher gewogenes 1,5 ml Mikroröhrchen mit Perlen. Transport Gewebe Labor in einem auslaufsicheren Behälter mit Eis. Erneut wiegen die Rohre, die Organe mit den Gewebegewichte in mg zu bestimmen.
  10. Homogenisieren des Gewebes durch die Rohre Schütteln einer Perlmühle Homogenisator für 3 min bei einer Frequenz von 30 Hertz verwendet wird.
    HINWEIS: Die Perlmühle Verfahren wird zur Homogenisierung bevorzugt , da sie für die Vorarb zugänglich istsingen, eine große Anzahl von Proben und erzeugt weniger Chaos und der möglichen Exposition gegenüber dem Erreger. Jedoch automatische Homogenisatoren oder autoklaviert 2 ml manuelle Glasgewebe Homogenisatoren als Alternative verwendet werden könnten.
  11. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnungsreihe der Homogenate in 0,1% Triton-X-100 in 1x PBS, die von ( im Bereich von unverdünntem bis 10 -7).
  12. Striches 100 & mgr; l jeder verdünnten Homogenats auf eine BHI-Agar-Platte (in zweifacher Ausfertigung) eine sterile Spreizer. Übertragungsplatten zu einem 37 ° C Inkubator und Inkubation über Nacht.
  13. Halten Sie die Platten, die zwischen 30 und 300 Kolonien / Platte enthalten, entsorgen Sie den Rest. Zählen Kolonien auf jeder Platte, und die mittlere Anzahl der Kolonien nach doppelten Aufstrichen.
  14. Berechnen Sie die KBE / mg gemäß der folgenden Gleichung:
    CFU / mg = CFU / ml in dem Homogenat, hergestellt durch die ml Homogenat multipliziert durch das Gewicht mg des homogenisierten Gewebes geteilt.
    HINWEIS: Wenn beispielsweise ein Mittelwert von 30 colOnies wurden nach der Plattierung 100 & mgr; l von 10 -2 verdünnten Homogenats aus einer 120 mg Stück Leber hergestellt gezählt , die wie folgt in 0,5 ml, würden die Berechnungen homogenisiert:
    KBE / ml = 30 Kolonien x 100 (Verdünnungsfaktor) / 0,1 ml (Volumen Spread) = 30.000 KBE / ml.
    CFU / mg = 30.000 CFU / ml x 0,5 ml Homogenat / 120 mg Gewebe = 125 CFU / mg.

8. Wirkungen von L. monocytogenes auf IFN-γ Responses von CD4 + und CD8 + Zellen

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt , wie IFN-γ - Produktion durch Milz- CD4 + und CD8 + T - Effektorzellen zum Zeitpunkt der Spitze der adaptiven Immunantwort (~ 7 d nach der Infektion) mit zwei Methoden geerntet zu messen: (1) fließen Zytometrie IFN-gamma von CD4 + und CD8 + Zellen durch intrazelluläre Zytokin - Färbung zu messen, und (2) ELISA Gesamt IFN-γ Ebenen von Splenozyten (enthält alle T - Zellen) produziert zu messen. Verfahrenwerden innerhalb der BSC durchgeführt.

  1. Infect Mäusen durch ip mit 2 x 10 4 CFU des Erregers Injektion beschrieben unter Verwendung von Verfahren in Verfahren 4.
  2. Am 7. Tag nach der Infektion, einschläfern Mäuse durch CO 2 Inhalation gemäß gültiger Richtlinien.
  3. Präparieren Sie die Milz (wie oben beschrieben) und in einem 15 ml konischen Röhrchen mit steriler 1x PBS. Transport der Rohre an das Labor in einem dicht Behälter mit Eis.
  4. Verarbeiten Sie die Milzen in einer einzigen Zellsuspension, lysieren roten Blutkörperchen, wie in Kapitel 6, beschrieben und dann resuspendieren Zellen in komplettem RPMI-Medium, das 10% FCS. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
  5. Richten Sie Kulturen für die Messung von IFN-γ-Antworten. Für diese Abgabezellen (4 x 10 6 in 1 ml / Vertiefung) in 24-Well - Platten mit und gleiche Anzahl (4 x 10 6 oder 1 ml / well) des aufgetauten Hitze abgetöteten L. monocytogenes (hergestellt in Schritt 5) . Transfer-Zellen zu einem 37° C Inkubator.
  6. Nach 20 h Inkubation wurden 0,66 ul / ml Proteintransport-Hemmstoff, um Brunnen und weiter Inkubationen hinzuzufügen.
  7. Vier Stunden später, Transferplatte BSC und sammeln 500 ul Kulturüberstand und gefrier (bei -80 ° C) für die spätere Messung von IFN-γ Ebenen Kommerzielle enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -Kit 31 verwendet wird . Dann sammeln Zellen in ein steriles 15 ml Röhrchen. Waschen Sie Brunnen mit 1x PBS und bündeln diese Wäsche zusammen mit gesammelten Zellen.
  8. Zuführen Zelloberflächenfärbung und intrazelluläre Färbung für IFN-γ auf CD4 + und CD8 + Zellen , wie in Verfahren 6 beschrieben , außer dass die Anfärbung Tafel in Tabelle 3 beschrieben , verwenden. Gehen cytometer Erwerb fließen (Sammeln von 200.000 Ereignisse / Probe) und analysieren 29 Daten 30 Durchflusszytometrie - Analyse - Software verwendet wird .

9. Mess das Überleben der Mäuse auf Endpoints nach L. monocytogenes Infection

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt die Wirkung eines Mittels auf das Überleben der Mäuse an Endpunkte nach der Infektion mit dem modifizierten LD 50 Dosis des Erregers. All diese Verfahren sind in der BSC in der Tiereinrichtung durchgeführt.

  1. Inject Mäuse ip mit dem modifizierten LD 50 -Dosis von L. monocytogenes wie in Verfahren 4 beschrieben Dies wurde bestimmt 10 5 CFU zu sein (für Männer) bzw. 1,5 x 10 5 CFU (für Frauen) 31.
  2. Folgen Sie zweimal täglich Mäuse auf klinische Zeichen und zeichnen diese Zeichen und Tierkörpergewicht in einem Labor-Notebook. Euthanize Mäuse, wenn sie einen Verlust von 20% des Körpergewichts oder zwei klinischen Anzeichen von Listeriose (Lethargie, gekräuselte Fell, gekrümmte Haltung, erschwerte Atmung, dumpf oder eingesunkene Augen) zeigen.
  3. Nach 14 Tagen einschläfern Mäuse über CO 2 Inhalation zu überleben.
  4. Bereiten Sie Kaplan-Meier - Plots der Daten durch das prozentuale Überleben jeder Gruppe gegen die Zeit aufgetragen 32.
    Hinweis: Wenn Mäuse auf eine Infektion erliegen (Endpunkten treffen in Ethikerklärung beschrieben), wird dies durch nach der Infektion Tag 5 tritt in der Regel (Abbildung 7).

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Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt eine typische Durchflusszytometrie Färbung von IFN-γ in Milz- NK und NKT - Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion mit 10 5 CFU des Erregers. Diese Figur zeigt auch die Gating - Strategie für die Färbung Tafel in Tabelle 2 beschrieben. Figur 4 zeigt einige repräsentative Daten , die in einem Experiment erhalten wurden , in denen männliche Mäuse mit dem PPAR & agr; Antagonist IS001 oder Vehikelkontrolle b...

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Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie eine grundlegende experimentelle Infektion durchzuführen mit der EGD Stamm von L. monocytogenes 25 bei männlichen oder weiblichen C57BL / 6J - Mäuse. Dieses Protokoll wurde für die Zwecke der Untersuchung der Wirkung eines neuartigen niedermolekularen IS001 auf IFN-γ Produktion von angeborenen und adaptiven Lymphozyten in vivo 31 eingerichtet. Bakterien-Clearance und das Überleben nach der Infektion Durch die Überwachung wurden Erkenntnisse ...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Entwicklung dieses Protokolls wurde durch einen Betriebskostenzuschuss des CIHR (MOP97807) an SED unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gehirn Herz Infusionsbrühe, modifiziertBD299070jede Marke sollte passend sein
AgarBD214010jede Marke sollte passend sein
Triton X-100Sigma-AldrichX100jede Marke sollte passend sein
1x PBSSigmaD8537jede Marke sollte passend sein
TissueLyser IIQiagen85300Jede Marke sollte geeignet sein
Ammoniumchlorid (NH3Cl)Jede Marke sollte geeignet sein
KHCO3jede Marke sollte angemessen sein
Na2EDTAJede Marke sollte angemessen sein
RPMI 1640Gibco22400089jede Marke sollte angemessen sein
Fötales Rinderserum Gibco12483Vor Gebrauch bei 56° Hitze inaktivieren; C für 30 min
L-GlutaminGibco25030jede Marke sollte geeignet sein
Nicht-essentielle AminosäurenGibco11140jede Marke sollte geeignet sein
Penicillin/StreptomycinGibco15140jede Marke sollte geeignet sein
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (enthält Monensin)BD554724verwenden 4 μ l in 6 ml Zellkultur
16 % ParaformaldehyeElektronenmikroskopie Sciences15710Verdünnung auf 4 % PFA in ddH2O oder 1x PBS
10x Perm/Wash PufferBD554723Verdünnung 1x in ddH2O Fc-Block
, Anti-Maus CD16/CD32 AufgereinigteBioscience14-0161Verdünnung 1:50
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 506eBioscience65-08661:1.000 verdünnen (wir haben auch Viabilitätsfarbstoffe von Molecular Probes verwendet)
anti-Maus CD4-PE-Cy5 (GK1.5)eBioscience15-0041Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
Anti-Maus CD8-FITC (53-6.7)eBioscience11-0081Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
PBS57/mCD1d tetramer-APCNIH Tetramer Core FacilityN/ABezogen als Geschenk von der Einrichtung
anti-Maus TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)eBioscience25-5961Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
Anti-Maus NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)eBioscience47-3351Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
Anti-Maus CD45 PE-Cyanin7 (30-F11)eBioscience25-0451Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
Anti-Maus IFN gamma-PE (XMG1.2)eBioscience12-7311Der Hersteller empfiehlt eine bestimmte Testgröße, die jedoch vor der Verwendung titriert werden sollte.
OneCompeBeads eBioscience01-1111Verwenden Sie einen Tropfen pro Färbung
Maus IFN Gamma ELISA-KiteBioscience88-7314Wird zur Messung des Interferon-Gammas im Kulturüberstand
50 ml belüftete Röhrchen für die KulturWird für die Kultivierung der Bakterien verwendet, jede Marke sollte geeignet sein
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenJede Marke sollte geeignet sein
bakterielle PetrischalenJede Marke sollte geeignet sein
2 ml CyrovialeJede Marke sollte geeignet sein
UV-SpektrometerJede Marke sollte geeignet sein
SicherheitsnadelnMarke sollte geeignet sein
C57BL / 6JJackson LaboratorienLager # 000664Bestellen für Ankunft in 7 Wochen
BleicheFür die Dekontamination
70% EthanolFür die Dekontamination
Glasperlenjeder Marke sollte geeignet sein
Zentrifugenrotor, Eimer, Eimerabdeckungen.
Mikrozentrifugejeder Marke sollte geeignet sein
Steriles Glycerinjede Marke sollte geeignet sein
Jede Marke sollte geeignet sein
PipetteJede Marke sollte geeignet sein
Chirurgische InstrumenteJede Marke sollte geeignet sein
70 Mikron SiebeJede Marke sollte geeignet sein
3 ml SpritzeJede Marke sollte geeignet sein
PipettenpistoleJede Marke sollte geeignet sein
FiltrationseinheitenJede Marke sollte geeignet sein
TrypanblauVerdünnt 1 bis 9 in ddH2O, jede Marke sollte geeignet sein
Hämozytometerjeder Marke sollte geeignet sein
rundem BodenJede Marke sollte geeignet sein
FACs RöhrchenFisher Scientific14-959-5
BD LSR IIBDJedes Durchflusszytometer kann für die Erfassung verwendet werden, das über eine geeignete Laserkonfiguration und einen Filtersatz verfügt, um die Fluorochorme zu diskriminieren
Flowjo SoftwareTreestarWird für die Datenanalyse verwendet. Andere Arten von Datenanalysesoftware sind ebenfalls geeignet
Mehrkanalpipetten (0 - 300 & Mikro; l)EppendorfWird zum Waschen von Zellen und zum Hinzufügen von Antikörpern während der Durchflusszytometrie-Färbung verwendet
EssigsäureWird zum Waschen von Glasperlen verwendet, jede Marke sollte geeignet sein
Mikrobank Bakterielles KonservierungssystemPro-lab DiagnostikWird als Alternative zu Glycerinvorräten für die Langzeitlagerung von Bakterien verwendet
verwendet Jede Pipettenspitzen Platten mit

Referenzen

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381(2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

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