Bestimmung des Zetapotentials über Nanoparticle Translokation Geschwindigkeiten durch eine Tunable Nanopore: Die Verwendung von DNA-modifizierten Partikel als Beispiel

Zusammenfassung

Hier verwenden wir ein Polyurethan abstimmbaren Nanopore in eine resistive Pulserfassungstechnik integriert Nanoteilchen Oberflächenchemie über die Messung der Partikelgeschwindigkeiten Translokation zu charakterisieren, die verwendet werden können, das Zeta-Potential der einzelnen Nanopartikel zu bestimmen.

Zusammenfassung

Nanopore Technologien, die zusammen als Resistive Pulssensoren (RPS) bekannt ist, werden verwendet, um Proteine, Moleküle und Nanopartikel zu erkennen, zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tunable resistive Pulserkennung (TRPS) ist eine relativ neue Anpassung an RPS, die einen abstimmbaren Poren enthält, die in Echtzeit verändert werden kann. Hier wir TRPS verwenden , um die Translokation Zeiten von DNA-modifizierten Nanopartikel zu überwachen , da sie die abstimmbaren Porenmembran als Funktion der DNA - Konzentration und Struktur (dh einzelsträngig zu doppelsträngiger DNA) durchqueren.

TRPS basiert auf zwei Ag / AgCl Elektroden durch eine elastomere Porenmembran getrennt, die eine stabile Ionenstrom auf ein angelegtes elektrisches Feld aufbaut. Im Gegensatz zu verschiedenen optisch-basierten Partikelcharakterisierung Technologien können TRPS charakterisieren einzelnen Partikel unter einer Probenpopulation, so dass für multimodale Proben mit Leichtigkeit analysiert werden. Hier zeigen wir, Zetapotentialmessungenüber Partikel Translokation Geschwindigkeiten von bekannten Standards und wenden diese Analyten Translokation mal abzutasten, wodurch sich das Zetapotential dieser Analyten zu messen.

Sowie Mittel zeta Potentialwerte Erfassen werden die Proben alle unter Verwendung eines Partikel-by-Teilchen Perspektive zeigen weitere Informationen auf einer gegebenen Probe durch die Probenpopulation Verteilungen, zum Beispiel. Von solchen, zeigt dieses Verfahren Potential in Sensoranwendungen für beide medizinischen und ökologischen Bereich.

Einleitung

Funktionalisierte Nanopartikel werden immer beliebter als Biosensoren sowohl in medizinischen und ökologischen Bereich. Die Fähigkeit , eine Nanopartikel der Oberflächenchemie, die mit DNA, beispielsweise zu verändern, erweist sich nützlich für die gezielte Arzneimittelverabreichungssysteme ¹ und Überwachung DNA-Protein - Wechselwirkungen ^2-4. Eine zunehmend verbreitete Nanopartikel Eigenschaft wird in Biotests verwendet und bei der Bereitstellung von Therapeutika ist Superpara ^5. Superparamagnetische Partikel (SPPS) sind äußerst nützlich bei der Identifizierung und spezifischen Analyten aus komplexen Mischungen zu entfernen und kann so mit der einfachen Verwendung eines einzigen Magneten tun. Einmal entfernt, kann der Analyt-gebundenen Teilchen charakterisiert und analysiert werden, für den Zweck geeignet.

Frühere Verfahren verwendet zum Nachweis und zur Charakterisierung von Nanoteilchen umfassen optische Techniken, wie beispielsweise dynamische Lichtstreuung (DLS), die auch als Photonenkorrelationsspektroskopie bekannt. Obwohl ein hallogh Durchsatz Technik wird DLS beschränkt zu sein , eine Mittelungs basierte Technik und bei der Analyse von multimodalen Proben ohne die Zugabe von Spezialsoftware, die größeren Teilchen eine viel dominanter Signal, produzieren einige der kleineren Teilchen völlig unbemerkt ^6,7 zu verlassen. Particle-by-Teilchen sind Charakterisierungstechniken daher wesentlich günstiger Nanopartikel und funktionalisierte Nanopartikel-Systeme zu analysieren.

RPS basierten Technologien basieren auf ein elektrisches Feld an eine Probe Aufbringen und Überwachen des Transportmechanismus der Partikel durch einen synthetischen oder biologischen Nanopore. Eine relativ neue Nanopartikel - Detektion und Charakterisierung Technik basiert auf RPS ist abstimmbaren Widerstandspulserkennung (TRPS) ^16.08. TRPS ist ein Zwei-Elektrodensystem durch ein elastomeres, abstimmbaren Porenmembran getrennt. Abstimmbarer Poren Verfahren ermöglicht Analyten aus einer Reihe von Form ¹⁷ und eine Größe über ihre trans zu messPort-Mechanismen durch die Pore. Abstimmbaren Poren wurden zuvor für die Detektion von kleinen Partikeln (70-95 nm Durchmesser) Herstellung vergleichbare Ergebnisse zu anderen Techniken , wie beispielsweise Transmissionselektronenspektroskopie (TEM) ¹⁰ verwendet. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wird ein Ionenstrom beobachtet und als Partikel / Moleküle durch die Poren passieren, sie vorübergehend die Poren blockieren, eine Verringerung der Strom zu verursachen, die als "Blockade Ereignis" definiert werden kann. Jede Blockade Ereignis ist repräsentativ für ein einzelnes Teilchen , so dass jedes Teilchen in einer Probe einzeln auf der Blockade Größe basierend charakterisiert werden kann, Δ Halb Maximum und voller Breite, FWHM, sowie andere Blockade Eigenschaften. Analysieren von einzelnen Teilchen, wie sie durch eine Nanopore passieren ist vorteilhaft für die multimodale Proben als TRPS erfolgreich und effektiv eine Reihe unterscheiden von Partikelgrößen amongst eine einzelne Probe. Tunable resistive Pulserfassungs vervollständigt Größe ^10, Zetapotential ^12,18 und Konzentration ¹⁵ Messungen gleichzeitig in einem einzigen Durchlauf und kann daher noch unterscheiden Proben ähnlich, wenn nicht die gleiche Größe durch ihre Oberflächenladung ^19; ein Vorteil gegenüber alternativen Sizing-Techniken.

Zeta - Potential ist als das elektrostatische Potential an der Scherebene ²⁰ definiert ist , und wird aus Partikelgeschwindigkeiten berechnet , da sie eine Pore ¹⁹ durchqueren. Zeta-Potential-Messungen einzelner Partikel gibt damit einen Einblick in die Translokation Mechanismen und das Verhalten der Nanopartikel-Systemen in Lösung, wertvolle Informationen für die Zukunft von Nanopartikel-Assay-Designs für eine Vielzahl von Anwendungen. Particle-by-Partikelanalyse solcher Art, ermöglicht auch die Verbreitung und Verteilung von Zetapotentialwerte unter einer Stichprobe untersucht werden, um weitere Informationen erlauben on Reaktionskinetik (einzelsträngig zu doppelsträngiger DNA, zum Beispiel) und Partikelstabilitäten in Lösung erreicht werden.

Hier beschreiben wir eine Technik, und charakterisiert Oberflächen sowohl unmodifizierte und DNA-modifizierten SPP erkennt. Das beschriebene Protokoll ist hier anwendbar auf eine Reihe von anorganischen und biologischen Nanopartikel, aber wir demonstrieren das Verfahren DNA-modifizierten Oberflächen aufgrund ihrer breiten Palette von Anwendungen. Die Technik ermöglicht es dem Benutzer, zwischen einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Ziele auf einer Nanopartikeloberfläche zu unterscheiden, basierend auf Partikel Translokation Geschwindigkeiten durch ein Porensystem und somit deren Zeta-Potentiale.

Protokoll

1. Herstellung der Phosphat-gepufferte Saline mit Tween-20 (PBST) Puffer

1. Auflösen einer Tablette PBS (0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid, 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,4) in 200 ml deionisiertem Wasser (18,2 M & OHgr; cm).
2. Füge 100 & mgr; l (0,05 (v / v)%) Tween-20 in die 200 ml Pufferlösung als Tensid.

2. Vorbereitung Carboxylende Polystyrolteilchengröße Standards

1. Vortexen die Kalibrierungspartikeln für 30 sec vor der Beschallung für 2 min bei 80 Watt Monodispersität der Teilchen zu erzeugen.
2. Verdünnen Sie die Kalibrierung Partikel 1 in 100 bis zu einer Konzentration von 1x10 ¹⁰ Teilchen / ml in PBST - Puffer und Vortex für 30 Sekunden.

3. Vorbereitung Streptavidin beschichtete Teilchen

1. Vortexen die Partikel für 30 sec vor der Beschallung für 2 min bei 80 Watt Monodispersität zu gewährleisten.
2. Verdünnen Sie die Streptavidin-beschichteten Teilchen 1 in 100 in PBST Puffer achieve eine resultierende Konzentration von 1x10 ⁹ Teilchen / ml und Vortex für 30 Sekunden.
   Hinweis: Ein typisches Probenvolumen 200 ul ist. Wenn beispielsweise die Untersuchung von fünf DNA-Konzentrationen vorzubereiten 1 ml verdünntes Streptavidin beschichteten Teilchen.

4. Herstellung von Oligonucleotiden

1. Rekonstituieren Oligonukleotiden mit deionisiertem Wasser bis zu einer resultierenden Konzentration von 100 uM.

5. Die Zugabe von Fänger-Sonde (CP) DNA an die Streptavidin beschichtete Teilchen

1. Vor der DNA-Bindung, vortex die Streptavidin-beschichteten Teilchen (200 & mgr; l Probenvolumen) für 30 sec mit einem 80 Watt Beschallung 2 min gefolgt.
2. Auf der Basis der Bindungskapazität des Lieferanten (4.352 pmol / mg) versehen ist, fügt die entsprechende Konzentration an DNA auf die Teilchen zur resultierenden Konzentrationen von 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 und 210 nM DNA.
3. Vortex, um die Proben für 10 Sekunden und auf ein Drehrad bei Raumtemperaturfür 30 min für die DNA zu erlauben, über eine Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung an die Partikeloberflächen zu binden.
4. Sobald der Fänger-DNA mit den Streptavidin-beschichteten Teilchen wurde zugegeben und inkubiert, das überschüssige DNA in Lösung durch magnetische Trennung, indem die Proben auf einem Magnetzahnstange Plazieren für 30 min.
5. Entfernen Sie den Überstand, kümmert sich nicht um die neu gebildete Gruppe von Teilchen der Nähe des Magneten zu stören, und ersetzen mit dem gleichen Volumen an neuen PBST-Puffer.

6. Hybridisierende Complementary DNA an die CP-Teilchen

1. Die erforderliche Menge an Ziel-DNA (im Überschuß bei 500 nM), um die maximal mögliche Ziel sicherzustellen Bindung erreicht wurde.
2. Vortex die Proben 10 sec und auf ein Drehrad bei Raumtemperatur für 30 min.
3. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, entfernen Sie das überschüssige Ziel-DNA über magnetische Trennung, indem die Proben auf einem Magnet Rack platzieren für 30 min.
4. Entfernen Sie den Überstand, Kümmert sich nicht um die neu gebildete Gruppe von Teilchen der Nähe des Magneten, und ersetzen mit dem gleichen Volumen neuer PBST Puffer zu stören.
5. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.4 für Doppelproben und legen diese Proben auf einem Drehrad bei Raumtemperatur für 16 Stunden DNA Hybridisierungszeiten zu untersuchen.

7. TRPS-Setup

1. Stecken Sie das Gerät in ein Computersystem mit Software vorhanden.
2. Kalibrieren Sie die Anfangsstrecke mit einer Schieblehre.
   1. Den Abstand zwischen der Außenseite von zwei parallelen Klemmbacken.
   2. Eingang in die Software, indem Sie die Strecke in der "Strecke" Feld in der "Geräteeinstellungen" Registerkarte und klicken Sie "Kalibrieren Stretch 'unter der Registerkarte.
3. Lateral passen ein Polyurethan Nanopore Membran geeigneter Dimensionierung für die Analyse auf die Backen mit der Nanopore-ID-Nummer nach oben. Dann strecken die Backen auf der Strecke benötigt für die Analyse unter Verwendung derstretch Einstellgriff an der Seite des Instruments. Strecken Sie die Backen zwischen 43 und 48 mm.
   Hinweis: Der genaue Wert der Strecke entlang der angelegten Spannung bestimmt wird, so dass eine Kalibrierung Partikel Blockaden mindestens 0,3 nA groß sind. Die Strecke ist bereits in die Software in Schritt eingegeben 7.2 und werden automatisch angepasst, wie die Backen gespannt sind.
4. Legen Sie 80 ul PBST-Puffer in der unteren Fluidzelle unterhalb der Nanopore, um sicherzustellen, gibt es keine Blasen vorhanden, die die Messung beeinflussen können. Wenn es Blasen gesehen sind, zu entfernen und den Puffer zu ersetzen.
5. Klicken Sie auf die obere Flüssigkeitszelle in Position und platzieren 40 ul Puffer hinein, wieder zu gewährleisten gibt es keine Blasen vorhanden. Wenn Blasen in der oberen Fluidzelle sind, entfernen Sie sie durch die Flüssigkeit zu ersetzen.
6. Wenn eine reproduzierbare Basisstrom hat sich von Ersetzen der oberen Flüssigkeitszelle mit Puffer erreicht, dann werden 40 ul der Probe in die obere Fluidzelle und messen, indem Sie auf "stKunst "in der" Data Acquisition "Tab auf der Software-Bildschirm.
   Hinweis: Die Datenerfassung bei einer Frequenz von 50 kHz mit einer Blockade Größenordnung untere Grenze von 0,05 nA abgeschlossen ist, obwohl dies geändert werden kann die Software über die "Analyse Daten" Reiter (unter "Analyseeinstellungen" und "Resistive Sperrungen ') .
7. Platzieren einen Faradayschen Käfig über die Oberseite des Fluidzellensystems auf elektrische Hintergrundrauschen auf die Messung reduzieren.
8. Verwenden Sie einen variablen Druckmodul (VPM) einen Druck oder ein Vakuum auf die Proben anzuwenden.
   1. Um sich ein äußerer Druck die Düse in die obere Fluidzelle verbinden, drehen Sie dann den Druck Arm und einrasten (je nachdem, ob ein positiver Druck (PRE) oder ein Vakuum (VAC) wird angewendet werden).
   2. Wenden Sie Druck in einem "cm" oder "mm" Skala der Druckstufe Knopf auf der Oberseite des VPM gelegen verwenden. Drücken Sie den Knopf nach unten Druck auf die 'cm' Maßstab anwenden und ziehen Sie sie nach oben to gelten Druck auf die "mm" Skala.

8. Vorbereiten von Beispielen für TRPS Analyse

1. Vortex Proben 30 sec und beschallen für 2 min bei 80 Watt vor TRPS Analyse.

9. Kalibrieren des Nanopore für Zeta-Analyse

1. 40 ul Eichpartikel (1x10 ¹⁰ Teilchen / ml) in die obere Fluidzelle Nach der Platzierung, füllen Sie eine TRPS Messung (Setup wie in Kapitel 7) bei 3 Spannungen angelegt. Ändern Sie die Spannung, die durch einen Klick auf das "+" und "-" Tasten auf der Spannungsskala in der Registerkarte "Geräteeinstellungen" auf der Software.
2. Überprüfen Sie, ob die drei Spannungen Hintergrund Ströme von ca. 140, 110 und 80 nA zurück. Sicherzustellen, dass die Kalibrierungs Partikel erzeugen eine durchschnittliche Blockade Größenordnung von mindestens 0,3 nA an der Mittelspannung.
3. Einen Druck so die durchschnittliche Halbwertsbreite (FWHM) Dauer der Kalibrierungs Partikel zumindest0,15 ms. Tun Sie dies manuell den Druckarm mit auf den variablen Druckmodul befestigt. Wählen Sie den Druck (PRE) oder Vakuum (VAC) durch Drehen des Armes, bis es in der gewünschten Position einrastet und entsprechend Anweisungen in Schritt 7.8.2 einrichten gelten nach. Sobald diese Bedingungen erreicht wurden, den Lauf starten, indem Sie "Start" auf der Software in der "Data Acquisition" Registerkarte klicken.
4. Füllen Sie den Lauf von "Stop" in der "Data Acquisition" Tab drücken, wenn mindestens 500 Teilchen gemessen wurden (siehe "Particle Count 'am unteren Rand der Software-Bildschirm während der Messung) und der Lauf wurde 30 Sekunden überschritten wird (siehe' Run Time 'auch in Richtung der Unterseite des Bildschirms).
5. Kalibrieren Sie das System durch einen Kalibrierungslauf abgeschlossen, wie jedes Mal, wenn ein neues Nanopore beschrieben eingeführt wird oder für jeden neuen Tag der Analyse von 9,1-9,4 Schritt vervollständigt.

10. eine Probe Lauf

1. Führen Sie die Proben mit der höchsten oderzweithöchste Spannung wie die Kalibrierungsproben auf einem ähnlichen (± 10 nA) gewährleistet, wenn sie nicht gleich sind, Basisstrom.
   1. Sobald die geeignete Basisstrom erreicht wird, ersetzen Sie den Elektrolyt in der oberen Fluidzelle mit 40 ul der Probe. Wenn eine Probe eingeführt wird, Blockaden auf der Signalspur zu sehen. Starten Sie das Beispiel ausführen, indem Sie auf "Start" in der "Data Acquisition" Tab und notieren Sie mindestens 500 Teilchen (check 'Particle Count' unter der Signalspur befindet) und sorgen für die Laufzeit mindestens 30 sec ist (siehe 'Run Time 'auch unterhalb der Signalspur befindet).
   2. Um die Messung abgeschlossen ist, klicken Sie auf "Stopp" in der "Data Acquisition Registerkarte 'und die Datendatei speichern.
2. die Datei, geben Sie die Dateiinformationen in folgendem Format zu speichern; "Untersuchung" ist der Ordner, die Datei gespeichert werden soll in "Nanopore ID" ist die Seriennummer der Pore verwendet wird, 'Part #' is die Art der Poren (dh NP150 / NP200), "Proben - ID" der Name der Probe vorhanden ist, "Kalibrierung oder Probe" Details , ob es sich um eine Kalibrierung oder Probenmessung ist, "Verwässerung" wird verwendet, wenn die Probe wurde verdünnt ( Typ 100, wenn die Probe verdünnt wurde 100-fach), "Druck" ist der ausgeübte Druck auf die Probe (in cm - siehe Abschnitt 7.8), 'Electrolyte-ID' ist der Name des Puffers wird die Probe aus in und ' Hinweise 'sind jegliche persönliche Notizen über die Probe oder laufen.
3. Zwischen jedem Probelauf, waschen Sie das System mit 40 ul PBST Platzierung mehrmals Puffer in die obere Fluidzelle und verschiedene Drücke (in der Regel bei -10, -5 cm (Vakuum), und 5 und 10 cm (Überdruck)) Aufbringen bis nicht mehr Blockade Ereignisse vorhanden sind, um sicherzustellen, gibt es im System verbleiben keine Restpartikel sind und daher keine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Führen Proben in dreifacher Ausfertigung mit diesem Waschschritt zwischen jeder Wiederholung Probe abgeschlossen als wel laufenl zwischen verschiedenen Proben.

Ergebnisse

Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Prozesse der magnetischen Reinigung und einer TRPS Messung. A) Beispiel für magnetische Reinigung von Probe mit einer Probe ausgehend enthält überschüssige, nicht gebundene Einfang - Sonde DNA. B) trpS Meßbeispiel i) Partikel durch die Nanopore vorbei und ii) Blockade Ereignis von Teilchen vorübergehend verschließenden Ionen ...

Diskussion

Die Berechnung für das Zeta - Potential verwendet , um eine Kalibrierung basierte Methode verwandt von Arjmandi arbeiten et al. ^21. Die Dauer der Translokation von Teilchen, wie sie eine Nanopore durchqueren, als eine Funktion der angelegten Spannung gemessen wird, eine mittlere elektrische Feld und Partikelgeschwindigkeiten über die Gesamtheit eines regelmäßigen konischen Pore verwenden. Die elektrophoretische Mobilität ist die Ableitung von 1 / T in Bezug auf die Spannung (wobei T die Dauer Blockad...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 Tablette aufgelöst in 200  ml deionisiertes Wasser zur Herstellung einer Pufferlösung.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0,05 % (v/v) in PBS-Puffer als Tensid
Carboxylpolystyrol-Nanopartikel	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nenndurchmesser von 220  nm, Rohkonzentration von 1 x 1012 Partikel/ml, spezifische Oberflächenladung von 86 µ eq/g (entspricht einer Oberflächenladungsdichte von 3,2 x 1019 C/nm2.
Mit Streptavidin beschichtete Nanopartikel	Ademtech, Frankreich	3121	Batch hatte eine Bindungskapazität von 4.352 pmol/mg (188 nM theoretische DNA-Bindungskapazität) bei einer Rohkonzentration von 1,1 x 1011 Partikeln/ml.
Biotinylierte Oligonukleotide	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Lieferantenspezifikation: Reverse Phase 1 Aufreinigung (0,05 Skala); Biotin-Modifikation am 3'-Ende; Lyophilisierte Pulver, rekonstituiert auf 100  &Mikro; M mit entionisiertem Wasser und nach Bedarf verdünnt. Sequenzen: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]
3'Standard-Olignonukleotide	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Lieferantenspezifikation: Umgekehrte Phase-1-Reinigung (0,05-Skala); Lyophilisierte Pulver, rekonstituiert auf 100 &; Mikro; M mit entionisiertem Wasser und nach Bedarf verdünnt. Sequenzen von DNA-Zielen: Vollständig komplementär - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Mittelbindung - 5'GTAGTGAGGT3', Endbindung - 5'GTTTAACCAT3', Teilweise komplementärer Überhang - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3".
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inhärenter Druck auf das System von 47  Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Jeder "cm" Druck entspricht ca. 100 Pa.
Polyurethan-Nanoporenmembranen	Izon Science, NZ	NP150	Analytgrößenbereich 60-480 nm, Porendurchmesser berechnet auf 799 nm bei einer Dehnung von 45 mm.
Magrack 6	GE Healthcare, Großbritannien	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, Großbritannien	10692353	80 Watt
Vortexer	IKA, Deutschland	0003365000
Drehrad	Labnet International, US	H5500-230 V