2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine 2D-Mischmatrix, bestehend aus Gelatine und Kollagen I, und einem 3D-Kollagen-I-Plug, um lineare Invadosomen zu studieren, vorzubereiten. Diese Protokolle erlauben die Untersuchung der linearen Invadosomenbildung, der Matrixabbauaktivität und der Invasionsfähigkeit von Primärzellen und Krebszelllinien.

Zusammenfassung

Zelladhäsion, Migration und Invasion sind in viele physiologische und pathologische Prozesse involviert. Zum Beispiel müssen die Tumorzellen während der Metastasenbildung anatomische Barrieren überqueren, um durch das umgebende Gewebe einzudringen und zu wandern, um Blut oder Lymphgefäße zu erreichen. Dies erfordert die Wechselwirkung zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM). Auf zellulärer Ebene sind viele Zellen, einschließlich der Mehrheit der Krebszellen, in der Lage, Invadosomen zu bilden, die F-Aktin-basierte Strukturen sind, die in der Lage sind, ECM abzubauen. Invadosomen sind protrusive Aktinstrukturen, die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) rekrutieren und aktivieren. Die molekulare Zusammensetzung, die Dichte, die Organisation und die Steifigkeit des ECM sind entscheidend für die Regulierung der Invadosomenbildung und -aktivierung. In vitro ist ein Gelatine-Assay der Standard-Assay, der verwendet wird, um Invadosomen-Abbauaktivität zu beobachten und zu quantifizieren. Allerdings ist Gelatine, die denaturiertes Kollagen I ist, keine physiologische Matrix eLeasing Ein neuartiger Test unter Verwendung von Kollagenfibrillen vom Typ I wurde entwickelt und verwendet, um zu zeigen, dass diese physiologische Matrix ein potenter Induktor von Invadosomen ist. Invadosomen, die sich entlang der Kollagenfibrillen bilden, werden als lineare Invadosomen aufgrund ihrer linearen Organisation auf den Fasern bezeichnet. Darüber hinaus zeigte die molekulare Analyse von linearen Invadosomen, dass der Diskoidin-Domänen-Rezeptor 1 (DDR1) der Rezeptor ist, der an deren Bildung beteiligt ist. Diese Daten zeigen deutlich, wie wichtig es ist, eine physiologisch relevante Matrix zu verwenden, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ECM zu verstehen.

Einleitung

Extrazelluläre Matrix (ECM) Remodeling erfolgt während physiologischer und pathologischer Prozesse wie Angiogenese und Tumorzellinvasion. In physiologischen Bedingungen können viele Zelltypen, meist aus der hämatopoetischen Abstammung, ECM-Elemente abbauen. Zum Beispiel können Makrophagen anatomische Barrieren kreuzen, um Gewebe zu erreichen, und Osteoklasten verschlechtern die Knochenmatrix, um die Calciumhomöostase zu gewährleisten. Weltweit erneuern sich alle Matrizen im Körper, um ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften zu erhalten. In Krebsgeweben wird die Tumor-Mikroumgebungszusammensetzung verändert. Zum Beispiel bei Brust-und Lungenkrebs, Typ I Kolla....

Protokoll

HINWEIS: Vor der Fixierung werden alle Schritte in einer sterilen laminaren Strömungshaube durchgeführt.

1. 2D Matrix

ANMERKUNG: 2D Matrizen werden verwendet, um den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die Invadosomen bilden, und der Matrixabbaubereich pro Zelle.

Abbildung 1: Protokoll. Zusammenfassung des Protokolls zur Herstellung von Gelatine- und Kollagen-I-Matrizen. Es ist möglich, die Gelatine-Matrix nur oder eine Gelatine und Kollagen I gemischte....

Ergebnisse

Unter Verwendung einer Kombination von zwei Arten von Matrizen, Gelatine und Typ I Kollagen ( Fig. 1 und 4 ) haben wir eine neue Art von Invadosom, bekannt als lineare Invadosomen, hervorgehoben. Die Markierung dieser Matrizen ermöglicht die Beobachtung der linearen Invadosomenbildung entlang der Kollagen-I-Fasern und ihrer Abbaubarkeit (Abbildung 5 ). Die Anzahl der invasiven Strukturen kann dann durch das zuvor beschriebene Makro quant.......

Diskussion

Klassisch werden Invadosomen in vitro ohne Rücksicht auf die Mikroumgebung und die Matrix untersucht, auf der die Zellen plattiert werden. Mehrere Matrixarten werden derzeit verwendet, einschließlich Gelatine, Fibronectin, Vitronectin oder hochdichtes fibrilläres Kollagen (HDFC) ^{7 , 11} ; Diese sind jedoch oft nicht repräsentativ für die Mikroumgebung, in der sich Zellen befinden und nicht physiologisch relevant sind. Hier wurde ein neuartiger Matrixtyp .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gelatinelösung	Sigma	G1393	Bestand 20 mg/ml verwendet bei 1 mg/ml
Gelatine aus Schweinehaut Oregongrün 488 Konjugat	Molekulare Sondenlebensdauer Technologien	G13186	5mg bei 1 mg/ml in sterilem Wasser verdünnt
Mikroskopdeckelgläser	Marlenfeld GmbH & Co	111520	& Oslash; 12 mm Nr.1
2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer pH 7,4	Elektronenmikroskopie	Wissenschaft 15960	Bei 0,5 % in sterilem Wasser verdünnen
1x PBS pH 7,4	Gibco von life technologies	10010-015	Verwenden Sie dieses PBS in allen Schritten vor der Fixierung
Kollagen I Rattenschwanz	Corning	354236
5 Carboxy X Rhodamin Siccinimidylester	Life Technologies	C-6125
DPBS 1x + Calcium + Magnesium	Gibco von life technologies	14040-091
Paraformaldehyd 16% ige Lösung	Elektronenmikroskopie	Wissenschaft 15710	Verdünnung bei 4% in 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x PBS Puffer pH 7,4	Ambion	AM9625	Verdünnung bei 1X in Wasser Verwendung in Schritten nach Fixierung
Tks5 Antikörper	Santa Cruz	sc-30122	Invadosomenmarker Verdünnung : 1/100
Cortactin 4F11 Antikörper	Millipore	5180	Invadosomenmarker Verdünnung :1/100
DDR1 Antikörper	Zellsignalisierung	5583	Lineare Invadosomrezeptor
Verdünnung :1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrillärer Aktinmarker Verdünnung :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Nucleus Marker Verdünnung :1/200
Sekundärantikörper FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H oder FP-647H
Albumin aus Rinderserum	Sigma	A2153	Verdünnung bei 4% in 1X PBS
Fluoromount G Eindeckmedium	Interchim	FP 483331
ImageJ Software	domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Zellkultureinsatz	Corning	353097	8.0µ m Porengröße / 24 Vertiefungen
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma	221465