Methodenartikel

Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

DOI:

10.3791/54625

⸱

21. November 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll mit hochauflösender episkopischer Mikroskopie, um dreidimensionale (3D) Bilder von Mausembryonen zu erfassen. Dieses verbesserte Protokoll verwendet eine modifizierte Gewebepräparationsmethode, um die Penetration des Fluoreszenzfarbstoffs zu verbessern und so die morphometrische Analyse sowohl kleiner als auch großer Proben zu ermöglichen.

Zusammenfassung

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Die hochauflösende episkopische mikroskopische (HREM) Technologie ermöglicht die schnelle Erfassung von hochauflösenden digitalen volumetrischen und dreidimensionalen (3D) morphometrischen Daten. Hier beschreiben wir das detaillierte Protokoll zur Abbildung des gesamten Mausembryos. Das Protokoll besteht aus vier Hauptabschnitten: Probenvorbereitung, Einbettung, Bildaufnahme und schließlich 3D-Visualisierung. Die Technologie erfordert, dass die Proben mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt werden, was bei großen oder dichten Proben problematisch sein kann. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir das bestehende Protokoll verbessert, um die Gewebepenetration des Farbstoffs zu verbessern, indem wir die Probe mit einer Lösung vorbehandelt haben, die Harnstoff und Natriumdodecylsulfat enthält. Das Protokoll verwendet nur routinemäßige Laborgeräte und Reagenzien für eine einfache Anpassung in Standardlaborumgebungen. Wir zeigen, dass die resultierenden hochauflösenden 3D-Bilder die detaillierten morphologischen Merkmale der inneren Organe von Mausembryonen originalgetreu rekapitulieren und so morphometrische Analysen ermöglichen. Gemeinsam präsentieren wir ein detailliertes und verbessertes Protokoll mit Standard-Laborgeräten, um hochauflösende 3D-Bilder von kleinen und großen Proben zu erfassen.

Einleitung

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Das Aufkommen von 3D-Bildgebungstechnologien hat die Möglichkeit der systemischen Analyse detaillierter morphologischer Merkmale während der Entwicklung des Fötus eröffnet. Eine Vielzahl von 3D-Bildgebungsmodalitäten ist jetzt verfügbar, darunter die Mikromagnetresonanztomographie (Mikro-MRT), die Mikro-Computertomographie, der Hochfrequenz-Ultraschall, die optische Kohärenztomographie, die optische Projekttomographie und die episkopische Mikroskopie1-4. Jede Modalität hat ihre eigenen einzigartigen Merkmale in Bezug auf Auflösung, Kontrast, Geschwindigkeit, Kosten, In-utero-Fähigkeit und Verfügbarkeit.

Episkopische Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) und hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) sind episkopische Mikroskopie-Bildgebungsverfahren4. Dabei werden anstelle von Gewebeschnitten kontinuierlich hochauflösende Serienbilder von der Blockfläche aufgenommen. Die resultierenden Bilder spiegeln detaillierte morphologische Merkmale mit minimaler oder keiner Gewebeverzerrung originalgetreu wider. Die erfassten volumetrischen Daten lassen sich leicht in hochauflösende 3D-Bilder konvertieren, die für eine genaue morphometrische Analyse geeignet sind. Aufgrund der relativ niedrigen Kosten und der hohen Auflösung sind HREM und EPIC die überlegenen Alternativen für die systemische Bewertung von Mausmodellen für menschliche Geburtsfehlergeworden 2,4-8.

Sowohl die EFIC- als auch die HREM-Methode erfordern, dass Proben in das geeignete Medium eingebettet werden. EFIC erkennt Autofluoreszenz, die vom eingebetteten Gewebe emittiert wird. Aus diesem Grund ist es auf Proben beschränkt, die ein hohes Maß an Autofluoreszenz emittieren, aber nicht auf Proben mit relativ schwacher Autofluoreszenz, wie z. B. Embryonen im Frühstadium9. Um die Abhängigkeit von der Autofluoreszenz zu überwinden, werden die Proben mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie Eosin für die HREM-Bildgebung gefärbt. Die Wahl der Farbstoffe und Färbemethoden macht HREM auch kompatibler für die Detektion molekularer Signale im Kontext der Gewebearchitektur und -morphologie4,10.

In diesem Artikel stellen wir ein verbessertes HREM-Protokoll vor, das für die Ganzkörperbeurteilung von Mausembryonen im späten Stadium geeignet ist. Um die Färbung zu erleichtern, fügen wir einen Vorbehandlungsschritt hinzu, um die Gewebepenetration zu erhöhen und so die HREM-Bildgebung älterer Mausembryonen zu ermöglichen.

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Protokoll

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Alle Tier Anwendungen werden von der Institutional Animal Care und Use Committee bei Boston Kinderkrankenhaus zugelassen.

1. Probenvorbereitung

  1. Timed Paarung
    1. Legen Sie eine C57Bl6 Wildtyp-Männchen und ein Weibchen zusammen in der gleichen Käfig.
    2. Prüfen Sie, ob die Bildung eines Gegenstecker früh am nächsten Morgen. Der Gegenstecker ist (aka, vaginal oder Kopulation Stecker) eine gehärtete gallertartig Ablagerung der Vagina, blockiert.
    3. Stellen Sie den Stecker Datum wie embryonale Tag 0.5 (E0.5).
  2. Isolierung von Maus - Embryonen
    1. Euthanize trächtige Weibchen von CO 2 Ersticken.
    2. Setzen Sie Mäuse in Rückenlage auf einem absorbierenden Kissen und Spray Bauchbereich mit 70% Ethanol.
    3. Heben Sie die Haut und machen einen anfänglichen 5 mm Schnitt an der Schwanzbauchregion mit chirurgische Scheren. Schneiden Sie und entfernen Sie die Bauchhaut vollständig die inneren Organe aussetzen
    4. Schneiden Sie in der Nähe von vagina die gesamte Gebärmutter zu entfernen.
    5. Schneiden Sie zwischen Implantationsstellen entlang der Uterushorn. Jedes Segment oder conceptus sollte innerhalb nur ein Embryo haben.
    6. Halten Sie die Gebärmutter-Segmente in 1x eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
  3. Embryo Dissektion
    1. Platzieren Sie jede conceptus in einer separaten Schüssel mit eiskaltem PBS unter einem Stereoskop.
    2. Entfernen Sie Gebärmuttergewebe, Plazenta und dann sequentiell Eihüllen mit feinen Dissektionszangen.
    3. Übertragen Sie die seziert Embryo in einen 50-ml-Röhrchen mit 1x eiskaltem PBS eine große Transferpipette. Vermeiden Embryo Aufnehmen direkt mit einer Pinzette Gewebeschäden zu minimieren.
  4. Fixierung
    1. Fixieren die sezierten Embryonen in 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung bei 4 ° C für mehr als 24 h mit mindestens 10 Probenvolumina von Fixativ.
  5. Vorbehandlung
    1. Bereiten Sie die Clearing-Lösung: 4M Harnstoff, 10% Glycerin, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) in doppelt destilliertem Wasser.
    2. Ersetzen Sie das Fixiermittel mit der Clearing-Lösung.
    3. Vorsichtig drehen für auf einer Wippe bei Raumtemperatur 1 die Probe - 2 Wochen. Tauschen Sie die Clearing-Lösung einmal auf dem zweiten und dritten Tag. Die Probe wird langsam klar und durchscheinend.
    4. Ersetzen Sie die Clearing-Lösung mit 10% Formalin und verlassen auf einer Wippe für 2 Tage.
  6. Entwässerung
    1. Waschen Sie die vorbehandelten Proben mit 1x PBS 3 mal für jeweils 5 Minuten.
    2. Entwässern Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe bei Raumtemperatur auf einem sanften Rocker. Für E15.5 Embryonen, verwenden eine aufsteigende Ethanolreihe einschließlich 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% und 100% Ethanol, 2 Stunden jeden Schritt. Für ältere Embryonen, muss die Inkubationszeit erhöht werden.
  7. Die Färbung
    1. Bereiten Sie Färbelösung: add 0,1375 Gramm Eosin Y Dinatriumsalz und 0,0275 g Acridinorange hemi (Zinkchlorid) -Salzes zu 50 ml 100% Ethanol. Rühre 2 Stunden. Filter mit einem Filterpapier. Lagerung bei Raumtemperatur und vermeiden Licht, indem sie mit Alufolie abdecken.
    2. Übertragen Probe zu der Färbungslösung für 1 Stunde.
    3. Ersetzen mit frischem Färbelösung und Flecken über Nacht.
  8. Infiltration
    1. Bereiten Sie Infiltrationslösung: Kombinieren Sie 100 ml Lösung A von JB-4 Einbettungssatz, 1,25 g Katalysator C, 0,275 g Eosin Y Dinatriumsalz und 0,055 g Acridinorange Hemi (Zinkchlorid) Salz. Rühre 2 h (200 Upm) in einem Eisbehälter zu mischen, und dann mit dem Filterpapier gefiltert.
    2. Bewahren Sie die Infiltrationslösung bei 4 ° C und vermeiden Licht durch Abdecken mit Aluminiumfolie.
    3. Übertragen Sie die Embryonen Lösung Infiltrations: Färbelösung (1: 1), und Inkubation für mindestens 3 Stunden auf einer Wippe bei 4 ° C.
    4. Übertragen Sie die Embryonen Lösung Infiltrations und Inkubation für 3 hr auf einer Wippe in einem kalten Raum.
    5. in einem kalten Raum auf einem sanften Rocker für drei weitere Tage ersetzen einmal Infiltrationslösung jeden Tag, und lassen.

2. Embedding

  1. Halten Sie die Lösung B und Infiltrationslösung auf Eis.
  2. Machen Sie Embedding Solution (01.25 der Lösung B und Infiltrationslösung) unmittelbar vor dem Einbetten.
  3. Richten Sie die Probe in einer Einbettform, dann gießen kalt Embedding-Lösung in die Einbettform sanft. Re-Orientierung mit einem Stift, wenn nötig.
  4. Verwenden Sie einen Stift zu prüfen, ob die Embedding-Lösung verfestigt wird. Schieben Sie den Probenblock heraus und schneiden Sie es, wenn nötig.
  5. Richten Sie die Probe und die separate Form mit einer Querorientierung zu erhalten.
  6. Setzen Sie einen Blockhalter auf der Oberseite der Einbettform. gießen Sie vorsichtig Embedding-Lösung in die Form, bis die Form und der Blockhalter durch Einbetten Lösung eingetaucht sind.
  7. Halten Sie die Probe in einem Sekundärbehälter und lassen Sie esauf Eis für 3 bis 4 Stunden in einem Abzug.
  8. Speichern die verfestigten Proben in einem 4 ° C.
  9. Ziehen Sie die Einbettform entfernt. Setzen Sie den Block unter dem Stereomikroskop mit schräger Beleuchtung Position der Probe in dem Block zu inspizieren. Auf der Blockfläche, die Probenmarkierung Gitterlinien um.
  10. Schneiden Sie den Block zu entfernen, um Zugang Materialmenge Einbetten der markierten Gitterlinien als Referenzen.

3. Image Acquisition

  1. Klemmen Sie den Probenblock zu dem Mikrotom und erhalten eine frische Schnittfläche. Set Schnittdicke (zB e9.5-10.5, 1,5 & mgr; m; e11.5-12.5, 2,0 & mgr; m; e13.5-15.5, 2,5 & mgr; m; E16.5-älter, 3 & mgr; m). Halten Sie die Probe / Block an der Ausgangsposition von Mikrotom.
  2. Montieren Sie den Stereo-Zoom-Mikroskop horizontal um den Block Oberfläche der Probe gegenüber.
  3. Schalten Sie den Computer und Mikroskop, und starten Sie die Bildaufnahme-Software.
  4. Visualisieren und konzentrieren sich die Optik auf den Block-faceunter der "Live-Ansicht" Modus der Imaging-Software.
  5. Richten Mikroskop und Mikrotom, wenn nötig, so dass die Blockfläche in der Mitte des Suchers ist.
  6. Stellen Sie den Zoom, so dass der gesamte Block-Gesicht im Sucher ist.
  7. Wählen grün fluoreszierendes Protein (GFP) -Filter (Anregung 470 ± 20 nm, dichroitische 495 nm, Emission 525 ± 25 nm) und neu auszurichten, wenn nötig.
  8. Messen Sie und stellen Sie die Belichtungszeit manuell (zB 80-400 Mini sec).
  9. Erwerben Sie Bilder des block Gesicht nach jedem frischen Schnitt und Speichern von Bildern automatisch, wenn möglich.
  10. Zeichnen Sie wichtige Parameter wie Auflösung, Schnittdicke und Zoom.
  11. Nachdem die gesamte Probe, Export Finishing und alle Bilddateien in das JPEG-Format, wenn notwendig, zu konvertieren.
  12. Invert alle Originalbilder eine Bildverarbeitungssoftware, und die Helligkeit und den Kontrast.
  13. Speichern Sie alle bearbeiteten Bilder in einem separaten Ordner.

4. 3DVisualisierung

  1. Laden Sie alle bearbeiteten Bilder zu einem 3D-Visualisierungssoftware gemäß den Anweisungen.
  2. Eingangsauflösung und Schnittdicke um alle Bilder zu volumetrischen Daten zu konvertieren (dh Voxel - Größe) und die 3D - Datei zu speichern.
  3. Richten Sie alle Bilder den automatischen Modus. Passen Sie manuell einzelne Bilder, wenn nötig.
  4. Speichern Sie das ausgerichtetes Bild zu einem neuen Dateinamen.
  5. Analysieren morphometrischen Eigenschaften der Probe die 3D-Visualisierungssoftware.

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Ergebnisse

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Wir haben hohe Qualität HREM Bilder von Mäuseembryonen berichtet zwischen E9.5 und E13.5 8. Bildqualität der spät statt Embryonen jedoch signifikant wegen der begrenzten Gewebepenetration des fluoreszierenden Farbstoffes Eosin kompromittiert. Um die Färbung die Effizienz zu steigern, haben wir mehrere Vorbehandlungsmethoden getestet, die auf Fluoreszenz - kompatibel sind Bildgebung 11. Insbesondere wurden die E15.5 Maus - Embryonen entweder mit A2 12 Sca ...

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Diskussion

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Hier präsentieren wir eine modifizierte Protokoll Routinelaborgeräte mit seriellen HREM Bilder zu erwerben, die für die schnelle 3D-Visualisierung und morphometrische Analyse komplexer Strukturen kompatibel sind. Da die hochauflösenden Bilder direkt von der Blockfläche statt einzelner Abschnitte genommen werden, werden die feinen morphologischen Merkmale erhalten und schnell digital in einem 3D-Visualisierungsprogramm rekonstruiert.

3D-Bildgebung bietet signifikante Vorteile bei der Visualis...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Yichen Huang, Dr. Chunming Guo und Dr. Zhenfang Zhou für ihre technische Unterstützung. Diese Forschung wurde von NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) und der American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MäuseThe Jackson LaboratoryC57BL6
EthylalkoholPharmco-Aaper111000200200 Proof, Absolut, ACS / USP / Koscher Qualität
FormalinSigmaHT501128-4L
HarnstoffSigmaU5128Clearing-Lösung
GlycerinFisher ScientificG33-4Clearing-Lösung
NatriumdodecylsulfatInvitrogen15525-017Reinigungslösung
Eosin Y DinatriumsalzFisher wissenschaftlicheBP241925Infiltrationslösung
Acridin Orange Hemi (Zinkchlorid) SalzSigmaA6014Infiltrationslösung
Whatman PapierGE3030-153
JB-4 Einbettungskit - Lösung APolysciences, Inc.0226A-800Infiltrationslösung
JB-4 Einbettungskit - Lösung BPolysciences, Inc.0226B-30Einbettlösung
JB-4  Einbettungs-Kit - CatalystPolysciences, Inc.02618-12Infiltrationslösung
zum Einbetten von FormenPolysciences, Inc.23185-116 x 8 mm
Peel-A-Way scharfe EinbettungsformenPolysciences, Inc.18986-122 mm x 22 mm quadratisch, gekürzt auf 12 mm x 12 mm
JB-4  Kunststoff-BlockhalterPolysciences, Inc.15899
Einweg-Graduiert-TransferrohreVWR414004-014
PetrlschaleVWR25384-088zum Sezieren von Embryonen
Inox-Spitze ROBOZRS-5015
Graefe Gewebezange; ROBOZRS-5153Embryodissektion
Empfindliche Operationsschere  ROBOZRS-6700Embryodissektion
14 ml Polypropylen-Röhrchen mit rundem BodenFalcon352059
50 ml konische Polypropylen-RöhrchenFalcon352098
Ice BucketMagic Touch Iceware International Corp.R19-343
100 ml (3,4 Unzen) Antistatische Polystyrol-WaageVWR89106-766
330 ml (11,2 oz.) Antistatische Polystyrol-WägeschiffchenVWR89106-770
NatriumchloridMP Biomedicals102892PBS-Lösung
KaliumchloridSigmaP0662PBS-Lösung
Kaliumphosphat monobasischSigmaP5405PBS-Lösung
Natriumphosphat zweibasisches HeptahydratSigma-AldrichS9390PBS-Lösung
DigitalkameraHamamatsu PhotonicsC11440-10C
MikrotomLeicaRM2265
IlluminatorCarl ZeissHXP 200C
Fluoreszenz-Stereo-Zoom-MikroskopCarl ZeissAxio Zoom.V16
StereomikroskopOlympusSZX16
Faseroptische LichtquelleLeicaKL 1500 LCD
Einweg-MikrotomklingeVWR95057-832
Single Edge DispenserPersonna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D SoftwareVisage Imaging5.4
ComputerDell T7600, 2x900GB SAS Festplatte und 64 GB DDR3 RDIMM Speicher
Rocking Platform ShakerVWR40000-304
Standard HeizplattenrührerVWR12365-382
AnalysenwaageMettler ToledoAB54-S
Pinzette für die Embryodissektion

Referenzen

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3D BildakquisitionBildgebung von M useembryonenProbenvorbereitungGewebekl rungFluoreszenzf rbungEthanol DehydrierungEinbettungsverfahrenMikrotomschnitt3D Visualisierung

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