G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Zusammenfassung

Einfache Methoden zum Nachweis der selektiven Aktivierung von G-Proteinen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren stellen nach wie vor eine herausragende Herausforderung bei der zellulären Signalübertragung dar. Hier wurden Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) Biosensoren entwickelt, indem ein GPCR an G-Proteinpeptide paarweise gebunden wurde, um Konformationsänderungen bei kontrollierten Konzentrationen in lebenden Zellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte Studien immer häufiger bei der Untersuchung von GPCR-Signal geworden sind. Unsere Arbeitsgruppe entwickelte ein intramolekularen FRET-Sensor die Wechselwirkung zwischen Ga-Untereinheiten und GPCRs in lebenden Zellen nach Agonist Stimulation zu erkennen. Hier stellen wir ausführlich das Protokoll für die Veränderungen in der FRET zwischen dem β ₂ -adrenergen Rezeptor und dem Gαs C-Terminus - Peptid bei der Behandlung mit 100 & mgr; M Isoproterenolhydrochlorid Erfassen gekennzeichnet zuvor ^1. Unsere FRET-Sensor ist ein einzelnes Polypeptid, das aus seriell von einer Volllängen-GPCR, einem FRET-Akzeptor-Fluorophor (mCitrine), eine ER / K SPASM (systematische Protein-Affinitätsstärke modulation) Linker, einem FRET-Donor-Fluorophor (mCerulean) und eine G & agr; C -terminalen Peptid. Dieses Protokoll wird ausführlich Zellpräparation, Transfektionsbedingungen, Geräte-Setup, Testausführung und Datenanalyse. Dieses experimentelle Design erkennt kleine changes in FRET indikativ für Protein-Protein-Wechselwirkungen und kann auch verwendet werden, die Stärke der Interaktion zwischen den Liganden und GPCR-G-Protein-Paarungen zu vergleichen. Um das Signal-Rausch-in unseren Messungen zu verbessern, Dieses Protokoll erfordert erhöhte Präzision in allen Schritten, und wird hier präsentiert, um reproduzierbare Durchführung ermöglichen.

Einleitung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind sieben-Transmembran-Rezeptoren. Das menschliche Genom enthält etwa 800 allein Gene kodierend für GPCRs, die durch eine Vielzahl von Liganden, einschließlich Licht, Geruchsstoffe, Hormone, Peptide, Arzneimittel und andere kleine Moleküle aktiviert werden. Fast 30% aller Arzneimittel auf dem Markt Ziel GPCRs , weil sie eine große Rolle spielen bei vielen Krankheitszuständen ^2. Trotz jahrzehntelanger intensiver Arbeit an dieser Rezeptorfamilie getan, gibt es weiterhin erhebliche offene Fragen auf dem Gebiet, vor allem im Hinblick auf die molekularen Mechanismen, die GPCR-Effektor-Wechselwirkung fahren. Bis heute ha....

Protokoll

1. DNA-Präparation

1. Design-Sensor konstruiert ein modulares Klonens Schema verwendet. Beziehen Sie sich auf den β ₂ -AR Sensordesign zuvor ¹ beschrieben.
2. Bereiten Sie DNA nach Handels Minipräparationskit Protokoll und eluieren in 2 mM Tris-HCl - Lösung, pH 8, bei einer Konzentration von ≥ 750 ng / & mgr; l, A ₂₆₀ / A ₂₈₀ von 1,7-1,9, A ₂₆₀ / A ₂₃₀ von 2,0 bis 2,29.

2. Zellkultur Vorbereitung

1. Kultur HEK-293T-Flp-n-Zellen in DMEM, das 4,5 g / L D-Glucose, supplementiert mit 10% FBS (hitzeinaktiviert) (v / v), 1% L-Glutamin zu ergänzen, 20 ....

Ergebnisse

Eine verallgemeinerte schematische Darstellung des Versuchsaufbau und die Ausführung ist in Abbildung 3 beschrieben.

Um eine FRET Änderung in dem schmalen Dynamikbereich des Sensors zu erfassen, ist es entscheidend für die Nuancen des Systems anhaften einzuhalten. Zellqualität ist zwingend notwendig , um die Proteinexpression sowie die Konsistenz bei der Probenahme. Abbildung 1 zeigt Bilder von kultivierten Zellen in einer konsistenten einschichtigen (10X) w.......

Diskussion

Die enge Dynamikbereich von FRET-Messungen in diesem System verstärkt die Notwendigkeit, sensible Qualitätskontrolle bei jedem Schritt dieses Protokolls. Die wichtigsten Schritte ein erfolgreiches FRET Experiment sind 1) die Zellkultur, 2) Transfektion 3) Proteinexpression und 4) zeitnah, präzise Koordination während des Testausführung zu gewährleisten.

Zell Gesundheit und Pflege / Beschichtung Qualität kann einen erheblichen Einfluss auf das Signal-zu-Rausch des experimentellen Systems und .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
B2-AR-10 nm-Gaspeptid-Sensor	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	Eluieren in 2 mM Tris-Elutionspuffer
HEK-293T-Flp-n-Zellen	Life Technologies	R78007
Trypsin (0,25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- hoher Glukosegehalt	Life Technologies	11960-044	Warmer In  37 > C Wasserbad vor Gebrauch
FBS, zertifiziert, hitzeinaktiviert, US-amerikanischer Ursprung	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Reduziertes Serummedium; Vor Gebrauch auf RT bringen
XtremeGene HP Transfektionsreagenet	Roche	6366236001	Sehr empfohlen für seine Konsistenz. Vor Gebrauch auf RT bringen
FluoroMax 4	Horiba		Verwendung mit der FluorEssence V3.8 Software
3 mm Weglänge Quarzküvette	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	Möglicherweise Küvettenhalter/Adapter für die Verwendung in Fluorometern erforderlich, erhältlich ab Starna
Sc100-S3 Beheizte Umwälzwasserbadpumpe	Fisher Scientific	13-874-826	Warm auf 37 &Grad; C vor Gebrauch
Thermomixer Heizblock	Eppendorf	22670000	Warm auf 37 > C vor Gebrauch
Ultrareine DNA/RNAsefreies Wasser	Life Technologies	10977015	Anwendung bei RT
D(+)-Glukose, wasserfreies	Sigma	G5767
Aprotinin aus der Rinderlunge	Sigma	A1153
Leupeptin, Hemisulfat	EMD	10-897
L-Ascorbinsäure, Reagenzqualität	Sigma	A0278
(-)- Isoproterenol (+)-Bitartrat	Sigma	I2760	Bei jedem Experiment frisches Aliquot verwenden