Summary
这个协议描述如何接种C57BL / 6J小鼠李斯特菌的EGD株（单增李斯特菌），并测量干扰素γ（IFN-γ）的反应由自然杀伤（NK）细胞，天然杀伤T（NKT）细胞，和自适应T淋巴细胞后感染。该协议还介绍了如何进行生存研究，小鼠感染后有修改的LD 50剂量的病原体。
Abstract
李斯特菌是革兰氏阳性细菌是食源性疾病的人类的原因。与此病原体的小鼠实验性感染一直对先天性和适应性免疫细胞和特定细胞因子的抗细胞内病原体宿主免疫中的作用非常翔实。 李斯特杆菌亚致死感染期间由先天细胞的IFN-γ生产是活化的巨噬细胞和病原体1-3的早期控制很重要。此外，IFN-γ的生产由自适应存储器淋巴细胞是用于在再感染4吸先天细胞活化重要的。 单增李斯特菌感染模型从而作为一个伟大的工具调查，旨在提高IFN-γ生产的新疗法是否在体内的IFN-γ反应产生影响，并有生产性生物效应，如增加细菌清除或改善生存鼠标从感染。这里描述的是用于如何进行C57BL / 6J小鼠用单增李斯特菌的EGD株腹膜内感染和流式细胞测量IFN-γ的生产由NK细胞，NKT细胞，和自适应淋巴细胞由流动的基本协议。另外，程序被描述为：（1）生长和用于接种制备的细菌，（2）测量在脾脏和肝脏，以及端点（3）测量动物存活的细菌负荷。还提供了有代表性的数据来说明这个感染模型如何可以用来测试特定剂对IFN-γ反应， 单增李斯特菌 ，并从该感染的小鼠的存活率的影响。
Introduction
IFN-γ是一种细胞因子是介导针对细胞内病原体的免疫力和用于控制肿瘤5生长至关重要。该细胞因子在细菌耐药性的重要性在于，与IFN-γ信号传导途径的突变是高度易感分枝杆菌和沙门氏菌6人类观察是显而易见的。同样地，小鼠的缺陷型中任一的IFN-γ或电阻的IFN-γ受体表现出缺陷分枝杆菌7-9和其他细胞内病原体包括单增李斯特菌 10,11， 硕大利什曼原虫 12， 鼠伤寒沙门氏菌 13，以及某些病毒11。除了杀灭病原体，IFN-γ在防止肿瘤14宿主防御了至关重要的作用。虽然较高的生产IFN-γ的是在感染或癌症的情况下是有利的，延长生产这种细胞因子的已链接吨Ø系统性自身免疫15-17的发展和类型的加速I型糖尿病中的非肥胖型糖尿病小鼠模型18。
IFN-γ的主要来源包括NK细胞，NKT细胞，γδT细胞，T辅助1（Th1细胞）细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的5,19,20。 IFN-γ的提高都通过先天和适应性免疫：（1）上调主要组织相容性复合体（MHC）I类和II表达，（2）提高的共刺激分子的抗原呈递细胞上的表达，（3）增强的巨噬细胞吞噬作用和促炎细胞因子和杀微生物因素（ 例如 ，一氧化氮和活性氧），（4）促进幼稚CD4 + T细胞分化成Th1细胞的效应细胞，（5）促进抗体类别转换到免疫球蛋白（ Ig）的图2a和IgG3（在小鼠），（6）诱导产生趋化因子的招募免疫细胞为i的位点nfection，和（7）增强NK细胞和CTL应答5,19。定在宿主响应于病原体和肿瘤的IFN-γ的关键重要性，重组IFN-γ已经过测试作为各种感染和恶性肿瘤（在19中综述）的处理。但是，因为IFN-γ或Th1细胞促进细胞因子白细胞介素-12（IL-12）的全身给药与副作用相关联，并且与剂量相关毒性19,21，存在开发替代策略，以增加IFN-γ的生产的兴趣免疫细胞。的新的生物制剂和小分子的发展需要在体内筛选工具来测试这种试剂是否免疫应答期间增加的IFN-γ的生产，这是否转换成有意义的生物效应，如在动物存活增加。
用革兰氏阳性菌李斯特菌的小鼠实验性感染一直器乐模型破译IFN-γ在宿主免疫对细胞内病原体1,22的作用。与病原体静脉内或腹膜内（IP）的小鼠的感染导致细菌的脾脏和肝脏，在那里他们成为驻地巨噬细胞和肝细胞中的脾3和天后4之间存在的峰细菌负载内化的快速传播感染1,3,22。 NK细胞的IFN-γ生产是巨噬细胞活化和抗病原菌3初期电阻重要;然而在高感染剂量，产生IFN-γ也可能是有害的病原体间隙23。 NKT细胞也可在脾脏和肝脏的IFN-γ的病原体2,24早期控制期间的源极和该生产已被证明是放大由其它细胞类型，包括NK细胞2 IFN-γ的生产。另一方面，后作用自适应T淋巴细胞，CD8 + T细胞在杂色丘拉尔，是调解病原体的清除和提供抗再感染1,4,22保护非常重要。
这种感染模型一直研究人员有许多原因（1综述）具有吸引力。首先，感染病原体是高度可再现的和诱导强Th1和细胞免疫应答。其次，亚致死感染期间，细菌负荷集中在其中可以容易地测量在肝和脾。第三，病原体可以安全地在生物安全等级2（BSL2）条件下处理。第四，有机物和免疫反应，它产生已经被广泛表征。最后，各种突变体和转基因品系已开发了可用于使用。
这里描述的是用于与L的EGD株C57BL / 6J小鼠的接种基本协议菌等 25和用于测量γ -干扰素重新由NK，NKT和自适应淋巴细胞感染后sponses。还描述了如何测量脾细菌负荷和肝脏亚致死感染后，用改性的LD 50剂量的病原体的感染后进行存活研究。最后，有代表性数据示的这个协议如何用于从李斯特菌感染筛选的新的治疗药物上的IFN-γ反应和小鼠存活率的影响。
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Protocol
安全声明
本协议描述与现场单增李斯特菌感染小鼠。病原菌是谁不免疫功能低下训练有素的人员BSL2条件下安全处理。免疫力低下的人群包括孕妇，老人和个人谁是艾滋病毒感染或有需要使用免疫抑制疗法治疗慢性疾病。在处理感染的样本的人员应穿上防护白大褂或礼服，手套，口罩和护目镜。这里所描述的工作是由大学健康网络发行（UHN）生物安全办公室的证书（＃32876）在BSL2条件下进行。从感染小鼠或任何未使用的组织尸被双重包装并在生物危险废物处置。从感染小鼠笼子也通过高压灭菌消毒。
道德守则
小鼠保持和在一个quara感染UHN动物设施内ntine室，并在按照加拿大议会关于动物饲养的指导方针进行了照顾。在老鼠身上所有的程序都在使用的动物协议＃3214被批准UHN动物保护委员会进行。由于伦理方面的考虑，死亡不作为生存研究的终点。这里报道的L.改性的LD 50剂量菌等的感染被确定为在其中50％的小鼠达到特定端点，其由在体重20％的损失，或示出的至少两个下列临床体征的剂量：嗜睡，皱皮，弯腰驼背的姿势，呼吸困难，钝痛或凹陷的眼睛。当他们到达通过暴露于二氧化碳（CO 2）根据UHN设施准则端点小鼠安乐死。
1.甘油股票的准备长期储存
注：此过程描述甘油的股票怎么样单增李斯特菌 EGD的应变从原始甘油制备的。具有产生气溶胶的电位步骤应一个认证生物安全柜（BSC）内进行。
- 制备脑心脏浸液（BHI）琼脂平板的细菌生长。对于这个加3.8％（重量/体积）BHI肉汤和1.5％（W / V）琼脂双蒸H 2 O（DDH 2 O的）。高压灭菌液体。一旦琼脂冷却至50℃，液体分配到细菌培养皿（25毫升/盘），并让干板（覆盖）在BSC 1小时。
注：BHI转移到琼脂高压灭菌后50℃水浴，以避免固化浇注板前。在4°C储存BHI板倒置（与顶尖媒体侧），直到准备使用。 - 准备BHI液体介质。对于这一点，混合3.8％（重量/体积）在DDH 2 O蒸压BHI肉汤。
- 从取下单增李斯特菌 EGD菌株的冷冻甘油股票-80℃冷冻r和解冻至室温。
- 浸在解冻甘油无菌枪头，并立即条纹尖端来回跨越BHI板的截面。这是主要的条纹。
- 由90℃下转动板，并使用新鲜的移液管尖，通过第一条纹拖动并将其传播到该板的下一个四分之一（这是次要条纹）。重复一次，使第三连胜。
- 转板倒置并在37℃孵育过夜。采用统一的殖民地，应在最后一组条纹可以得到16至24小时之间可见。
- 将10毫升无菌BHI肉汤的进入无菌通风50ml管中。使用无菌枪头板接单增李斯特菌的1个菌落，接种肉汤。孵育培养在37℃轨道振荡培养箱中过夜，或直到OD 600 = 1.0以每分钟（RPM）225旋转设置。
注：玻璃或一次性PLASTIC Erlenmeyer烧瓶也可用于培养细菌。不管使用容器的种类的，以确保它是无菌的，通风和文化的体积不超过容器的总体积的20％，以确保细菌的合适通气。 - 1的比例：通过在1无菌100％甘油隔夜细菌培养液混合，准备甘油股票。分发细菌/甘油混合物于2ml低温小瓶（500微升/瓶）和转让小瓶-80℃冷冻贮存。
注：珠的库存的方法，也可以代替甘油原液的存储菌使用。通过这种方法，多孔微珠接种李斯特菌的纯培养物，并储存在-80℃。每个珠子可以用作需要接种新的培养。更多信息请参见材料清单。
2. L.生长曲线的测定在单核细胞增生文化节 注意：此过程描述了如何生成用来估计菌落形成单位（CFU）感染研究单增李斯特菌的生长曲线。具有产生气溶胶的电位所有步骤应该认证BSC内进行。
- 取100微升在步骤1.7中产生至10ml BHI培养基过夜培养物在通风50ml管中，并在振荡培养箱（225rpm下，在45°角倾斜），在37℃生长。使用非接种管作为对照。
- 采取每隔一小时培养以0.5ml样品（1，2，3，4，5，6小时， 等等 ）。在塑料试管中的BHI培养基1（V / V）：稀释每个等分试样1。移液器上下混合。测量在使用分光计600纳米（OD 600）的光密度（OD）。继续培养细菌，直到OD 600 = 1。
- 在同一时间，取培养物的100微升样品，并在无菌1.5毫升MICR 900微升BHI培养基稀ocentrifuge管（这是10 -1稀释度）。离心细菌在6000×g离心5分钟，吸出上清液。
- 通过再悬浮在1ml BHI培养基的沉淀，以6000 xg离心离心5分钟，然后吸出上清液洗细菌两次。重悬在1ml BHI培养基沉淀。制备10倍稀释系列在这种样品中的BHI培养基（10 -2〜10 -9）的。传播各100μl稀释液到不同的BHI琼脂平板上。在培养箱中在37℃孵育板过夜。
- 第二天，挑选有30间板 - 殖民地300。放弃休息。指望这些板块的殖民地。 表1示出所拍摄时的OD 600 = 0.84在等分试样获得的计数的一个例子。在这个例子中，板中的一个（ 即，10 -6稀释度）有菌落计数30之间- 300和被用于CFU / ml的计算。
注：板材具有更大超过300菌落都没有用，因为拥挤可以阻碍细菌的生长，也使得难以辨别和列举单个菌落。与计数<30板也不能使用，因为在稀释技术或污染物的存在的小误差可以对计数的范围的下端的精度有很大影响。 - 由镀体积划分的菌落数，然后通过稀释因子以获得用于特定稀释CFU / ml的值相乘。在表1的例子中，在10 -6稀释度的计数为70除以该值0.1毫升得到的稀释培养物中的CFU / ml的值。然后，通过稀释因子（10 6）乘以此值，以获得未稀释的培养物（7.0×10 8）的CFU / ml的值。
- 绘制在小时的OD 600（y轴）对时间（X轴），以确定生长26的对数生长期。
注：此增长CURVE当生长到一定的OD读数提供了CFU / ml的白天培养的的估计。选择的OD 600读数是在生长对数期，可以用来作为生长天培养物的目标外径600。这些数据现在可以被用来估计的CFU中培养用于制备接种物（步骤3）。
3.接种的制备实验感染李斯特菌
注：此过程描述了从从过夜培养开始了一天的文化感染接种的准备（在步骤2中制备）。所有的这些步骤，除非另有说明在BSC中进行。
- 计算CFU基于小鼠和研究的实验设计的数感染所需的数量。添加BHI媒体的适当体积的无菌通风Erlenmeyer烧瓶或培养管中。
注：细菌P的CFUrepared将取决于进行试验的类型。感染期间研究NK和NKT细胞的反应，将每只小鼠中接种细菌的10 5 CFU（步骤6）。如果学习自适应T细胞应答对感染或测量细菌负荷，将每只小鼠中接种细菌的2×10 4 CFU（步骤8）。如果研究存活到端点，每只小鼠接种用的LD 50剂量的病原体的（这是10 5 CFU的男性和1.5×10 5 CFU的女性，见步骤9）。 - 接种含有BHI培养基用100μl过夜培养的管中。到达孵育文化于一37℃轨道振荡培养箱（225转），直到目标OD 600。转移培养内容到无菌离心管中。
- 离心机细菌进入5分钟的颗粒在6000 XG用离心机。吸用连接到在含漂白剂的陷阱烧瓶真空上清。
- 洗涤用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）沉淀两次，之间离心（在6000 xg离心5分钟）。
- 吸出第二次洗涤并在1×PBS中的适当的浓度，以提供所感兴趣的CFU每只小鼠在200μl的体积稀释的细菌。
注：最好使用无菌1X PBS的商业来源为洗细菌和准备接种，因为实验室玻璃器皿可以引入免疫污染物如脂多糖。
4. 单增李斯特菌的小鼠实验性感染
注：此过程描述如何感染小鼠在3程序以及如何验证在接种交付CFU准备接种。小鼠和注射处理在一个BSC进行。
- 订购足够数量的男性或女性C57BL / 6J小鼠为实验。此外，还可订购小鼠作为未感染的对照。
- 让老鼠适应环境之前的细菌接种1周。
注意：这是因为随着动物的运输带来的压力可以触发应激激素的生产和淋巴细胞27,28一过性升高。 - 上接种的当天，得到基线体重为每只小鼠，并将其在实验室笔记本记录。
- 在BSC，上下用无菌移液管，以确保细菌被均匀地分布并占用200微升接种到装有一个地下25针1毫升安全工程注射器混合的细菌悬浮液。
- 注入小鼠的ip用200μl制备的接种物（ 例如 ，10 5 CFU为NK细胞感染，步骤6）。对于此过程中，通过抓取周围的老鼠的肩膀皮肤松弛颈背用较少的惯用手的小鼠。确保该鼠标是公约束后，注入小鼠在腹部的下腹，只是侧向于midline避免膀胱。
- 在处置生物危害锐器容器中的针头和注射器。
- 直到所有的小鼠注射4.6 - 重复步骤4.3。进行类似的步骤用1×PBS注射的小鼠（非感染对照）。
注：由于CFU是基于成长曲线的估计，它也是很好的做法，检查实际CFU的接种。对于这一点，制备3 - 4不同制备的接种物（用10倍稀释系列）的稀释液，你希望将导致可数菌落。散布各100μl稀释剂到BHI琼脂平板孵育过夜，在37℃。算上殖民地，在步骤2中所述计算实际CFU /毫升。
5.准备热灭活李斯特菌的免疫学
注意：有可能产生气溶胶的BSC内执行的可能性的所有步骤。
- 一天长大，直到文化OD 600值重新达成的对数生长期内。免除文化融入的1.5 ml离心管中。
- 孵育在70℃管在水浴中1小时，以杀死细菌。
- 用1×PBS洗涤细菌两次如在步骤3.3和3.4。重悬在含胎牛血清（FCS）的无菌的完全RPMI培养基（见配方参考文件1）的4×10 6个 / ml的浓度。分装杀死的细菌分为2毫升无菌冻存管并储存在-80℃。
- 通过加入100μl热灭活的细菌制剂铺展到BHI琼脂平板上，在37℃下温育过夜确认细菌死亡。
注意：如果有在BHI琼脂板上生长的菌落任何这些热灭活的细菌应该是准备在步骤8.刺激淋巴细胞培养，重复热杀的过程。
6.感染过程中NK细胞和NKT细胞IFN-γ响应的测量
注：此过程描述了如何在感染的单增李斯特菌的10 CFU 5 24小时后测量小鼠NK和NKT细胞中的IFN-γ反应。该剂量被使用，因为它导致在脾脏24由NK细胞和NKT细胞健壮的IFN-γ应答。进行中的BSC的所有步骤。为了帮助维持细胞活力，保持细胞在冰上尽可能并用冰冷的缓冲区。
- 与10 CFU 5的单增李斯特菌在4步骤描述接种小鼠。同时，注入非感染的对照小鼠用等体积的1×PBS中的IP地址。
- 根据机构指南用CO安乐死在24小时后接种小鼠2吸入。
- 躺在其右侧各小鼠和湿向下使用挤压瓶70％的乙醇的皮肤。
- 使用无菌或无菌镊子和坚韧切剪，切割只是肋骨底部下方的皮肤。
- 喷洒下来暴露的肌肉层用70％的乙醇。脾应肌肉层（空心箭头在图1中）的下方可见。
- 使用无菌或无菌镊子和剪刀细，切开肌肉层，露出脾脏。轻轻地用抢镊子健脾用细剪刀从周围结缔组织切脾之遥。
- 放入装有无菌1X PBS一个15毫升的锥形管脾。
- 半填充无菌培养皿中，用无菌1X PBS。通过分离70微米尼龙细胞过滤脾为使用无菌3毫升注射器平端培养皿。
- 转移脾细胞悬浮液注入用10ml无菌血清吸管干净无菌的15毫升锥形管中。
- 离心样品在335×g离心在4℃下10分钟。
- 吸出上清液到含有漂白剂的陷阱烧瓶中。通过用手指轻弹管或通过拖动底部管松开细胞沉淀来回沿波纹表面（ 例如，空气流在BSC泄）。
- 裂解红血细胞中加入1.5氯化铵 - 钾（ACK）裂解缓冲液（见配方补充文件1）每个脾脏。恰好1分钟，并在15秒后，填充用1×PBS的管以停止细胞裂解。
- 离心细胞，在步骤6.10中所述。吸出上清液，重悬细胞沉淀在10ml荧光激活细胞分选（含有2％FCS的无菌1×PBS中）（FACS）缓冲液。
- 算使用血球细胞。对于这一点，取细胞悬浮液的两等份计数。添加15微升的每个细胞悬浮液的等体积的台盼蓝（0.04％，通过稀释在DDH 2 O的0.4％台盼蓝溶液。制造）。负载15微升的每个小区/台盼蓝的悬浮液的进血细胞计数仪的腔室（ 即 ，一个在顶室，一个在底室）。
- 使用显微镜，算上所有非蓝色细胞在每个腔室中的中央网格的五个大型方（ 图2）。借此计数和除以10它以获得10 6个 / ml的细胞数。在图2的例子中，计数为215的细胞在5平方;因此，细胞浓度为21.5×10 6 / ml的。平均从两个样品中得到的细胞浓度。
- 种子1×10 6个细胞每孔/污渍在96孔圆底板流式细胞术染色。确保还种子细胞未染色和荧光减一（FMO）控制。 见表2流式细胞仪染色小组建议流程。
注：对于以下步骤，建议保持在冰上或在4℃下细胞和保护细胞免受光用箔时的荧光染料存在。多道移液器可用于分配液体到96孔染色板，以加快处理速度。要小心，不要打扰细胞沉淀时，抽吸从离心板上清液。染色也可以在FACS管做，如果离心机没有安装板适配器。从这点上的所有离心机步骤在456 xg离心完成在4℃5分钟。 - 离心盘，然后用FACS缓冲液洗涤细胞两次。一个洗涤是通过添加200μl的FACS缓冲液中向每个孔，离心平板，然后吸出上清液进行。
- 通过加入50μl/孔的含有抗小鼠CD16 / CD32（纯化的Fc块）（0.5微克）的FACS缓冲液进行封闭步骤。孵育细胞在4℃下进行15分钟。如上所述在1×PBS中洗涤细胞一次。
- 100μl的活力染料（可定影存活率染料稀释1：在1×PBS中1000）添加到细胞中。染色的细胞在30分钟4℃在黑暗中（在冰箱中）。如上所述在FACS缓冲液洗涤细胞两次。
- 第二次洗涤后，加入细胞表面的抗体100微升或四到各自的井根据：Ó染色面板表2中描述。染色的细胞在30分钟4℃在黑暗中（在冰箱中）。此时，还可以添加抗染色单阳性和FMO对照。
注：关于单阳性对照，它是建议被染色与染色与在面板中使用的抗体的CD4抗体或商业补偿珠粒的各个荧光版本或者使用脾细胞。此前进行这种染色过程中，所有的FACS抗体应该在试验研究滴定以确定染色最佳浓度。 - 如上所述在FACS缓冲液洗涤细胞两次，然后用在50微升4％多聚甲醛（16％多聚甲醛的库存中DDH 2 O的稀释）的重悬浮他们并孵育在室温下10分钟固定细胞。 注意：多聚甲醛是有毒的，只应在通风柜处理。
- 洗涤细胞两次，我ÑFACS缓冲液，离心在两者之间。在重悬流式细胞仪缓冲细胞。继续下一步或存储细胞避光长达三天冰箱。
- 离心细胞，去除上清，并用150微升1×透/洗涤缓冲液（彼尔姆/洗涤缓冲液）洗细胞两次，之间离心英寸9（V / V）在DDH 2 O：彼尔姆/洗涤缓冲液中从10倍的库存稀释1制备
- 第二次洗涤后，重悬细胞中加入150μl彼尔姆/洗涤缓冲液，并在黑暗中在4℃孵育15分钟。
- 离心细胞再次然后吸出上清液。悬浮细胞在50μl1×彼尔姆/洗涤缓冲液中含有抗IFN-γ和在黑暗中在4℃孵育1小时。
- 洗涤细胞两次烫发1X /洗涤液，离心之间英寸重悬在250μl的FACS缓冲液中的细胞，然后细胞转移到FACS管。
- 继续使用流动cytomet到流式细胞仪采集呃具有一个适当的激光的配置和过滤器组以鉴别在表2中29所描述的染色面板中使用的荧光染料。收集每个样品至少有20万事件和补偿控制10,000个事件。
- 应用补偿矩阵和分析利用流式细胞仪分析软件30的数据。
在山顶感染时的脾脏和肝脏的细菌负荷的7.测量
注：所有步骤，除非另有说明在BSC内做出。
- 接种的小鼠用2×10 4 CFU使用在步骤4中描述的程序病原体的IP地址。
- 第3天感染后，制备无菌的1.5 ml微量离心管，在1×PBS中各自含有500微升冰冷的无菌0.1％的Triton X-100和0.2 - 0.3克1.5 - 2毫米酸洗无菌玻璃珠。称量每个管。
注：玻璃珠通过酸洗净INCU殴打，在10％乙酸中的烧杯中在磁力搅拌器上搅拌1小时。这些珠粒然后广泛地与DDH 2 O的洗涤以除去酸，空气干燥，然后在使用前高压灭菌。 - 安乐死的CO 2曝光老鼠。
- 对于器官解剖，躺在其解剖板背面的动物和针鼠标的四肢使用地下25针板上。通过用70％乙醇润湿消毒皮肤。
- 使用无菌韧切剪刀，使从腹股沟皮肤中线切口中期胸部，然后从中间腹股沟朝向各膝和从朝各个弯头中期胸部。钝解剖和反射回来的皮肤，它寄托打开使用地下25针。
- 通过用70％乙醇润湿，然后使用无菌细剪刀使在腹腔壁中的中线切口消毒肌肉层。抓住用钳子剑突。然后，用同样的细剪刀，使从剑突PROCE在腹腔壁切口SS横向每侧，继肋骨，只是膈下以显示肝脏。
- 切出的约100毫克片肝脏（用于所有小鼠同叶）使用无菌剪刀，并将其放置在预称重的1.5 ml离心管中。
- 使用镊子轻轻拨开器官腹腔左侧以可视化的脾脏。轻轻抓住一双镊子的脾切除所述周围结缔组织从腹腔释放。
- 放置在含有小珠的预称重的1.5 ml离心管脾脏。运输组织至实验室在防漏含有容器冰。重新权衡含机关确定毫克组织重量管。
- 通过使用珠磨机均化器在30赫兹的频率3分钟振摇管子均匀化的组织。
注：珠磨机方法是优选的均化，因为它是适合用于PROCES唱了大量样品和产生更少的混乱和潜在的感染病菌。然而，自动均质或蒸压2毫升手册玻璃组织匀浆器可以作为一种选择。 - 制备10倍稀释系列在1×PBS中的0.1％的Triton-X-100的匀浆，从（从未经稀释到10 -7）。
- 蔓延100微升每种稀释匀浆上使用无菌吊具在BHI琼脂平板（一式两份）。传热板到37℃培养箱孵育过夜。
- 记住，30和300菌落/板之间包含板，弃去休息。指望每块板的殖民地，并确定菌落重复利差的平均数。
- 计算根据下列等式的CFU /毫克：
CFU /毫克= CFU / ml，在匀浆，乘以毫升制备匀浆，通过匀化的组织的毫克重量除以。
注意：例如，如果一个30栏的平均onies被镀100μl的从120毫克片肝脏被在0.5ml匀浆制备的10 -2稀释匀浆，计算将如下后计算：
CFU /毫升= 30殖民地×100（稀释倍数）/ 0.1毫升（体积价差）= 30,000 CFU /毫升。
CFU /毫克= 30,000 CFU /毫升×0.5毫升匀浆/ 120 mg组织= 125 CFU /毫克。
8. CD4 +和CD8的IFN-γ反应李斯特菌的影响+细胞
注：此步骤介绍如何测量脾脏CD4 +和CD8 + T效应细胞产生IFN-γ在使用这两种方法的适应性免疫应答（〜7天感染后）的峰值的时间收获：（1）流动仪测量由CD4 +和CD8 +细胞通过细胞内细胞因子染色的IFN-γ，和（2）的ELISA测定由脾细胞（包括所有T细胞）中产生的总的IFN-γ水平。程序都在BSC内做出。
- 通过用2×10 4 CFU使用在步骤4中描述的程序病原体的注入的ip感染的小鼠。
- 第7天感染后，根据机构指南用CO安乐死的小鼠2吸入。
- 剖析在含有无菌1×PBS中的15毫升锥形管脾（如上所述）和地点。输送管到实验室中防漏含有容器冰。
- 处理脾脏成单细胞悬浮液，如在第6条所述裂解红血细胞，然后重悬细胞在含有10％FCS的完全RPMI培养基。算使用血球细胞。
- 建立培养物的IFN-γ反应的测量。对于这种分配细胞（4×10 1 6毫升/孔）到一起24孔板和相等数目（4×10 6或1毫升/孔）解冻热灭活李斯特菌的（在步骤5制备的） 。细胞转移到37°C培养箱。
- 培养20小时后，加入0.66微升/ ml蛋白质转运抑制剂对井和继续孵化。
- 四小时后，转印板到BSC和收集500微升培养物上清液和冷冻（在-80℃）下使用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒31的IFN-γ水平的后面测量。然后收集细胞进入无菌的15毫升管。用1X PBS洗井和收集到的细胞一起池本洗。
- 如除了使用表3中记载的染色面板在过程6中所述进行细胞表面染色和细胞内染色对CD4 +和CD8 +细胞的IFN-γ。继续流式细胞仪采集（采集20万事件/采样），并用流式细胞仪分析软件30分析数据29。
9.测量老鼠存活到端点李斯特菌 Infec后化
注：此过程介绍了药物对小鼠存活到端点与修改后的LD 50剂量病原体的效果后感染。所有这些过程都在动物设施的BSC进行。
- 注射的小鼠与改性的LD 50剂量李斯特菌的IP作为在步骤4中所述将其确定为10 5 CFU（男性）或1.5×10 5 CFU（对于女性）31。
- 每日临床症状两次跟随老鼠并记录这些迹象和动物体重在实验室笔记本。安乐死的小鼠，如果他们表现出体重或李氏杆菌两种临床症状有20％的损失（嗜睡，皱皮，弯腰驼背的姿势，呼吸困难，钝痛或凹陷的眼睛）。
- 14天后，通过安乐死的 CO 2吸入存活的小鼠。
- 通过绘制每组的存活百分数对时间32准备数据的卡普兰-迈耶曲线。
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Representative Results
图3显示在24小时后的感染细胞计数的IFN-γ染色一些典型流脾NK和NKT细胞与病原体的10 5 CFU。该图还示出了表2中记载的染色面板的选通策略。 图4示出在一个实验中，其中雄性小鼠用PPARα拮抗剂IS001或媒介物对照处理得到的一些有代表性的数据，感染10 5 CFU 单增李斯特菌，然后24小时后分析在NK和NKT细胞的IFN-γ 。该图表明，与IS001治疗升压感染病原体后通过NKT细胞的IFN-γ反应，但不NK细胞。 图5显示了在第7天感染后在脾脏CD4 +和CD8 + T细胞的IFN-γ代表染色重新刺激体外用热灭活巴后thogen。该图还示出了在表3中描述的染色面板的选通策略。 图6示出在一个实验中，其中雄性小鼠用PPARα拮抗剂IS001或溶媒对照每日处理得到的是，感染李斯特菌的亚致死剂量，并分析在第7天感染后的代表性数据。该实验表明，与IS001治疗增强由两个CD4 +和CD8 +淋巴细胞的IFN-γ应答。 图7示出了从该调查了PPARα拮抗剂IS001的效果对小鼠存活到端点感染与改性的LD 50剂量的病原体的后一个研究的代表性数据。绘图是小鼠的存活百分数对时间感染后。该图表明，与IS001处理提高雄性小鼠到端点的生存。这些数据共同说明此模型如何可以应用于调查的新的药物或治疗对体内和IFN-γ反应的效果来探讨这些免疫变化如何从感染影响动物的存活。
图1.感染小鼠解剖脾脏。这一系列的照片显示了如何从一只死老鼠解剖脾脏。 （一）的Lie在其右侧的鼠标和喷向下用70％乙醇的皮肤。 （b）用无菌或无菌镊子和坚韧切剪，切割只是肋骨底部下方的皮肤。 （三）喷雾向下用70％乙醇的露出肌肉层。脾应是肌肉层（开放箭头）下方可见。 （d）利用无菌或无菌镊子和细剪刀，切开肌肉层以显示脾脏。 （五）轻轻抓住用钳子和u脾SE精剪从周围结缔组织切脾之遥。 （六）将脾含有无菌1X PBS一个15毫升的锥形管。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.使用血球计数脾细胞。 （a）表示血细胞计数仪的中心格。 （b）示出，它包含25大方格（每个包含16个小方格）中央网格的放大图。用于计数的五大广场突出显示为灰色（4角正方形加上中央网格中心广场）。 （c）示出了大灰色正方形中的一个的放大图。以确定在10 6个 / ml时，第一计数细胞体积五大灰色方块内的所有活细胞。在所示的例子，这种计数215计数时，请务必只算全部清除（非蓝色）的细胞，包括那些在谈到网格的右侧和底部的双线条。不指望触摸网格上的左侧和顶部的双行细胞。取总共五个正方形计数和除以10它以获得10 6个 / ml的细胞数。在这个例子中，215除以10 21.5×10 6个细胞/ ml。请注意，这些计算仅当计数的大广场的5所强调和工作冲淡你的细胞1：1台盼蓝。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.门控策略IFN-γ的检测γ在NK和NKT细胞生产。由SSC-A地块上的FSC-A淋巴细胞第一门。然后在那些在对角线上的FSC-H / FSC-A地块事件大门。这些是单峰。然后在现场（AmCyan - ）门和CD8 -细胞。然后暗算TCRβ的四聚体染色。该NKT细胞是双阳性的人群中和NK细胞是双重否定人群中。门上的双阳性细胞，情节NKP46与FSC。在NKP46人口负，这是NKT细胞门（此门可以通过查找分割点从NK细胞情节两组人群进行设置）。 NK细胞是四聚体- TCRβ - NKP46 +群体。内NK和NKT细胞的门，所述IFN-γ+细胞在PE通道都设置基于所述FMO控制栅极后鉴定。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.代表性数据获得对IFN-γ+ NK和NKT细胞的频率在24小时后感染。在本实验中，雄性C57BL / 6J小鼠（N = 3 - 4 /组）感染的ip 10 5 L的CFU 菌或被留下未感染。小鼠还施用在接种12小时后的同一时间的药物IS001或载体（0.5％羧甲基纤维素）。接种后二十四小时，将小鼠安乐死，脾脏取出并单独处理和染色流式细胞仪。示为平均值±IFN-γ+细胞中的NK细胞的SEM频率（a）或NKT细胞的栅极（b）与一个车辆或药物IS001治疗后未感染或感染的小鼠。 *表明SA差异（P <0.05），车辆控制双尾T检验。从31个数据重新打印从免疫学杂志 （卷195，第5189-5202，2015年）的权限。版权所有2015年免疫学家的美国协会，公司请点击此处查看该图的放大版本。
图5.浇注战略的CD4和CD8细胞产生IFN-γ的检测。由SSC-A地块上的FSC-A淋巴细胞第一门。然后在那些在对角线上的FSC-H / FSC-A地块事件大门。这些是单峰。在这个门，活（AmCyan - ）CD45门+细胞。然后在任CD8 +或CD4 +群体门。在每个门中，IFN-γ+细胞中的PE通道被染色比较鱼类统营处控制标识。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.代表性的数据为获得IFN-γ+ CD4 +和CD8 + T细胞的频率在后7天感染李斯特菌 （EGD株）。在本实验中，雄性C57BL / 6J小鼠进行感染的ip用2×10 4 CFU 李斯特菌 （N = 7 /组），或被留下未感染的（N = 3只/组）。小鼠还施用药物IS001或载体（0.5％羧甲基纤维素），每天两次出发上接种的当天。七天后，将小鼠安乐死，脾脏取出并单独地对加工细胞培养。脾细胞单核细胞刺激24小时用热灭活李斯特菌与蛋白质运输为培养的最后4小时抑制剂加入。然后将细胞染色流式细胞仪。示为平均值±IFN-γ+细胞中的CD4 +（a）或在未感染或感染的小鼠的 CD8 +细胞门（b）用载体（0.5％羧甲基纤维素）治疗后或药物IS001的SEM频率。 *表示脱离由双尾T检验确定的车辆控制对应一个差异（P <0.05）。从31个数据重新打印从免疫学杂志 （卷195，第5189-5202，2015）.Copyright 2015年免疫学家的美国协会的许可，公司请点击此处查看该图的放大版本。
相比一个PPARα拮抗剂1S001对小鼠存活到端点的效果与单增李斯特菌雄性C57BL / 6J小鼠（EGD株）感染后在实验中图7.代表性的数据获得。在本实验中，雄性C57BL / 6J小鼠（N = 10只小鼠/组）感染的ip与单增李斯特菌的改性的LD 50剂量的病原体（10 5 CFU）。小鼠还施用药物IS001或载体（0.5％羧甲基纤维素），每天两次出发上接种的当天。小鼠的临床体征每天其次，如果人性化的端点得到满足被实施安乐死。示出的是小鼠的存活百分比随时间*端点指示组之间存活的差异如通过对数秩检验（P <0.05）来确定。从31个数据重新打印从杂志O权限˚F免疫学（195卷，第5189-5202，2015）。版权所有2015年免疫学家的美国协会，公司请点击此处查看该图的放大版本。
表1：显示于天培养物的等分试样测定CFU某些代表性计算。在这个例子中，天培养物的等分试样取出并稀释1:1 BHI介质。此稀释的样品的OD 600测定为0.84。此外，将100μl等分试样用于CFU测定。此样品用BHI培养基的900微升（10 -1）稀释，并用水洗涤，再悬浮在1ml BHI。有10倍稀释系列该样品的制备（10 -2〜10-9）和稀释的样品接种在BHI阿加R牌（仅用于10 -4〜10 -9值示出）。第二天计数菌落。只有那些在30-300之间有菌落数板考虑计算（ 即 10 -6板，以黄色突出显示）。菌落在此板（70）的数量，然后通过0.1（以毫升体积镀）分频以得到CFU / ml的稀释样品的。此值然后通过稀释因子（10 6），得到未稀释培养的CFU / ml的读数相乘。 TMTC =不计其数。
表2：染色小组的IFN-γ检测 NK细胞中和NKT细胞。注意，与在面板或与CD4抗体克隆GK1.1各种荧光版本染色的脾细胞中使用的流的抗体染色或补偿珠可以用作单一阳性对照。
表3：染色小组的IFN-γ检测 中CD4 + 和CD8 + 细胞。注意，与在面板或与CD4抗体克隆GK1.1各种荧光版本染色的脾细胞中使用的流的抗体染色或补偿珠可以用作单一阳性对照。
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Discussion
这里我们介绍与L的EGD株雄性或雌性C57BL / 6J小鼠25 单核细胞增生如何进行基本的实验性感染的协议。该协议被建立用于研究体内 31上的IFN-γ的生产的新的小分子IS001的由先天性和适应性淋巴细胞的影响的目的。通过监测细菌清除和生存感染后，被见解将获得的这些变化中的IFN-γ如何影响主机的控制感染的能力。
议定书中考虑的关键因素
在这种类型的研究设计中的一个重要的考虑因素是，每个实验进行充分供电，并且适当地控制。由于在对感染的免疫应答的生物变化（ 见图4和6），则建议N = 4 - 5每组小鼠应用于初始免疫研究。如果一个压脚提升这些研究中有数据的趋势，但没有显著差异组之间明显看出，功率计算可以做，以确定在随后的研究，以达到统计学意义所需动物数量最少。关于控制，它包括未感染的对照测定的免疫研究和车辆控制，以帮助区分与施用治疗相关的应力的处理的效果基线IFN-γ的应答是重要的。另一个重要的考虑是治疗的时机。因为对李斯特菌的先天性应答是非常迅速的，则建议第一处理可以在之前或同时为，接种，以确保试剂的治疗性级别之前获得的每天给药先天免疫反应的启动。
又一重要的考虑是病原体的剂量用于infectioñ。亚致死剂量被推荐用于细菌负载的测量，因为它增加了病原体将脾脏和肝脏内进行浓缩，允许细菌的更准确的枚举的机会。亚致死剂量也被推荐用于枚举自适应淋巴细胞IFN-γ的反应，确保动物不峰值T细胞扩增的时间之前屈服于李斯特菌病。相反，建议更高感染剂量，以便通过这些细胞以最大化IFN-γ的生产中使用的早期NK和NKT细胞的反应的测定在24小时。
经典的LD 50是病原体的剂量，其导致50％小鼠致死。既然死亡是不是在我们的机构可接受的端点以来李斯特菌病的许多症状可以预测动物是否有可能屈从于感染，我们用一个定义的临床症状列表，而不是死在我们的研究中的端点。 USI纳克该方法中，经测定，改性的LD 50为10 5 CFU对8周龄的雄性和1.5×10 5 CFU 8周龄雌性C57BL / 6J小鼠31。这些LD 50剂量通过测定小鼠的存活百分比为端点的逐步剂量递增研究（N =共5项研究），每包含每组N = 8只小鼠来确定（ 例如 ，小鼠第10000 CFU感染，然后第二批20000 CFU 等 ）。 userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit：对LD 50计算从日志的回归曲线（CFU）（x轴）相对于存活百分比值（y轴）（网站的概率单位确定/ProbitAnalysis.pdf）。
需要注意的是在我们的实验室确定修改后的LD 50剂量可从与单增李斯特菌一脉相承感染小鼠，即使在不同的另一个实验室。这种变化的部分原因可能涉及到主观性质Ø˚F比死亡更绝对终点监测李斯特菌病的临床症状。额外的可变性导致如小鼠的饮食或微生物或实验室之间的制剂接种的差异，环境因素的差异。因此，建议在进行任何存活研究之前，如在此使用来执行的试验性研究，其中雌性小鼠（N = 8只小鼠/组）感染李斯特菌的相同菌株的1.5×10 5 CFU研究和监控的症状，以确定是否该剂量确实导致50％的存活率到端点。如果生存是在此CFU低于或高于50％，逐步增加剂量或剂量降级研究可以进行迅速缩小的LD 50剂量。
另一个重要的考虑是用于感染研究小鼠株或亚株。本协议描述的是常用的近交系小鼠C57BL / 6J的感染。这个菌株是非常适合的IFN-γ反应的测量，因为该小鼠被认为是一个Th1细胞容易发生应变33和作为其结果，是为L.相对耐菌等感染（相比Th2细胞倾向小鼠品系如BALB / C）34,35。适应此协议其它小鼠品系将所需要的病原体的特定菌株的感染剂量的知识。此外，还建议使用相同的年龄，性别的小鼠和厂商为为了减少参与建立模型故障排除的数量在本协议中所述。例如，C57BL / 6小鼠，从一个供应商（ 例如 ，C57BL / 6J）有序可以呈现出比其他供应商（ 例如 ，C57BL / 6NTac）36下令C67BL / 6小鼠的遗传差异。此外，肠道菌群的C57BL之间不同来自不同供应商，其可以影响Th1和Th17细胞的反应的平衡在小鼠37获得/ 6 substrains。
ove_title“>潜在的修改对技小鼠是最常用接种的ip或静脉内，而不是感染的人类的天然途径，它是通过胃肠道。口腔感染是不太常见，因为李斯特菌的标准菌株感染效率低下小鼠38的肠上皮。这是因为从人的E-cadherin的是由李斯特菌侵袭蛋白导致识别E-cadherin的损失鼠E-cadherin的序列中的单个氨基酸的变化，内化A（INIA）39。为了克服这一障碍，研究人员使用的是转基因对人类E-cadherin蛋白或使用已设计，以表达结合鼠标E-cadherin的具有相同的亲和力作为WT EGD对老龄问题研究所（INIA MUT）的突变序列李斯特菌的小鼠人E-cadherin的40。因此，该技术的一个潜在修饰是通过口服途径感染的小鼠。读者被称为描述口服接种方法38另一个朱庇特的出版物。注意，改变感染的方式将影响感染剂量以及病原体传播的动力学。
这个协议描述了使用热灭活李氏杆菌引发的CD4 +和CD8 + T细胞的IFN-γ的产生。热灭活李斯特菌被选为在我们的研究中的刺激，因为该抗原是便宜且因为我们的实验室在CD4 + T细胞应答的病原体主要感兴趣。一个限制是，热灭活的细菌不有效地在体外 41 或体内 42,43感染素的 CD8 + T细胞应答。因此，我们通过在感染的高峰收获脾细胞中观察到的CD8 + T细胞产生IFN-γ（ 即 ， 图6）可能是响应于残余存在于脾细胞培养物或已引起细胞因子诱导的细胞因子的结果活细菌释放41。作为替代热灭活李斯特菌，人们也可以引起的IFN-γ应答的离体 T细胞暴露于编码在李斯特菌的蛋白质的表位的肽。事实上，免疫MHC II类限制为李斯特O与P60水解酶的表位，并已为C57BL / 6和BALB / C小鼠和免疫MHC I类表位已经被用于只BALB / c 44描述了说明。另一种方法是对感染的小鼠与已经工程化以表达模型抗原如卵清蛋白或病毒抗原，以便采取现有类MHC I和II类MHC四聚体试剂来枚举抗原特异性的优点李斯特菌的菌株T细胞在感染小鼠45,46。
议定书的其他限制
这种模式的另一个限制是它Ò唯一一句措施IFN-γ的生产通过在脾脏免疫细胞。除了使用四聚体的枚举抗原特异性T细胞（的卵清蛋白表达李斯特菌的变体），流式细胞术这里描述染色面板可以很容易地修改，以测量其它细胞因子如TNF或IL-2或参与的CD8 T细胞或病原体的NK介导的杀伤，例如穿孔或粒酶B.在加入效应分子，该协议也可适于检查由在肝免疫细胞产生的IFN-γ。
未来应用
一旦该协议被掌握，它可以作为在体内模型的简单筛选对Th1和细胞免疫各种试剂或基因的影响。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaldehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH2O or 1x PBS |
| 10x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 1x in ddH2O |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1,000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Use one drop per stain |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 ml vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL/6J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 weeks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH2O, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0 - 300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnostics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
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