Denne protokollen beskriver drift av en væskestrøm prøveholder for skanning av transmisjonselektronmikroskopi av AuNPs i vann, som anvendes for observasjon av nanoskala dynamiske prosesser.
Prøver fullt innebygd i væske kan studeres på et nanonivå romlig oppløsning med Scanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM) ved hjelp av en mikrofluidkammer montert i prøveholder for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og STEM. Den microfluidic systemet består av to silisiummikrobrikker som støtter tynne silisiumnitrid (SiN) membran vinduer. Denne artikkelen beskriver de grunnleggende trinnene for utvalg lasting og datainnsamling. Viktigst av alt er å sikre at væskerommet er korrekt montert, og dermed gi et tynt væskesjikt, og en vakuumtetning. Denne protokollen innbefatter også en rekke tester som er nødvendige for å utføre under prøve lasting for å sikre riktig montering. Når prøven er lastet i elektronmikroskop, må væsken tykkelse skal måles. Uriktig montering kan resultere i en altfor tykk væske, mens en altfor tynn væske kan indikere fravær av væske, for eksempel når en boble blir dannet. Til slutt, protokollenforklarer hvordan bildene er tatt og hvordan dynamiske prosesser kan studeres. En prøve inneholdende AuNPs avbildes både i rent vann og i saltvann.
Konvensjonell Scanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM) er begrenset av omfanget av prøver som er egnet for analyse, spesielt de tørre og faste stoffer som er egnet for plassering i et høyvakuum. Men mange vitenskapelige og tekniske spørsmålene gjelder nanoskala materialer og prosesser i flytende miljø. Prøver fullt innebygd i væske kan nå bli studert med STEM bruker et begrep som innebærer en mikrofluidkammer montert i prøveholder for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og STEM en. Denne nyutviklede teknikken har blitt stadig mer populært, da det gir ny innsikt i viktige prosesser i ulike forskningstema, blant annet vekst, oppløsning, og aggregering prosesser av nanopartikler 2, 3, 4, 5, 6. Ikke bare metaller, men også biominerals 7 og biologiske systemer kan studeres 8, 9, 10, 11. Prøven lasting og bildeopptak for væskefase STEM er annerledes enn for STEM av tørre prøver og innebærer en protokoll som krever dedikert trening.
Den mikrofluidsystem består av to silisiummikrobrikker bære silisiumnitrid (SiN) membran vinduer transparente for elektronstrålen ved 200 keV energi 12 (se figur 1A). Detaljer om dimensjonene og i håndteringen av disse mikrobrikker kan finnes andre steder 12, 13. Prøven inneholder vanligvis nanoskala stedene. I denne artikkelen observerte vi gull nanopartikler (AuNPs). De AuNPs er immobilisert på toppen vinduet (med hensyn til en nedover tur elektronstråler) eller flyte i væskerid. Nanoskala romlig oppløsning i STEM oppnås ved å skanne elektronstråle over AuNPs og samle overfør spredte elektroner som bruker Ring Mørk Field (ADF) detektor 9. De to mikrobrikker er plassert i en liten spalte i spissen av væskestrømmen TEM holder en (holderen kan brukes i både STEM og TEM, men er henvist til som den TEM holderen). En av de mikrobrikker inneholder et avstandsstykke, slik at et flytende kammer dannes mellom mikrobrikker. O-ringer på begge sider av de to mikrobrikker tilveiebringe vakuum forsegling av væskerommet 13 (se figur 1B).
Målet med denne artikkelen er å demonstrere grunnleggende trinnene for utvalg lasting og datainnsamling, slik at interesserte brukere kan finne enkel tilgang til denne nye nye teknikken. Et system er tilgjengelig fra et bestemt selskap benyttes, men protokollen er også gyldig for systemer av andre selskaper. Teknikken ermer kompleks enn konvensjonell TEM og STEM, og en rekke praktiske aspekter må vurderes når du arbeider med en væske holder system 13. Viktigst av alt er å sikre at væskerommet er korrekt montert, og dermed gi et tynt væskesjikt, og en vakuumtetning. Derfor er det meget viktig å arbeide en ren, og for å hindre dannelsen av støv under fremstillingen og sammenstillingen av væskestrømmen TEM holderen. Spesielt O-ringene og de to silisiummicrochips må være fri for urenheter. Selv små partikler av støv på den ene av de mikrobrikker kan forårsake alvorlig øke tykkelsen av den sammenstilte cellen, noe som kan hindre oppnåelsen av en nyttig romlig oppløsning. Et vakuum segl er viktig slik at ingen forurensning eller skade vil bli liggende i elektronmikroskop etter forsøket. Denne protokollen beskriver lasting fremgangsmåten og flere nødvendige tester. Driften av elektronmikroskopet er grei, but det krever noen ekstra skritt i forhold til mikroskopi av faste prøver. Med økende væske tykkelser, er flere elektroner absorberes og spres av væsken; en måling av væske tykkelse er viktig. Til slutt, forklarer den protokoll hvor bildene blir tatt og hvordan dynamisk prosesser kan studeres.
Figur 1: Liquid Flow Cell for Scanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM). (A) Skjematisk illustrasjon av den sammenstilte væske cellen. To silisium mikrobrikker med silisiumnitrid (SiN) membran vinduer er plassert mellom to O-ringer. Væsken er innelukket mellom de SiN membranen, og blir således skilt fra vakuumet i elektronmikroskop. En fokusert elektronstråle skanner over prøven. Kontrast oppnås fra spredte elektroner. Gull nanopartikler (AuNPs) er immobilisert inne i væsken på SiN membranen, men kan også bevege seg ivæske. (B) Skjematisk sideriss tverrsnitt av stabelen av to mikrobrikker med O-ringer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den beskrevne protokollen gjør det mulig STEM av AuNPs i en væske, herunder observasjon av dynamiske prosesser. Monteringen av holderen er en lett-å-lære teknikken. Imidlertid må flere aspekter vurderes når du arbeider med væskestrømmen TEM holderen. For eksempel kan brutte kantene av Si mikrochip eller store partikler på O-ringene resultere i lekkasje av væske cellen. På den annen side, store partikler (> 200 nm, for eksempel, støv eller Si rusk), kan på den SiN membranen resultere i en øket tykkelse av væske celle, noe som fører til en lav bildekontrast eller til en lav romlig oppløsning og kan også føre SiN vinduer å bryte. Viktigere, kan rester av salt eller andre kjemikalier påvirke utfallet av forsøkene på en uønsket måte. Derfor er det avgjørende at de ulike trinnene i prøveopparbeidelse og holder montering utføres nøye og i et rent og støvfritt miljø.
Tykkelsen av væske cell bestemmer den oppnåelige oppløsningen, samt kontrasten av de oppnådde bildene 17. Denne tykkelse kan justeres via avstandsstykker ligger på en av de to Si microchips. Avhengig av dimensjonene av prøven, kan forskjellige tykkelser av væske celle bli realisert. For studiet av AuNPs, er det mulig å bruke små avstandsstykker (200-500 nm), mens hele eukaryote celler trenger større avstandsstykker på opp til 5 um. Tykkelsen av den flytende cellen er ytterligere påvirket av utbuling av syndmembran vinduene som følge av trykkforskjellen mellom væskecellen og det omgivende vakuum. Denne virkning blir mer utpreget med større SiN membran vinduer. Således, for å minimalisere tykkelsen av væske cellen, er det anbefalt å bruke små SiN membran vinduer. I tilfelle er det vanskelig å finne en overlapping mellom to små vinduer, kan de settes sammen i en krysset konfigurasjon ved å bruke en annen base microchip. Alternative konfigurasjoner largely hindre svulmende og består av monolittiske mikrobrikke 18 eller membran vinduer som støttes av søyler 19, men de samlings ulemper angående prøven lasting. En av de mest utfordrende sider ved dagens teknologi er mangelen på nøyaktig kontroll over væsken tykkelse. Ofte er den flytende mye tykkere enn det som er forventet fra avstandslege dimensjonene som brukes, slik det ble vist her. Flere grupper anvendes lukkede væskekamrene 4, 20, 21, 22; disse systemene har noen fordeler med hensyn til romlig oppløsning, som væsken tykkelse kan reduseres ved å fremkalle en boble i væsken. Alternativt kan synden vinduene bli tvunget til å kollapse, noe som fører til en tynnere væske lag. For det tredje finnes kabinettet av andre tynnere vinduer (f.eks graphene) 23, også resulterer i mye tynnere væskerenn hva som er mulig med systemet som beskrives i denne protokollen. Det er imidlertid umulig å strømme væske i disse systemene.
Som ved enhver høy oppløsning mikroskopi teknikk, må en rekke eksperimentelle forhold tas i betraktning. Det viktigste er samspillet av elektronstråle med væske eller prøven. I tillegg til stråleskader, noe som begrenser den oppnåelige romlig oppløsning for mange faste prøver 24, blir de væskeprøver også påvirket av elektronstråle-genererte radiolyseprodukter til 15, 25. Siden disse produktene kan påvirke forsøket, forsiktig tolking og eksperimentell design er avgjørende 26. Mikroskopet innstillinger bør velges i henhold til målene i en bestemt studie. ADF STEM er kraftigere for bildenanopartikler av et høyt atomnummer (Z) i større tykkelser av væsken celle, WHIle TEM gir bedre kontrast på lav-Z materialer og er vanligvis raskere men krever tynnere flytende lag 3. I stedet for å bruke den automatiske detektoren, er det lysfelt (BF) detektor noen ganger brukt til å avbilde den flytende cellen, ettersom BF STEM er fordelaktig for avbilding av lav-Z-materiale i tykke lag 27. Med økende tykkelse av væske cellen, blir mer strøm nødvendig. Dette øker imidlertid også konsentrasjonen av radiolyseprodukter og øker stråleskader. Det bør også bemerkes at en inversjon av kontrast observeres i ADM detektor for meget tykke væsker (> 10 um for vann).
De flytende betingelser ble endret mellom våre eksperimenter ved å fjerne holderen fra mikroskopet og utveksling av både prøven og væsken. I tillegg til å endre saltkonsentrasjon, er det lett mulig å endre andre egenskaper av væsken ved å strømme i forskjellige væsker (for eksempel kan enbruke bufferløsninger for å sette en bestemt pH 16 eller kan innføre organiske løsninger eller andre tilsetningsstoffer). Det er også mulig å skifte væsken mens holderen fremdeles er satt inn i mikroskopet ved å strømme væske gjennom mikrofluidsystem. Men i dette tilfellet, er det ikke kjent på dette tidspunkt peker væsken i prøven forandres. Det er også verdt å merke seg at mikrobrikker som støtter elektroder er tilgjengelige, så nanoelektrokjemi eksperimenter kan utføres 28.
Gjenstander av studien er ikke begrenset til AuNPs i vann, men en lang rekke prøver som kan studeres ved anvendelse av protokollen som er beskrevet ovenfor, inkludert silisiumdioksyd, titanoksyd, og polymerer. Hvis bevegelser av objekter er for rask til å fange i et bilde i oppkjøpet kan viskositeten reduseres med en størrelsesorden ved hjelp av en blanding av 50% glyserol og 50% vann.
Fra de nevnte punktene,en rekke fordeler, muligheter, og også ulemper blir tydelige. Når du arbeider med væskefase STEM, de viktigste ulemper å vurdere er at: 1) noen eksperiment er påvirket av det dynamiske samspillet mellom elektronstråle med hele prøven (objektet under observasjon, væsken, og synden membraner); 2) prøvehåndtering er langtekkelig, og det er ofte vanskelig å oppnå et tynt væskelag fordi prøven eller mikrobrikker inneholde noen mikrometer-store partikler; 3) den flytende tykkelse varierer vanligvis i stor grad fra den tiltenkte tykkelsen er fastsatt av avstandsstykket; og 4) romlig oppløsning og kontrast sterkt avhengig av den flytende tykkelse og forskjellen mellom forandringen tettheten av gjenstanden under observasjon og væsken.
I dag, rikelig metoder finnes for mikroskopi av objekter i væske med nanometer romlig oppløsning. Elektronmikroskopi i amorf is er en kraftfull teknikk 29,men de involverte eksperimentelle prosedyrer er skjøre, ikke alle forsøkene tillate fremstillingen av prøven i is, og tidsoppløst eksperimenter er umulig. Røntgen mikroskopi 30, 31 kan i prinsippet anvendes, men det har en begrenset romlig oppløsning og ikke er allment tilgjengelig i laboratorier. Atomkraftmikroskopi i væske har blitt etablert, men er en overflate teknikk bare 32, 33, 34, 35. Lysmikroskopi oppviser ikke tilstrekkelig rommessig oppløsning. På det nåværende, elektronmikroskopi i flytende synes den mest kraftfulle teknikk for direkte mikroskopi av nanoskala objekter og prosesser i væske.
Væskefase TEM og STEM ennå ikke er rutine analytiske teknikker, men er fortsatt under utvikling. Antallet parametere for å ta i betraktning er betydelig, og det er Often vanskelig å reprodusere eksperimentelle resultater. Videre er kvantitative data vanskelig å oppnå fordi de virkninger under gransking henger sammen med prosesser som skjer som et resultat av elektronstrålen. Protokollen er beskrevet her tar sikte på å standardisere forsøksprotokollen, hvorved sto for alle aktuelle base aspekter av forsøket. Vi håper at denne protokollen vil føre til bedre reproduserbarhet av eksperimentelt arbeid i dette nye feltet.
The authors have nothing to disclose.
We thank E. Arzt for his support through INM. The research was in part supported by the Leibniz Competition 2014.
Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
Chemicals | |||
Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
Materials | |||
Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
(Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
Clean room tissue Sontara Micropure AP (224x224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |