Methodenartikel

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

DOI:

10.3791/54608

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13. Oktober 2016

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1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll zeigt, wie Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf die retinale Neuronen aus einem flachen-Mount-Vorbereitung durchzuführen.

Zusammenfassung

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Die Netzhaut von Säugetieren ist ein geschichtetes Gewebe aus mehreren neuronalen Typen zusammen. Um zu verstehen, wie visuelle Signale in seinem komplizierten synaptische Netzwerk verarbeitet werden, werden häufig elektrophysiologischen Ableitungen zu studieren Verbindungen zwischen den einzelnen Neuronen verwendet. Wir haben optimiert, um eine Flachmontage Vorbereitung für die Patch-Clamp-Aufzeichnung von genetisch markierten Neuronen in sowohl GCL (Ganglion Zellschicht) und INL (innere Kernschicht) von Maus-Netzhäuten. Aufnahme INL Neuronen in Flat-Halterungen über Scheiben bevorzugt, weil sowohl vertikale als auch seitliche Anschlüsse in der früheren Konfiguration beibehalten werden, so dass der Netzhaut-Schaltungen mit großen seitlichen Komponenten untersucht werden. Wir haben dieses Verfahren verwendet Reaktionen von Spiegelneuronen partnered in Retinae wie die cholinerge Starburst-Amakrinzellen (SAC) zu vergleichen.

Einleitung

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Als leicht zugänglicher Teil des zentralen Nervensystems ist die Netzhaut seit Jahrzehnten ein nützliches Modell in neurowissenschaftlichen Studien. Die genetische Markierung von Neuronen hat eine detaillierte Charakterisierung der synaptischen Verbindungen in der Netzhaut ermöglicht. Mit vielen verfügbaren Methoden zur Untersuchung der Funktion und Morphologie von retinalen Neuronen hat die Patch-Clamp-Aufzeichnungstechnik maßgeblich zu unserem aktuellen Verständnis von vertikal übertragenen Signalen in der Netzhaut beigetragen. Diese Signale stammen aus der Photonenabsorption in Photorezeptoren und werden durch das Spiking von retinalen Ganglienzellen (RGCs) an die ....

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Protokoll

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Ethische Zustimmung - Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der National Institutes of Health Leitlinien für die Forschung Tieren durchgeführt, wie sie in der institutionellen Tierpflege und verwenden Ausschuss von Baylor College of Medicine zugelassen.

1. Externe und interne Lösungen

  1. Verwenden Sie Säugetier Ringer-Lösung während der Retina Dissektion und als externe Lösung in den nachfolgenden elektro Aufnahme. Bereiten Sie das Säugetier-Ringer-Lösung von 10x Stammlösung (ohne Calcium) am Tag der Aufnahme, und fügen Sie CaCl 2 tropfenweise nach 15 min von carbogenation ....

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Ergebnisse

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Repräsentative Aufnahmen von On- und OFF-Typ FFH aus einer deafferentated Maus Netzhaut sind in Abbildung 1 dargestellt. Cholinergen Zellen sowohl in der GCL und INL zuverlässig durch tdTomato Fluoreszenz und gezielt für Ganzzell - Patch - Clamp - Aufzeichnung unter DIC (1A) identifiziert werden , offenbaren Schwingung ihrer Membranpotentialen (oben Spuren) und den synaptischen Ströme, die es (unten Spuren, 1B) fahren. Die inhibitorische.......

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Diskussion

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Viele Labors haben von GCL - Neuronen in der aufgezeichneten Flachmontage Vorbereitung 15-18, aber unsere Verfahren von INL Neuronen ermöglichen die Aufnahme. Wir betonen hiermit mehrere Schritte, die für eine erfolgreiche Routine-Aufnahmen von entscheidender Bedeutung sind.

Die Frische und die Flachheit der Netzhaut sind wichtig für sie mit einer Aufnahme Pipette eindringen. In dieser Hinsicht ist die feste Anbringung der Netzhaut auf die gestanzten Nitrocellulosemembran ragende .......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Joung Jang und Xin Guan für die technische Unterstützung. Wir danken Dr. Rory McQuiston von der Virginia Commonwealth University für die Einrichtung unseres ersten Patch-Clamp-Rigs und die Beratung zu experimentellen Verfahren. Wir danken Dr. Samuel Wu für die Vorschläge zur Aufzeichnung von Spannungsklemmen. Die Arbeit wird durch NIH-Zuschüsse EY013811, EY022228 und einen Vision Core Grant EY002520 unterstützt. C-KC ist der Stiftungslehrstuhl der Alice R. McPherson Retina Research Foundation am Baylor College of Medicine.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Festtisch-Fluoreszenzmikroskop mit DICOlympusBX51-WI
MikromanipulatorenSutterMP-225
Patch-Clamp-VerstärkerA-M SystemAM2400
AD-WandlerNational InstrumentNI-USB-6221
HeizungsreglerWarner InstrumentTC-324B
Inline HeizungWarner InstrumentSC-20
SchlauchpumpeRaininDynamax
PipettenabzieherSutter InstrumentP-1000
Glasröhrchen mit FilamentKing Precision GlassCustomized
StimulatorA.M.P.I.Master-8
BiocytinSigmaB4261
NaClSigmaS6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-GlucoseSigmaG6152
K-GluconatSigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTASigmaE0396
HEPESSigmaH4034
KOHSigmaP5958
Cs-MethansulfonatSigmaC1426
CsOHSigma232041
SpritzenfilterNalgene171
1 mlSpritze Rainin
10 μ l PipettenspitzeGenesee Scientific24-130RL
Streptavidin-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q
17013002

Referenzen

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  1. Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
  2. Gregg, R. G., et al.

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Schlagwörter

Whole Cell Patch ClampRetinale NeurobiologietdTomato FluoreszenzGanglienzellschichtinnere K rnerschichtretinale Schaltkreise

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