Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Experimentell infektion med Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54554
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver hur man ympa C57BL / 6J-möss med EGD stam av Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) och för att mäta interferon-γ (IFN-γ) svar genom naturliga mördarceller (NK), naturliga mördar-T (NKT-celler), och adaptiv T-lymfocyter efter infektion. Detta protokoll beskriver också hur man genomför studier överlevnads i möss efter infektion med en modifierad LD 50 dosen av patogenen.

Abstract

L. monocytogenes är en grampositiv bakterie, som är en orsak till livsmedelsburna sjukdomar hos människor. Experimentell infektion av möss med denna patogen har varit mycket informativ på sig rollen som medfödda och adaptiva immunceller och specifika cytokiner i värdimmunitet mot intracellulära patogener. Produktionen av IFN-γ genom medfödda celler under subletal infektion med L. monocytogenes är viktigt för aktivering makrofager och tidig kontroll av patogenen 1-3. Dessutom är det viktigt för grundning av aktiveringen av medfödda celler vid återinfektion 4 IFN-γ-produktion av adaptiva minneslymfocyter. L. monocytogenes infektionsmodell således fungerar som ett utmärkt verktyg för att undersöka om nya terapier som är utformade för att öka IFN-γ produktion påverkar IFN-γ svar in vivo och har produktiva biologiska effekter såsom ökad bakteriell clearance eller förbättra mus överlevnad fråninfektion. Beskrivs här är en grundläggande protokoll för hur man genomför intraperitoneala infektioner av C57BL / 6J möss med EGD stam av L. monocytogenes och för att mäta IFN-γ produktion av NK celler, NKT-celler och adaptiva lymfocyter med flödescytometri. Dessutom är förfaranden beskrivs till: (1) växa och förbereda bakterierna för ympning (2) mäta bakteriehalten i mjälten och levern, och (3) mått djuröverlevnad till endpoints. Representativa data finns också för att illustrera hur denna infektionsmodell kan användas för att testa effekten av specifika medel på IFN-y svar på L. monocytogenes och överlevnaden hos möss från denna infektion.

Introduction

IFN-γ är en cytokin som är avgörande för att förmedla immunitet mot intracellulära patogener och för att styra tumörtillväxt 5. Betydelsen av detta cytokin i bakterieresistens är uppenbar i iakttagelsen att människor med mutationer i IFN-γ signalväg är mycket mottagliga för infektion med mykobakterier och salmonella sex. På liknande sätt, mus med brist på antingen IFN-γ eller IFN-γ-receptor uppvisar defekter i resistens mot mykobakterier 7-9 och andra intracellulära patogener inklusive L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13 och vissa virus 11. Förutom att bekämpa patogener, IFN-γ spelar en avgörande roll i värdförsvar mot tumörer 14. Även om högre produktion av IFN-γ är fördelaktigt i samband med infektion eller cancer, har förlängt produktion av detta cytokin kopplats to utveckling av systemisk autoimmunitet 15-17 och accelerationen av typ I-diabetes i icke-feta diabetiska musmodell 18.

De största källorna till IFN-γ inkluderar NK-celler, NKT-celler, γδ T-celler, T-hjälparce 1 (Th1) celler och cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) 5,19,20. IFN-γ förbättrar både medfödd och adaptiv immunitet efter: (1) upp-reglering av större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass I och II uttryck, (2) att öka uttryck av samstimulerande molekyler på antigenpresenterande celler, (3) förbättra makrofag fagocytos och produktion av proinflammatoriska cytokiner och mikrobicida faktorer (t.ex., kväveoxid och reaktiva syreradikaler), (4) att främja differentieringen av naiva CD4 + T-celler i Th1 effektorceller, (5) främja antikroppsklass omkoppling till immunoglobulin ( Ig) 2a och IgG3 (i mus), (6) att inducera produktion av kemokiner att rekrytera immunceller till ställen med infection, och (7) öka NK-celler och CTL-svar 5,19. Med tanke på den avgörande betydelsen av IFN-γ i värd svar på patogener och tumörer, har rekombinant IFN-γ testats som en behandling för olika infektioner och maligniteter (översikt i 19). Men eftersom systemisk administrering av IFN-γ eller Th1 främja cytokin interleukin-12 (IL-12) är associerad med biverkningar och dosrelaterad toxicitet 19,21, det finns intresse av att utveckla alternativa strategier för att öka IFN-γ produktion av immunceller. Utveckling av nya biologiska och små molekyler kräver in vivo screening verktyg för att testa om sådana medel ökar IFN-γ produktion under ett immunsvar och om detta leder till meningsfulla biologiska effekter såsom ökningar av djuröverlevnad.

Experimentell infektion av möss med de grampositiva bakterien Listeria monocytogenes har varit en instrumental modell fördechiffrera rollen av IFN-γ i värdimmunitet mot intracellulära patogener 1,22. Infektion av möss med patogenen intravenöst eller intraperitonealt (ip) leder till en snabb spridning av bakterier till mjälten och levern, där de blir internaliseras av residenta makrofager och hepatocyter med topp bakteriella belastningar i mjälten inträffar mellan tre och fyra dagar efter avslutad infektion 1,3,22. Produktionen av IFN-γ genom NK-celler är viktig för makrofagaktivering och tidig resistens mot patogenen 3; emellertid vid höga infektiösa doser, produktionen av IFN-γ kan också vara skadlig för patogen clearance 23. NKT-celler är också en källa av IFN-γ i mjälten och levern under tidig kontroll av patogener 2,24 och denna produktion har visat sig förstärka IFN-γ-produktion genom andra celltyper inklusive NK-celler 2. Å andra sidan, senare verkande adaptiva T-lymfocyter, CD8 + T-celler i partiCular, är viktiga för förmedling avslut av patogenen och ge skydd mot återinfektion 1,4,22.

Denna infektion modell har varit attraktivt för forskare för ett antal skäl (översikt i ett). För det första är infektion med patogenen mycket reproducerbar och inducerar en stark Th1 och cellulära immunsvar. För det andra, under subletal infektion, bakteriell belastning koncentreras i levern och mjälten, där den lätt kan mätas. För det tredje kan patogenen kan säkert hanteras under biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) förhållanden. För det fjärde, organismen och immunsvar som det skapar i stor utsträckning har karakteriserats. Slutligen har en mängd av muterade och genetiskt modifierade stammar utvecklats som är tillgängliga för användning.

Beskrivs här är en grundläggande protokollet för ympning av C57BL / 6J möss med EGD stam av L. monocytogenes 25 och för att mäta IFN - γ reresponser från NK, NKT, och adaptiva lymfocyter efter infektion. Vidare beskrivs hur man mäter bakteriehalten i mjälten och levern efter subletal infektion och att genomföra studier överlevnads efter infektion med en modifierad LD 50 dosen av patogenen. Slutligen är representativa data visas hur detta protokoll kan användas för att screena effekten av nya behandlingar på IFN-y svar och mus överlevnad från L. monocytogenes infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

säkerhets~~POS=TRUNC

Detta protokoll beskriver infektion av möss med levande L. monocytogenes. Patogenen hanteras säkert under BSL2 förhållanden av utbildad personal som inte är nedsatt immunförsvar. Nedsatt immunförsvar människor inkluderar gravida kvinnor, äldre och personer som är HIV-smittade eller har kroniska sjukdomar som kräver behandling med immunsuppressiv behandling. Personalen ska don en skyddande labbrock eller kappa, handskar, mask och ögonskydd vid hantering av infekterade prover. Det arbete som beskrivs häri utfördes under BSL2 villkor ett certifikat (# 32.876) som utfärdades av University Health Network (UHN) biosäkerhet kontor. Slaktkroppar från infekterade möss eller oanvända vävnader var dubbel-påsar och omhändertas på biologiskt avfall. Burar från infekterade möss också dekontamineras genom autoklavering.

etik Uttalande

Möss bibehölls och infekterades i en Quarantine rum inom UHN djuranläggningar och vårdades i enlighet med de riktlinjer som fastställts av den kanadensiska rådet om Animal Care. Alla förfaranden på möss utfördes under användning av djur protokoll # 3214 som godkändes av djurvård kommitté UHN. På grund av etiska överväganden var död inte användas som slutpunkt för studier överlevnad. Den modifierade LD 50 dosen rapporteras här för L. monocytogenes infektion bestämdes att vara den dos vid vilken 50% av mössen nådde specifika endpoints, som bestod av en förlust 20% i kroppsvikt eller visar åtminstone två av följande kliniska tecken: letargi, ruggig päls, krökt kroppshållning, ansträngd andning, matt eller insjunkna ögon. Möss avlivades när de nådde endpoints via exponering för koldioxid (CO 2) enligt UHN anläggnings riktlinjer.

1. Beredning av glycerol lager för Långsiktig lagring

OBS: Denna procedur beskriver hur glycerol lager avEGD stam av L. monocytogenes framställs från en ursprunglig glycerol lager. Steg som har potential att generera aerosoler bör utföras inom en certifierad biosäkerhet skåp (BSC).

  1. Förbereda hjärna-hjärta-infusion (BHI) agarplattor för bakterietillväxt. För detta tillägg 3,8% (w / v) BHI buljong och 1,5% (vikt / volym) agar till dubbeldestillerat H2O (DDH 2 O). Autoklav vätska. När ägarn kyls till 50 ° C, dispensera vätska i bakteriella petriskålar (25 ml / skål) och låta plattorna torka (täckt) i BSC under 1 timme.
    OBS: Överföring BHI-agar i ett 50 ° C vattenbad efter autoklavering för att undvika stelning före upphällningen plattor. Förvara BHI plattorna vid 4 ° C upp och ner (med mediesidan överst) tills klar för användning.
  2. Förbered flytande BHI media. För detta, blanda 3,8% (vikt / volym) BHI-buljong i DDH 2 O. Autoklav.
  3. Ta bort frusen glycerol lager av L. monocytogenes EGD stam från -80 ° C fryserr och tina till rumstemperatur.
  4. Doppa en steril pipettspets i den tinade glycerolförråd och omedelbart strimma spetsen fram och tillbaka över en sektion av en BHI platta. Detta är den primära rad.
  5. Vrid plattan med 90 ° C och med en ny pipettspets drar genom den första strimma och sprida det till nästa ¼ av plattan (detta är den sekundära strimma). Upprepa en gång mer för att göra den tertiära rad.
  6. Vända plattan upp och ner och inkubera vid 37 ° C över natten. Enstaka enhetliga kolonier bör erhållas i den sista uppsättningen av streck och synliga mellan 16 och 24 timmar.
  7. Dispensera 10 ml steril BHI-buljong i en steril ventilerad 50 ml rör. Plocka en koloni av L. monocytogenes från plattan med användning av en steril pipettspets och inokulera buljongen. Inkubera kulturen i ett 37 ° C orbital skakinkubator över natten eller tills OD 600 = 1,0 med inställningarna vid 225 rotationer per minut (rpm).
    OBS: Glas eller engångs plaSTIC Erlenmeyerkolvar kan också användas för att odla bakterier. Oavsett vilken typ av behållare som används, se till att den är steril, ventilerade och att volymen av kultur inte överstiger 20% av den totala volymen av behållaren för att säkerställa en lämplig luftning av bakterierna.
  8. Förbered glycerolstam genom att blanda steril 100% glycerol med övernattning bakterievätskekultur i förhållandet 1: 1. Fördela bakteriell / glycerolblandning i 2 ml kryogena flaskor (500 l / flaska) och överföringsflaskor till -80 ° C frys för förvaring.
    OBS: Bead aktie metoder kan också användas i stället för glycerol lager för att lagra bakterier. Genom denna metod, är porösa mikropärlor inokulerades med en ren kultur av L. monocytogenes och lagras vid -80 ° C. Varje pärla kan användas för att inokulera en färsk kultur efter behov. Se material listan för ytterligare information.

2. Fastställande av tillväxtkurvan för L. monocytogenes i dag kultur OBS: Denna procedur beskriver hur man skapar tillväxtkurvan för L. monocytogenes som används för att uppskatta kolonibildande enheter (CFU) för infektionsstudier. Alla åtgärder som har potential att generera aerosoler bör utföras inom en certifierad BSC.

  1. Ta 100 pl nattgammal kultur som genereras i steg från 1,7 till 10 ml BHI media i en ventilerad 50 ml rör och växa vid 37 ° C i en skakinkubator (225 rpm, lutas vid 45 ° vinkel). Använda en icke-inokulerade röret som en kontroll.
  2. Ta 0,5 ml prover av kulturen med en timmes intervall (1, 2, 3, 4, 5, 6 h, etc.). Späd ut varje alikvot 1: 1 (volym / volym) med BHI-medium i en plastkyvett. Pipettera upp och ned för att blanda. Mät den optiska tätheten (OD) vid 600 nm (OD 600) med användning av en spektrometer. Fortsätter att odla bakterier tills OD 600 = 1.
  3. Samtidigt, ta ett prov av kulturen 100 pl och späd med 900 pl BHI media i en steril 1,5 ml microcentrifuge rör (detta är den 10 -1 utspädning). Centrifugera bakterierna vid 6000 xg under 5 min och aspirera supernatanten.
  4. Tvätta bakterier två gånger genom att återsuspendera pelleten i 1 ml BHI-medium, centrifugering under 5 min vid 6000 xg, och sedan aspirera supernatanten. Resuspendera pelleten i 1 ml BHI medium. Bered en 10-faldig spädningsserie av detta prov i BHI-medium (10 -2 till 10 -9). Sprid 100 pl av varje spädningsmedel på separata BHI-agarplattor. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C i en inkubator.
  5. Nästa dag, plocka plattor som har mellan 30 till 300 kolonier. Kassera resten. Räkna kolonier på dessa plåtar. Tabell 1 visar ett exempel på räkningar som erhållits i en portion som togs när OD 600 = 0,84. I detta exempel, en av plattorna (dvs., 10 -6 spädning) hade koloniräkningar mellan 30-300 och användes för CFU / ml beräkning.
    OBS: Plattor med störreän 300 kolonier används inte, eftersom överbeläggning kan hindra bakterietillväxt och gör det också svårt att urskilja och räkna individuella kolonier. Plattor med tal <30 inte heller användas eftersom små fel i utspädningsteknik eller förekomsten av föroreningar kan ha en stor inverkan på precision räknas i den nedre delen av intervallet.
  6. Dividera antalet kolonier med volymen pläterade och sedan multiplicera med spädningsfaktorn för att erhålla den CFU / ml-värdet för en viss utspädning. I exemplet i tabell 1, räkningen på 10 -6 utspädning var 70. Dividera detta värde med 0,1 ml för att få CFU / ml värde för den utspädda kulturen. Sedan multiplicera detta värde med spädningsfaktorn (10 6) för att erhålla CFU / ml värde av den outspädda kultur (7,0 x 10 8).
  7. Plotta OD 600 (y-axel) mot tiden i h (x-axeln) för att identifiera den logaritmiska tillväxtfasen 26.
    OBS: Denna tillväxt curve ger en uppskattning av CFU / ml av dagen kulturen då vuxit till en viss OD läsning. Välja en OD 600 läsning som är i den logaritmiska fasen av tillväxt som kan användas som ett mål OD 600 för att odla dagarskulturer. Dessa data nu kan användas för att uppskatta CFU i en kultur för framställning av inokulat (förfarande 3).

3. Beredning av inokulatet för experimentell infektion med L. monocytogenes

OBS: Denna procedur beskriver framställningen av smitt inokulat från en dag kultur som startades av en övernattskultur (framställd i ordningen 2). Alla dessa steg utförs i BSC om inte annat anges.

  1. Beräkna antalet CFU som krävs för infektion baserat på antalet av möss och experimentell design av studien. Lägg en lämplig volym av BHI media till en steril ventilerad Erlenmeyerkolv eller kultur rör.
    OBS: CFU bakterier prepared kommer att vara beroende av den typ av experiment som utförs. För att studera NK och NKT cellsvar under infektion, varje mus ympades med 10 5 CFU bakterier (ordningen 6). Om att studera adaptiva T-cellsvar till infektion eller mäta bakteriehalten är varje mus ympades med 2 x 10 4 CFU bakterier (ordningen 8). Om att studera överlevnad endpoints varje mus ympades med LD 50 dosen av patogenen (som är 10 5 CFU för män och 1,5 x 10 5 CFU för kvinnor, se ordningen 9).
  2. Inokulera röret innehållande BHI media med 100 pl av natten kultur. Inkubera kulturen i ett 37 ° C orbital skakinkubator (225 varv per minut) till dess mål-OD 600 har nåtts. Överför odlings innehållet till ett sterilt centrifugrör.
  3. Centrifugera bakterier till en pellet under 5 min vid 6000 xg under användning av en centrifug. Aspirera supernatanten med användning av en vakuum fäst till en fälla kolv innehållande blekmedel.
  4. Tvätta pelleten två gånger med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), centrifugering (5 min vid 6000 xg) däremellan.
  5. Aspirera den andra tvättningen och späd bakterier vid den lämpliga koncentrationen i 1x PBS för att leverera den CFU av intresse för varje mus i en 200 | al volym.
    OBS: Det är bäst att använda en kommersiell källa för steril 1x PBS för att tvätta bakterier och för beredning av inokulatet, eftersom lab glas kan införa immunologiska föroreningar såsom lipopolysackarid.

4. experimentell infektion av möss med L. monocytogenes

OBS: Den här proceduren beskriver hur du infektera möss med inokulum framställd i ordningen 3 och hur man kontrollera CFU levereras i ympen. Hantering av möss och injektioner utförs i en BSC.

  1. Beställa ett tillräckligt antal manliga eller kvinnliga C57BL / 6J möss för experimentet. Även beställa möss för att tjäna som oinfekterade kontroller.
  2. Tillåt möss motacklimatiseras i en vecka före bakteriell inokulering.
    OBS: Detta beror på stress i samband med transport av djur kan utlösa en övergående ökning av stresshormon produktion och lymfopeni 27,28.
  3. På dagen för ympning, erhålla en baslinje kroppsvikt för varje mus och spela in det i labbet anteckningsboken.
  4. I BSC, blanda bakteriesuspensionen upp och ned med hjälp av en steril pipett för att säkerställa att bakterierna är jämnt fördelade och sedan ta upp 200 ul av inokulatet in i en 1 ml säkerhet konstruerad spruta försedd med en 25 G-nål.
  5. Injicera en mus ip med 200 pl av beredd inokulum (t.ex. 10 5 CFU NK cellinfektion, ordningen 6). För denna procedur, scruff möss med mindre dominanta hand genom att ta tag i lös hud runt mus axlar. Efter att se till att musen är väl återhållsam, injicera musen i nedre kvadranten av buken, bara i sidled till midline att undvika urinblåsan.
  6. Kassera nålen och sprutan i ett biologiskt avfallsbehållare.
  7. Upprepa steg 4,3-4,6 tills alla möss injiceras. Genomföra liknande åtgärder med 1x PBS injicerade möss (icke-infekterade kontroller).
    OBS: Eftersom CFU är en uppskattning baserad på tillväxtkurvan, är det också bra att kontrollera den faktiska CFU i ympen. För detta förbereda 3 - 4 olika utspädningar av den förberedda inokulum (med 10-faldig utspädningsserie) som du förväntar dig kommer att resultera i kolonier som kan räknas. Sprid 100 pl av varje spädningsmedel på en BHI-agarplatta och inkubera över natten vid 37 ° C. Räknas kolonierna och beräkna den faktiska CFU / ml som beskrivits i förfarande 2.

5. Förbereda värmeavdödade L. monocytogenes för Immunstudier

OBS: Alla steg som har potential att generera aerosoler genomförs inom BSC.

  1. Odla dag kultur tills OD 600 värden enre nått som är inom den logaritmiska fasen. Fördela kultur i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  2. Inkubera rören i en 70 ° C i ett vattenbad under 1 h för att döda bakterier.
  3. Tvätta bakterier två gånger med 1 x PBS som i steg 3.3 och 3.4. Återsuspendera i sterila kompletta RPMI-medium innehållande fetalt kalvserum (FCS) (se Kompletterande fil 1 för recept) vid en koncentration av 4 x 10 6 / ml. Alikvotera dödade bakterier i 2 ml sterila kryogena flaskor och förvara vid -80 ° C.
  4. Bekräfta död av bakterierna genom att sprida 100 | il av värmedödade bakterier beredning på BHI-agarplattor och inkuberades över natt vid 37 ° C.
    OBS: Dessa värmedödade bakterier bör vara redo för att stimulera lymfocyter i odling i ordningen 8. Om det finns några kolonier växer på BHI agarplatta, upprepa värmedödande procedur.

6. Mätning av IFN-y Svar från NK och NKT celler under infektion

OBS: Den här proceduren beskriver hur man mäter de IFN-y reaktioner från NK och NKT-celler i möss vid 24 timmar efter infektion med 10 5 CFU L. monocytogenes. Denna dos används eftersom det framkallar robust IFN-y reaktioner från NK och NKT-celler i mjälten 24. Genomföra alla steg i BSC. För att upprätthålla cellviabiliteten, hålla cellerna på is när det är möjligt och använda iskalla buffertar.

  1. Inokulera möss, såsom beskrivits i förfarande 4 med 10 5 CFU av L. monocytogenes. Samtidigt, injicera icke-infekterade kontrollmöss ip med en lika stor volym av 1 x PBS.
  2. Avliva möss vid 24 timmar efter ympning av CO 2 inandning enligt institutionens riktlinjer.
  3. Lie varje mus på sin högra sida och blöta ner huden med 70% etanol med hjälp av en klämflaska.
  4. Med hjälp av aseptiska eller sterila pincett och tuffa skuren sax, incisionsfilm huden strax under botten av bröstkorgen.
  5. Spraya nerexponerade muskellagret med 70% etanol. Mjälten ska vara synlig under muskellagret (öppen pil huvudet i figur 1).
  6. Med hjälp av aseptiska eller sterila pincett och fina saxar, incisionsfilm muskellagret för att avslöja mjälten. ta försiktigt mjälte med pincett och använda fina sax för att klippa mjälten bort från omgivande bindväv.
  7. Placera mjälten i en 15 ml koniska rör innehållande steril 1x PBS.
  8. Halv fylla sterila petriskålar med steril 1x PBS. Dissociera mjälten genom en 70 pm nylon cell sil i petriskål med den platta änden av en steril 3 ml spruta.
  9. Överför splenocyt suspensionen i en ren steril 15 ml koniska rör med en steril 10 ml serologisk pipett.
  10. Centrifugera proverna vid 335 xg under 10 min vid 4 ° C.
  11. Aspirera supernatanten i en fälla kolv innehållande blekmedel. Lossa cellpelleten genom att ställa röret med ett finger eller genom att dra den nedre röretfram och tillbaka längs en korrugerad yta (t.ex. luftflöde ventil i BSC).
  12. Lyserar röda blodkroppar genom att lägga till 1,5 ml av Ammonium-Klorid-Kalium (ACK) lysbuffert (se Supple Fil 1 för recept) till varje mjälte. Efter exakt 1 min och 15 sekunder, fylla röret med 1 x PBS för att stoppa cellys.
  13. Centrifugera cellerna såsom beskrivs i steg 6,10. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) Buffert (sterilt 1x PBS innehållande 2% FCS).
  14. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer. För detta, ta två alikvoter av cellsuspension för att räkna. Tillsätt 15 | il av varje cellsuspension till en lika stor volym av trypanblått (0,04%, gjordes genom att späda 0,4% trypanblått-lösning i DDH 2 O). Belastning 15 pl av varje cell / Trypan blå suspensionen i kammaren i hemocytometer (dvs, en i den övre kammaren, en i den nedre kammaren).
  15. Med hjälp av ett mikroskop, räkna alla icke-blå celler ifem stora rutor av centrala gallret i varje kammare (Figur 2). Ta denna räkning och dela det med 10 för att erhålla antalet celler i 10 6 / ml. I exemplet i figur 2, är räkningen 215 celler i 5 rutor; Därför, är cellkoncentrationen 21,5 x 10 6 / ml. Genomsnitt cellkoncentrationer som erhållits från de två proven.
  16. Seed 1 x 10 6 celler per brunn / fläck i en 96-brunnars rundbottnad platta för flödescytometri färgning. Se till att också utsäde celler för ofärgade och fluorescens minus ett (FMO) kontroller. Se rekommenderade flödescytometri färgning panel i tabell 2.
    OBS: För följande steg, är det rekommenderat att hålla cellerna på is eller vid 4 ° C och för att skydda cellerna från ljus med folie när fluorokromer är närvarande. En multikanalpipett kan användas för att dispensera vätskor in 96-brunnars färgnings plattor för att snabba upp bearbetningen. Var noga med att inte störa cellpelleten näraspirera supernatanten från den centrifugeplattan. Färgning kan också göras i FACS rör om centrifugen inte är försedd med plattadaptrar. Alla centrifug steg från denna punkt görs vid 456 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
  17. Centrifugera plattan och sedan tvätta cellerna två gånger med FACS-buffert. En tvättning sker genom att tillsätta 200 pl FACS-buffert till varje brunn, centrifugering av plattan, och sedan aspirera supernatanten.
  18. Utföra blockeringssteg genom att tillsätta 50 | il / brunn av FACS buffert innehållande anti-mus CD16 / CD32 (renat Fc-block) (0,5 ^ g). Inkubera cellerna vid 4 ° C under 15 min. Tvätta cellerna en gång i 1 x PBS såsom beskrivits ovan.
  19. Tillsätt 100 pl livskraft färgämne (fastställbara livskraft färgämne utspätt 1: 1000 i 1x PBS) till celler. Fläcken celler vid 4 ° C i mörker (i kylskåp) i 30 minuter. Tvätta cellerna två gånger i FACS-buffert såsom beskrivits ovan.
  20. Efter en andra tvätt, tillsätt 100 | il av cellytans antikroppar eller tetramerer till brunnarna enligt to färgningspanelen beskrivs i tabell 2. Fläcken celler vid 4 ° C i mörker (i kylskåp) i 30 minuter. Vid denna tid, även lägga till antikroppar för färgning enstaka positiva och FMO kontroller.
    OBS: När det gäller enstaka positiva kontroller, är det rekommenderat att använda antingen splenocyter som färgas med olika fluorokrom versioner av CD4-antikroppen eller kommersiella ersättning pärlor som är färgade med antikroppar som används i panelen. Innan du genomför denna färgningsproceduren bör alla FACS antikroppar titreras i prov studier för att bestämma optimala koncentrationer för färgning.
  21. Tvätta cellerna två gånger i FACS-buffert såsom beskrivits ovan och därefter fastställa celler genom att återsuspendera dem i 50 pl av 4% paraformaldehyd (16% paraformaldehyd lager utspädd i DDH 2 O) och inkubering under 10 min vid rumstemperatur. VARNING: Paraformaldehyden är giftig och bör endast hanteras i dragskåp.
  22. Tvätta cellerna två gånger in FACS buffert, centrifugering däremellan. Resuspendera celler i FACS-buffert. Fortsätt till nästa steg eller minnesceller i kylskåp skyddas från ljus i upp till tre dagar.
  23. Centrifugera cellerna, avlägsna supernatanten och tvätta cellerna två gånger med 150 pl 1x Permeabilization / Wash Buffer (Perm / tvättbuffert), centrifugering däremellan. Perm / tvättbuffert framställs från en 10x lager genom att späda 1: 9 (volym / volym) i DDH 2 O.
  24. Efter den andra tvättningen, resuspendera cellerna i 150 pl av Perm / tvättbuffert och inkubera i 15 min vid 4 ° C i mörker.
  25. Centrifugera cellerna igen och sedan aspirera supernatanten. Resuspendera cellerna i 50 fil 1x Perm / tvättbuffert innehållande anti-IFN-γ och inkubera under 1 h vid 4 ° C i mörker.
  26. Tvätta cellerna två gånger med 1x Perm / tvättbuffert, centrifugering däremellan. Resuspendera cellerna i 250 | il FACS-buffert och sedan överföra cellerna till FACS-rör.
  27. Fortsätt till flödescytometri förvärv med hjälp av en flödes cytometer som har en lämplig laserkonfiguration och filteruppsättning för att diskriminera fluorokromer som används i färgningspanelen beskrivs i tabell 2 29. Samla minst 200.000 händelser per prov och 10.000 händelser för kontroller ersättning.
  28. Applicera ersättning matris och analysera data med hjälp av flödescytometrisk analys programvara 30.

7. Mätning av bakteriehalten i mjälten och levern vid tidpunkten för Peak infektion

NOTERA: Alla steg utförs inom en BSC om inget annat anges.

  1. Inokulera möss ip med 2 x 10 4 CFU av patogenen med hjälp av förfaranden som beskrivs i ordningen 4.
  2. På dag 3 efter infektion, förbereda sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör, var och en innehållande 500 | il iskall steril 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS och 0,2-0,3 g av 1,5-2 mm syratvättade sterila glaspärlor. Väg varje rör.
    OBS: Glaspärlor syra tvättas genom incubating i 10% ättiksyra i en bägare på en magnetomrörare under 1 timme. Dessa pärlor sedan tvättas omfattande med DDH 2 O för att avlägsna syra, lufttorkas och sedan autoklaveras före användning.
  3. Avliva möss genom CO 2 exponering.
  4. För dissekering av organ, låg djuret på rygg på en dissekera ombord och stift lemmar musen till styrelsen med hjälp av 25 g nålar. Desinficera huden genom vätning med 70% etanol.
  5. Användning av sterila tuffa skära sax, gör en mittlinje snitt i huden från ljumsken till mitten av bröstet och sedan från mitten av ljumsken mot varandra knä och från mitten av bröstet mot varandra armbågen. Blunt dissekera och reflektera tillbaka huden, sätter det öppna med 25 G nålar.
  6. Desinficera muskellagret genom vätning den med 70% etanol och sedan med användning av sterila fina saxar gör en mittlinje snitt i den peritoneala väggen. Ta xiphoid processen med pincett. Sedan, med samma fina saxar, göra nedskärningar i den peritoneala väggen från xiphoid förfass i sidled på varje sida, till följd av bröstkorgen, precis under diafragman för att avslöja levern.
  7. Klipp ut en ~ 100 mg bit av levern (använd samma lob för alla möss) med hjälp av steril sax och placera den i en förvägd 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  8. Använd pincett för att försiktigt skjuta undan organ på den vänstra sidan av bukhålan att visualisera mjälten. ta försiktigt mjälte med en pincett och frigöra den från bukhålan genom att skära bort den omgivande bindväven.
  9. Placera mjälten i det på förhand vägda 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande pärlor. Transport vävnader till laboratoriet i en läcksäker behållare innehållande is. Åter väga rör innehållande organ för att bestämma vävnadsvikter i mg.
  10. Homogenisera vävnaderna genom att skaka rören med användning av en pärlkvarn homogenisator under 3 min vid frekvens av 30 Hertz.
    OBS! Pärlkvarn metoden är att föredra för homogenisering som är mottaglig för processjunga ett stort antal prover och skapar mindre oreda och potentiell exponering för patogenen. Men automatiska homogenisatorer eller autoklav 2 ml manuell glasfilt homogenisatorer kan användas som ett alternativ.
  11. Bered en 10-faldig spädningsserie av homogenaten i 0,1% Triton-X-100 i 1 x PBS, som sträcker sig från (som sträcker sig från outspädd till 10 -7).
  12. Sprid 100 pl av varje utspätt homogenatet på en BHI-agarplatta (i två exemplar) med hjälp av en steril spridare. Överföringsplattor till en 37 ° C inkubator och inkubera över natten.
  13. Håll plattorna som innehåller mellan 30 och 300 kolonier / platta, kassera resten. Räkna kolonier på varje platta och bestämma det genomsnittliga antalet kolonier för dubbla uppslag.
  14. Beräkna CFU / mg enligt följande ekvation:
    CFU / mg = CFU / ml i homogenatet, multiplicerat med de ml homogenisat framställt dividerat med mg räknat på tissue homogeniserades.
    OBS: Om exempelvis ett medelvärde av 30 colonies räknades efter plätering 100 pl 10 -2 utspädda homogenisat framställt utifrån en 120 mg bit av levern som homogeniserades i 0,5 ml, beräkningarna skulle vara enligt följande:
    CFU / ml = 30 kolonier x 100 (spädningsfaktor) / 0,1 ml (volym spread) = 30.000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30.000 CFU / ml x 0,5 ml homogenat / 120 mg vävnad = 125 CFU / mg.

8. Effekter av L. monocytogenes på IFN-y svar från CD4 + och CD8 + -celler

OBS: Den här proceduren beskriver hur man mäter IFN-γ produktion av mjält CD4 + och CD8 + T-effektorceller skördas vid tidpunkten för toppen av det adaptiva immunsvaret (~ 7 d efter infektion) med hjälp av två metoder: (1) flöde cytometri för att mäta IFN-y av CD4 + och CD8 + -celler genom intracellulär cytokin-färgning, och (2) ELISA för att mäta de totala IFN-γ nivåer som produceras av splenocyter (inkluderar alla T-celler). förfarandenutförs inom BSC.

  1. Infektera möss genom att injicera ip med 2 x 10 4 CFU av patogenen med hjälp av förfaranden som beskrivs i ordningen 4.
  2. På dag 7 efter infektion, avliva möss genom CO2 inhalering enligt institutionens riktlinjer.
  3. Dissekera mjälten (såsom beskrivits ovan) och placera i ett 15 ml koniskt rör innehållande steril 1 x PBS. Transportera rören till laboratoriet i en läcksäker behållare innehållande is.
  4. Behandla mjälte i en enda cell fjädring, lyse röda blodkroppar som beskrivs i avsnitt 6, och sedan återsuspendera celler i komplett RPMI-medium innehållande 10% FCS. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
  5. Inrätta kulturer för mätning av IFN-y svar. För detta dispenseringsceller (4 x 10 6 i 1 ml / brunn) i 24-brunnars plattor tillsammans med och lika många (fyra x 10 6 eller en ml / brunn) av upptinade värmeavdödade L. monocytogenes (framställd i Förfarande 5) . Överför celler till en 37° C inkubator.
  6. Efter 20 h inkubation, tillsätt 0,66 ml / ml av proteintransport inhibitor till brunnarna och fortsätta inkubationer.
  7. Fyra h senare, överföringsplattan till BSC och samla 500 l av odlingssupernatant och frys (vid -80 ° C) för senare mätning av IFN-y-nivåer med hjälp av ett kommersiellt enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) -kit 31. Sedan samla in celler i en steril 15 ml rör. Tvätta brunnarna med 1 x PBS och samla denna tvätt tillsammans med uppsamlade cellerna.
  8. Genomföra färgning cellytan och intracellulärt färgning för IFN-γ på CD4 + och CD8 + -celler som beskrivits i förfarande 6 använd dock färgningspanelen beskrivs i tabell 3. Fortsätt att flödescytometer förvärv (samla 200.000 händelser / prov) och analysera data 29 med hjälp av flödescytometri analysprogram 30.

9. Mätning mus överlevnad till Endpoints efter L. monocytogenes Infection

OBS: Denna procedur beskriver effekten av ett medel på mus överlevnad endpoints efter infektion med den modifierade LD 50 dosen av patogenen. Alla dessa förfaranden genomförs i BSC i djuranläggningen.

  1. Injicera möss ip med det modifierade LD 50 dos av L. monocytogenes som beskrivits i Förfarande 4. Detta bestämdes vara 10 5 CFU (för manlig) eller 1,5 x 10 5 CFU (för kvinnliga) 31.
  2. Följ möss två gånger dagligen för kliniska tecken och registrera dessa tecken och djurkroppsvikter i ett labb anteckningsbok. Euthanize möss om de visar en förlust 20% i kroppsvikt eller två kliniska tecken på listerios (letargi, ruggig päls, krökt kroppshållning, ansträngd andning, matt eller insjunkna ögon).
  3. Efter 14 dagar, avliva överlevande möss via CO 2 inandning.
  4. Förbered Kaplan-Meier kurvor för data genom att plotta procent överlevnad i varje grupp mot tiden 32.
    (Figur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 presenterar några typiska flödescytometri färgning av IFN-γ i mjält-NK och NKT-celler vid 24 h efter infektion med 10 5 CFU av patogenet. Denna figur illustrerar också grindningsstrategi för färgning panelen beskrivs i tabell 2. Figur 4 visar några representativa uppgifter som erhölls i ett experiment där hanmöss behandlades med PPARa antagonisten IS001 eller fordonskontroll, infekterade med 10 5 CFU L. monocytogenes, och därefter analyseras med avseende på IFN-γ i NK och NKT-celler efter 24 timmar . Denna siffra visar att behandling med IS001 ökade IFN-y reaktioner från NKT-celler, men inte NK-celler efter infektion med patogenen. Figur 5 visar representativa färgning för IFN-γ i mjält CD4 + och CD8 + T-celler vid 7 dagar efter infektion efter återstimulering ex vivo med värmeavdödade pathogen. Denna figur visar även grindningsstrategi för färgning panelen beskrivs i tabell 3. Figur 6 visar representativa data som erhölls i ett experiment där hanmöss behandlades dagligen med PPARa antagonisten IS001 eller vehikelkontroll, infekterade med ett subletal dos av L. monocytogenes, och analyserades vid 7 dagar efter infektion. Detta experiment visar att behandling med IS001 förstärkt IFN-y-svar från både CD4 + och CD8 + lymfocyter. Figur 7 visar representativa uppgifter från en studie som undersökte effekten av PPARa antagonisten IS001 på mus överlevnad endpoints efter infektion med den modifierade LD 50 dosen av patogenen. Plottades är procenten överlevnad av möss mot tiden efter infektion. Denna figur visar att behandling med IS001 ökade överlevnaden av hanmöss till slutpunkter. Tillsammans har dessa data illustrerar hur denna modell kan tillämpas för att undersökaeffekterna av nya läkemedel eller behandlingar på IFN-γ svar in vivo och att undersöka hur dessa immun förändringar påverkar djuröverlevnad från infektion.

Figur 1
Figur 1. Analysera mjältar från infekterade möss. Denna serie av bilder visar hur man dissekera mjälten från en död mus. (a) Lie musen på dess högra sida och spraya ner huden med 70% etanol. (b) Genom användning av aseptisk eller steril pincett och tuffa skuren sax, incisionsfilm huden strax under botten av bröstkorgen. (c) Spray ned exponerade muskelskiktet med 70% etanol. Mjälten ska vara synlig under muskellagret (öppen pilspets). (d) Genom användning av aseptisk eller steril pincett och fina saxar, incisionsfilm muskellagret för att avslöja mjälten. (e) ta försiktigt mjälte med pincett och uSE fina sax för att klippa mjälten bort från omgivande bindväven. (f) Placera mjälten i en 15 ml koniska rör innehållande steril 1x PBS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Räkna Splenocyter med hjälp av en hemocytometer. (a) visar den centrala rutnätet av hemocytometer. (b) visar en förstorad vy av den centrala rutnät som innehåller 25 stora kvadrater (som var och en innehåller 16 mindre kvadrater). De fem stora rutor som används för att räkna är markerade i grått (4 hörn rutor plus centrum torget i centrala elnätet). (c) visar en förstorad vy av en av de stora grå rutor. För att bestämma cellvolymen i 10 6 / ml, första räkningenalla livsdugliga celler i fem stora grå rutor. I det visade exemplet är denna räkning 215. Vid räkning, se till att endast räkna alla de klara (icke-blå) celler, inklusive de som vidrör dubbla linjer till höger och längst ned på nätet. Räkna inte cellerna vidrör dubbla linjer till vänster och toppen av gallret. Ta den totala fem kvadrat räkna och dela det med 10 för att erhålla antalet celler i 10 6 / ml. I exemplet, 215 delat med 10 är 21,5 x 10 6 celler / ml. Observera att dessa beräkningar fungerar bara om du räknar fem av de stora rutorna som markeras och späd cellerna 1: 1 i trypanblått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Gating strategi för detektion av IFNγ Produktionen i NK och NKT-celler. Första porten på lymfocyter på FSC-A från SSC-A tomt. Sedan grind på de händelser som är på diagonalen på FSC-H / FSC-A tomt. Dessa är de sing. Sedan grind på levande (AmCyan -) och CD8 - celler. Sedan rita tetramer färgning mot TCRβ. De NKT-celler är inom den dubbla positiva befolkningen och NK-celler är inom dubbel negativ befolknings. Gate på de dubbla positiva celler, och tomt NKp46 kontra FSC. Grind på NKp46 negativ befolknings, som är NKT-celler (kan denna port ställas in genom att hitta den punkt division i de två populationerna från NK cell tomt). NK-celler är tetramer - TCRβ - NKp46 + befolkning. Inom NK och NKT celler grindar, är IFN-y + celler i PE-kanalen identifieras efter att en grind baserat på FMO kontroll. klickahär för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Representativa uppgifterna om den Frekvenserna av IFN-γ + NK och NKT-celler vid 24 timmar efter infektion. I detta experiment, C57BL / 6J-möss (N = 3-4 / grupp) var infekterade ip med 10 5 CFU L. monocytogenes eller lämnades un-smittade. Möss administrerades också läkemedlet IS001 eller vehikel (0,5% karboximetylcellulosa) på samma tidpunkten för ympning och 12 h senare. Tjugofyra timmar efter inokuleringen fick mössen avlivades och mjältarna avlägsnades och bearbetades individuellt och färgades för flödescytometri. Visas är medelvärdet ± SEM frekvens av IFN-γ + celler i NK (a) eller NKT-cell grindar (b) hos icke-infekterade eller infekterade möss efter behandling med ett fordon eller läkemedlet IS001. *Indikerarsa skillnad (P <0,05) från vehikelkontroll av två-tailed T-test. Data åter ut från 31 med tillstånd från Journal of Immunology (volym 195, sid. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Gating strategi för detektion av IFN-γ Produktion i CD4- och CD8-celler. Första porten på lymfocyter på FSC-A av SSC-A tomter. Sedan grind på de händelser som är på diagonalen på FSC-H / FSC-A tomt. Dessa är de sing. Inom denna port, grind på levande (AmCyan -) CD45 + celler. Då porten på antingen CD8 + eller CD4 + populationer. Inom varje grind, IFN-γ +celler i PE-kanalen identifieras genom att jämföra färgningen till FMO kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Representativa uppgifterna om den Frekvenserna av IFN-γ + CD4 + och CD8 + T-celler vid 7 dagar efter infektion med L. monocytogenes (EGD stam). I detta experiment, var manliga C57BL / 6J-möss infekterade ip med 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (N = 7 / grupp) eller lämnades oinfekterad (N = 3 / grupp). Möss administrerades också läkemedlet IS001 eller vehikel (0,5% karboximetylcellulosa) två gånger dagligen med start på dagen för ympning. Sju dagar senare, mössen avlivades och mjälten avlägsnades och bearbetades individuellt förcell kultur. Splenocyt mononukleära celler stimulerades under 24 h med värmeavdödade L. monocytogenes med proteintransport inhibitor tillsatt för sista 4 h av kultur. Cellerna färgades sedan för flödescytometri. Visas är medelvärdet ± SEM frekvens av IFN-γ + celler i CD4 + (a) eller CD8 + celler grindar (B) i oinfekterade eller infekterade möss efter behandling med en vehikel (0,5% karboximetylcellulosa) eller drogen IS001. * Anger en skillnad (P <0,05) från vehikelkontroll motsvarigheten när det bestäms av två-tailed T-test. Data åter ut från 31 med tillstånd från Journal of Immunology (volym 195, sid. 5189-5202, 2015) .COPYRIGHT 2015. American Association of Immunologer, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 7. Representativa data som erhållits under ett experiment som jämförde effekten av en PPARa antagonist 1S001 på musen överlevnad till Endpoints efter infektion av C57BL / 6J möss med L. monocytogenes (EGD stam). I detta experiment, male C57BL / 6J-möss (N = 10 möss / grupp) infekterades ip med det modifierade LD 50 dos av patogenen (10 5 CFU) av L. monocytogenes. Möss administrerades också läkemedlet IS001 eller vehikel (0,5% karboximetylcellulosa) två gånger dagligen med start på dagen för ympning. Möss följdes dagligen för kliniska tecken och avlivades om humana slutpunkter möttes. Visas är den procentuella överlevnaden hos möss till endpoints över tid * anger en skillnad i överlevnad mellan grupperna såsom bestäms genom log-rank test (P <0,05). Data åter ut från 31 med tillstånd från Journal of Immunology (volym 195, sid. 5189-5202, 2015). Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1: visar några motsvarande beräkningar för fastställande CFU i en delmängd av Dag kultur. I detta exempel framställdes en alikvot av dagars odling tas och späddes 1: 1 med BHI medier. OD 600 av detta utspädda prov bestämdes till att vara 0,84. Dessutom har en 100 ul alikvot tas för CFU-bestämning. Detta prov späddes med 900 pl BHI media (10 -1) och tvättades och återsuspenderades i 1 ml BHI. En 10-faldig spädningsserie av detta prov framställdes (10 -2 till 10 -9) och spädda prover utströks på BHI agar plattor (endast värden för 10 -4 till 10 -9 visas). Nästa dag kolonierna räknades. Endast de plattor som hade koloniantal mellan 30-300 ansågs för beräkningen (dvs 10 -6 platta, gulmarkerat). Antalet kolonier på denna platta (70) dividerades sedan med 0,1 (volym i ml pläterat) för att få den CFU / ml av det utspädda provet. Detta värde multiplicerades därefter med spädningsfaktorn (10 6) för erhållande av CFU / ml läsning av den outspädda kulturen. TMTC = alltför många för att räkna.

tabell 2
Tabell 2: färgning Panel för detektion av IFN γ i NK och NKT celler. Observera att antingen kompensations pärlor färgade med flödes antikroppar som används i panelen eller splenocyter färgade med olika fluorokrommängder versioner av CD4-antikropp klon GK1.1 kan användas som enstaka positiva kontroller.

tabell 3
Tabell 3: Färgning Panel för detektering av IFN-γ i CD4 + och CD8 + -celler. Observera att antingen kompensations pärlor färgade med flödes antikroppar som används i panelen eller splenocyter färgade med olika fluorokrommängder versioner av CD4-antikropp klon GK1.1 kan användas som enstaka positiva kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll för hur man genomför en grundläggande experimentell infektion med EGD stam av L. monocytogenes 25 i manliga eller kvinnliga C57BL / 6J möss. Detta protokoll upprättades för att studera effekten av en ny liten molekyl IS001 på IFN-γ produktion av medfödda och adaptiva lymfocyter in vivo 31. Genom att övervaka bakteriell clearance och överlevnad efter infektion, var insikter i hur dessa förändringar i IFN-γ påverkat värdens förmåga att bekämpa infektionen.

Kritiska överväganden i protokollet

En viktig faktor i utformningen av denna typ av studier är att varje försök att på lämpligt sätt drivs och kontrolleras på lämpligt sätt. På grund av att biologiska variationen hos immunsvaret mot infektion (se figurerna 4 och 6), är det rekommenderat att N = 4-5 möss per grupp bör användas för de initiala immunstudier. Om enfter dessa studier finns det en trend i data, men ingen signifikant skillnad uppenbar mellan grupperna, skulle en effektberäknings göras för att avgöra det minsta antalet djur som krävs i senare studier att uppnå statistisk signifikans. När det gäller kontroller, är det viktigt att inkludera oinfekterade kontroller för bestämning av baslinje IFN-y svar för immunstudier och fordonskontroller för att hjälpa särskilja effekten av behandling från stress i samband med att administrera behandlingen. Ett annat viktigt övervägande är tidpunkten för behandlingen. Eftersom det medfödda svar på L. monocytogenes är mycket snabb, är det rekommenderat att den första behandlingen ges på dagen före, eller samtidigt som, ympning för att se till att terapeutiska nivåer av reagens uppnås före initiering av det medfödda immunsvaret.

Ytterligare en annan viktig faktor är den dos av patogenen som skall användas för infection. En subletal dos rekommenderas för mätning av bakteriehalten, eftersom det ökar chansen att patogenen kommer att koncentreras inom mjälten och levern, gör det möjligt att mer exakt uppräkning av bakterierna. En subletal dos rekommenderas också för att räkna IFN-y reaktioner från adaptiva lymfocyter för att säkerställa att djuren inte ge efter för listerios innan tiden för expansions topp T-cell. Däremot rekommenderas att en högre smitt dos användas för mätning av den tidiga NK och NKT-cellsvar på 24 timmar för att maximera IFN-γ produktion av dessa celler.

Den klassiska LD 50 är dosen av patogen som resulterar i 50% letalitet hos möss. Eftersom döden var inte en godtagbar slutpunkt på vår institution och eftersom många symptom på listerios kan förutsäga om ett djur är risk att drabbas av en infektion, använde vi en definierad lista av kliniska tecken i stället för död som en slutpunkt i våra studier. using denna metod, bestämdes det att den modifierade LD 50 var 10 5 CFU åtta veckor gamla manliga och 1,5 x 10 5 CFU åtta veckor gamla C57BL / 6J möss 31. Dessa LD 50 doser bestämdes genom mätning av den procentuella överlevnaden av möss till endpoints i stegvisa dos-eskalerings studier (N = 5 studier på totalt) att varje innehöll N = 8 möss per grupp (t.ex. möss infekterades först med 10.000 CFU , sedan en andra sats med 20.000 CFU, etc.). LD 50 beräkningen bestämdes från en regressions plot av log (CFU) (x-axel) mot den probit av procent överlevnadsvärden (y-axel) (webbplats: userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit /ProbitAnalysis.pdf).

Observera att den modifierade LD 50 dosen bestäms i vårt labb kan skilja sig från det i en annan lab även när infekterar möss med samma stam av L. monocytogenes. En del av denna variation kan avse ett subjektivt natur of övervaka kliniska tecken på listerios jämfört med den mer absoluta slutpunkten för döden. Ytterligare variationer kan bero på skillnader i miljöfaktorer såsom mus diet eller mikrobiota eller skillnader i beredningen av inokulatet mellan laboratorier. Således är det rekommenderat att innan man startar några studier överlevnad, en förstudie genomföras där honmöss (N = 8 möss / grupp) infekteras med 1,5 x 10 5 CFU av samma stam av L. monocytogenes som används i denna studera och symptom övervakas för att avgöra om denna dos leder faktiskt i 50% överlevnad endpoints. Om överlevnad är lägre eller högre än 50% vid denna CFU, kan stegvis dosupptrappningen eller dosering nedtrappnings studier göras för att snabbt minska in på LD 50 dosen.

En annan viktig faktor är den stam eller stam av möss som användes för infektionsstudier. Detta protokoll beskriver infektion i vanligt förekommande inavlad musstam C57BL / 6J. Detta stam är väl lämpad för mätning av IFN-y-svar, eftersom denna mus anses vara en Th1-benägen stammen 33 och som ett resultat, är relativt resistent mot L. monocytogenes-infektion (jämfört med Th2-benägna musstammar såsom BALB / c) 34,35. Anpassa detta protokoll till andra musstammar kräver kunskap om den smittsamma dosen av patogenen för den speciella stammen. Det rekommenderas också att använda möss av samma ålder, kön och säljare som beskrivs i detta protokoll i syfte att minska mängden felsökning som deltar i inrättandet av modellen. Till exempel, C57BL / 6 möss beställas från en leverantör (t.ex. C57BL / 6J) kan uppvisa genetiska skillnader än C67BL / 6-möss som beställts från en annan leverantör (t.ex. C57BL / 6NTac) 36. Dessutom skiljer sig den intestinala mikrobiota mellan C57BL / 6 substrains erhållna från olika leverantörer, som kan påverka balansen mellan Th1 och Th17 svar i musen 37.

ove_title "> Potentiella Ändringar Teknik

Möss är vanligast inokulerades ip eller intravenöst i motsats till den naturliga vägen för infektion hos människa, vilket är genom mag-tarmkanalen. Orala infektioner är mindre vanligt eftersom standard stammar av L. monocytogenes infektera ineffektivt tarmepitelet hos möss 38. Detta beror på att det finns en enda aminosyraförändring i sekvensen av mus E-cadherin från humant E-cadherin som resulterar i förlust av erkännande av E-cadherin av listerial invasionen protein, internalin A (INIA) 39. För att övervinna denna barriär, forskare använder möss som är transgena för humant E-cadherin protein eller använda listeria som har konstruerats för att uttrycka en muterad sekvens av Inia (Inia mut) som binder till mus E-cadherin med samma affinitet som WT EGD för humant E-cadherin 40. Således är en potentiell modifiering av denna teknik för att infektera möss via den orala vägen. Läsaren hänvisas till en annan JUPITER publikation som beskriver orala ympning metoder 38. Notera att förändring av läget för infektion kommer att påverka den infektiösa dosen samt kinetiken för spridning av patogenen.

Detta protokoll beskriver användning av värmedödade listeria att framkalla IFN-γ-produktion genom CD4 + och CD8 + T-celler. Värmeavdödade L. monocytogenes valdes som en stimulans i våra studier, eftersom denna antigen är billigt och eftersom vårt labb var främst intresserad av CD4 + T-cellsvar hos den patogen. En begränsning är att värmedödade bakterier inte effektivt prime CD8 + T-cellsvar, antingen in vitro 41 eller in vivo 42,43 infektion. Således, (det vill säga, figur 6) är CD8 + T-celler IFN-γ produktion som vi observerade av splenocyter skördas på toppen av infektion sannolikt till följd av kvarvarandelevande bakterier som föreligger i de splenocyt kulturer eller kunde framkallas som ett resultat av cytokin-inducerad cytokin-frisättning 41. Som ett alternativ till värmeavdödade listeria, skulle man också kunna framkalla IFN-y-responser ex vivo genom att exponera T-celler till peptider som kodar för epitoper på listerial proteiner. Faktum är immunodominant MHC klass Il-begränsade epitoper för listeriolysin O och p60 hydrolas och har beskrivits för C57BL / 6 och BALB / C-möss och immunodominanta MHC klass I-epitoper har beskrivits för BALB / c-44. Ännu ett annat tillvägagångssätt är att infektera möss med stammar av L. monocytogenes som har manipulerats för att uttrycka modellantigener såsom ovalbumin eller virala antigener för att dra fördel av existerande MHC klass I- och MHC klass Il-tetramer reagens för att räkna upp antigenspecifik T-celler i infekterade möss 45,46.

Andra begränsningar i protokollet

En annan begränsning av denna modell är att det ondast åtgärder IFN-γ-produktion genom immunceller i mjälten. Förutom användning av tetramerer att räkna upp antigenspecifika T-celler (av ovalbumin-uttryckande varianter av L. monocytogenes), flödescytometri färgningspaneler som beskrivs här kan enkelt modifieras för att mäta produktionen av andra cytokiner, såsom TNF eller IL-2 eller effektormolekyler som deltar i CD8 T-cell eller NK-medierad avdödning av patogenet såsom perforin eller granzym B. Dessutom kan detta protokoll också anpassas för att undersöka IFN-γ som produceras av immunceller i levern.

framtida tillämpningar

När detta protokoll behärskar, kan det fungera som en enkel in vivo modell för att screena effekterna av olika medel eller gener på Th1 och cellulär immunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1x PBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaldehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS
10x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 1x in ddH2O
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Use one drop per stain
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 ml vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL/6J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 weeks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes Fisher Scientific 14-959-5
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0 - 300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnostics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Tags

Infektion , Bakterier infektionsmodell möss flödescytometri interferon-γ svar
Experimentell infektion med<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Som modell för att studera värd Interferon-y Responses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, … More

Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter