Vor kurzem wurde eine Reihe von FRET-basierten Kraft-Biosensoren entwickelt, die die proteinspezifische Auflösung der intrazellulären Kraft ermöglichen. In diesem Protokoll zeigen wir, wie einer dieser Sensoren, der für den Linker des Nukleoskelett-Zytoskelett (LINC)-Komplexproteins Nesprin-2G entwickelt wurde, zur Messung von Aktomyosinkräften auf den nukleären LINC-Komplex verwendet werden kann.
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Methodenartikel
Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es wurde angenommen, dass der LINC-Komplex die kritische Struktur ist, die die Übertragung mechanischer Kräfte vom Zytoskelett auf den Zellkern vermittelt. Nesprin-2G ist eine Schlüsselkomponente des LINC-Komplexes, der das Aktin-Zytoskelett mit Membranproteinen (SUN-Domänenproteinen) im perinukleären Raum verbindet. Diese Membranproteine verbinden sich mit Laminen im Zellkern. Kürzlich wurde eine Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-Kraftsonde in mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (Tension Sensor)) kloniert und zur Messung der Spannung über Nesprin-2G in lebenden NIH3T3-Fibroblasten verwendet. In dieser Arbeit wird der Prozess der Verwendung von Nesprin-TS zur Messung komplexer LINC-Kräfte in NIH3T3-Fibroblasten beschrieben. Um FRET-Informationen aus Nesprin-TS zu extrahieren, wird auch ein Überblick darüber gegeben, wie rohe Spektralbilder spektral in Akzeptor- und Donor-Fluoreszenzkanäle entmischt werden können. Mit Hilfe von Open-Source-Software (ImageJ) werden Bilder vorbearbeitet und in ratiometrische Bilder umgewandelt. Schließlich werden FRET-Daten von Nesprin-TS vorgestellt, zusammen mit Strategien zum Vergleich von Daten über verschiedene experimentelle Gruppen hinweg.
Einleitung
Kraftempfindliche, genetisch kodierte FRET Sensoren sich in letzter Zeit als ein wichtiges Werkzeug für die in lebenden Zellen dehnbare basierenden Kräfte zu messen, einen Einblick in wie mechanischen Kräften über 1 Proteine angewandt werden, 2, 3, 4. Mit diesen Werkzeugen können die Forscher nicht-invasiv Bild intrazellulären Kräfte in lebenden Zellen konventionelle Fluoreszenzmikroskope. Diese Sensoren bestehen aus einem FRET-Paar (Donor und Akzeptor - Fluoreszenzproteinen, am häufigsten ein blauen und gelben Donator - Akzeptor) , getrenn....
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Protokoll
1. Besorgen Nesprin-2G-Sensor-DNA und andere Plasmid-DNA
- Erhalten Nesprin 2G-TS (Spannungssensor), Nesprin-2G HL (ohne Kopf) -Steuerung, mTFP1, Venus und TSmod aus einer kommerziellen Quelle. Propagieren alle DNA - Plasmide und reinigen , sie Standard E. coli - Stämme verwendet, wie beispielsweise DH5-α, wie zuvor 12, 13 beschrieben.
2. Transfektion von Zellen mit Nesprin-2G und anderem Plasmid-DNA
- Wachsen NIH 3T3 - Fibroblasten - Zellen zu 70-90% Konfluenz in einer 6-Well - Zellkulturschale in einem Standard - Zellkultur - Inkubator mit der Te....
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Ergebnisse
Nach dem obigen Protokoll wurde Plasmid - DNA aus der DNA - Repository erworben und in E. coli - Zellen transformierte. E. coli , den Sensor - DNA exprimieren , wurde aus LB / Ampicillin - Platten ausgewählt , und in einem flüssigen LB - Medium amplifiziert. Im Anschluss an die Amplifikation der Vektoren wurden DNA-Plasmide in TRIS-EDTA-Puffer gereinigt, wobei ein Standard verwendet, im Handel erhältliche DNA-Isolierungskits. Verwendung eines Spektrophotometers, wurde g.......
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Diskussion
Ein Verfahren und eine Demonstration der Abbildung lebender Zellen der mechanischen Spannung über Nesprin-2G, ein Protein in der Kern LINC-Komplex, wurden oben beschrieben. Vor dieser Arbeit wird verschiedene Techniken, wie zum Beispiel Mikropipette Bestrebung, Cytometry Magneten Wulst und mikroskopische Laserablation, verwendet worden , um Druck auf dem Zellkern zu übernehmen und seine Eigenschaften Schüttguts 16, 17, 18 zu me.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memoria Trust (DEC) und NIH gewähren R35GM119617 unterstützt (DEC). Die konfokale Mikroskop Bildgebung wurde an der VCU Nano Characterization Core (NCC) Facility durchgeführt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Nesprin-TS DNA-Addgen | 68127 | Von https://www.addgene.org/68127/ | |
| Nesprin-HL DNA-Addgen | 68128 | ||
| mTFP1 | DNA-Addgen | 54613 | Von https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus | DNA-Addgen | 27793 | Von https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Aus https://www.addgene.org/26021/ |
| kompetenten Zellen | abrufen Bioline | BIO-85026 | |
| Flüssiges LB-Medium | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Feste LB Bakterienkulturplatten | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spektralphotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| Quarzküvette | Biorad | 1702504 | Küvette für SmartSpec Plus |
| DNA-Isolationskit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-Well-Zellkulturschale | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-Well-Polystrene-Kulturschale |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) Zellmedien | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Rinderserum | Life Technologies | 16170-078 | |
| Serum-Zellmedien | Gibco | 31985-070 | Reduziertes Serummedium, "optimem" |
| Lipid Trägerlösung | invitrogen | 11668-019 | Lipidreagenz, "Lipofectamine 2000" |
| 1,5 mL steriles Kunststoffröhrchen | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0,25% Trypsin-EDTA (1x) |
| Mikroskopische Betrachtungsschale mit Glasboden | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Schale mit 20 mm Bodenvertiefung #1,5 Glas |
| Fibronektin | ThermoFisher | 33016015 | Fibronektin humanes Protein, Plasma |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung |
| 15 mL steriles Zentrifugenröhrchen | Greiner bio-one | 188261 | |
| Schwingrotorzentrifuge | Thermo Electron | Centra CL2 | Schwingrotor Thermo Electron 236 |
| Biosicherheitshaube für Zellkulturen | Forma Scientific | 1284 | |
| klimatisierter Zellkultur-Inkubator | ThermoFisher | 3596 | |
| invertiertes LED-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop | Life Technologies | EVOS FL | |
| Klare HEPES gepufferte Bildgebungsmedien | Molekulare Sonden | ||
| Fötales Rinderserum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Temperaturgesteuerte-invertierte konfokale Laserquellen mit 458 und 515 nm | Zeiss | LSM 710-w/spektraler META-Detektor | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasten | ATCC | CRL-1658 |
Referenzen
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dep....
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Nachdrucke und Genehmigungen
