Summary
複雑な環境における心血管運動と刺激的な経験は、げっ歯類の脳内の神経可塑性の複数のメジャーにプラスの利点を持っています。この記事では、車輪走行と環境の複雑さを組み合わせ、これらの介入の制限に対処します」superintervention」としてこれらの介入の実装について説明します。
Abstract
有酸素運動（広く動物実験で使用される例えば 、ホイール実行（WR））、そのような大人の神経新生、血管形成、およびげっ歯類における神経栄養因子の発現率などの脳内のneuroplasticポテンシャルの積極的な影響多くの対策、。この介入はまた、げっ歯類における催奇形（アルコールすなわち 、発達の暴露）及び年齢に関連する神経変性の負の影響の行動と神経解剖学的側面を軽減することが示されています。環境の複雑さ（EC）は、皮質および皮質下構造における多数neuroplastic利点を産生することが示されており、成人の海馬における新しい細胞の増殖および生存を増加させるために、車輪走行と結合することができます。これら二つの介入の組み合わせは、神経疾患の齧歯類モデルの範囲で実現することができる堅牢な「superintervention」（WR-EC）を提供します。私たちは、WR / ECおよびその構成要素の実装について説明しますヒトにおけるアルコールへの出生前暴露の動物モデルを用いて、ラットにおけるより強力な治療的介入として使用するためのterventions。また、介入のために絶対に必要であり、どれが実験者の質問や設備に応じて変更することができる手順の要素について説明します。
Introduction
異なる環境で飼育すると、長い神経健康の様々な測定の変化を引き起こすことが知られています。多くの研究は、ダイヤモンドとローゼンツヴァイク（ 例えば 、によって画期的な研究を開始する複雑な環境（EC）で飼育の有益な効果を見て 1、2）、グリーノー （ 例えば 、3、4）。 ECは、脳5、6、7におけるシナプスおよび細胞変化に紛れもないプラスの効果があることが実証されています。 ECは、同様に、海馬8,9および視覚野10、11、腹側線条体12、13を含む脳の領域の多数に影響を与えることができます脳全体の神経免疫機能として（14件）。特に注目は、それがECは、樹状可塑9、13を介して歯状回の成人生まれの顆粒細胞の生存率を増加させることができることが実証された海馬の研究から開発してきました。この最後の点は、原因心血管運動の両方が健康で損傷した脳15、16、17、18に大人の神経新生を促進することを示す文献の成長体に多くの関心を集めています。 （WR）を実行しているホイールは、神経障害または加齢17のげっ歯類モデルにおいて有益であることが示されている自発的心血管活動の形式、19、20を実現することは容易です。 WRは、成長因子の発現に影響します両方の中枢および末梢神経系21、22、23インチ
「superintervention」（WR-EC）に（その後）WRとECを組み合わせる（ すなわち 、ECで30日間続いWRの12日間）は、海馬成体の神経新生における堅牢な増加と新たに増殖した細胞8の生存の増加を提供し、 FASDの動物モデルにおいて、個々の成分によって達成されていない効果（下記参照）。 WR-ECの両方の成分が脳13（22に総説WR、24で検討EC）内の構造の多様な配列に影響を与えるので、この介入の実装が容易に神経学の両方の発達とその後の人生発症モデルのげっ歯類モデルに適用することができ障害（ 例えば 、新生児のアルコール暴露、老化、早期の生活上のストレス）。
NT ">思春期や青年期の期間（ すなわち 、生後日30から72）は中WR-ECの統合胎児アルコールスペクトラム障害のラットモデル（FASDs）の負の効果のいくつかを改善することができる8研究しているのコレクション。げっ歯類は、樹状の複雑さ25、小脳発達26、27および神経免疫応答28だけでなく、学習障害やメモリ29の症状、30、31のような神経解剖学的措置で9表示著しい赤字を通じて生後日（PD）4からアルコールにさらされていることを実証しましたいくつかの構造はもはやSIGを見なかった。この時間ウィンドウ内のアルコール暴露のさえ減少量（ すなわち 、9を通じてPD 7）は、青年期と成体ラット32における学習および記憶の欠損につながることができますnificant神経解剖学的障害27。海馬依存タスクにおける行動障害に加えて- -これらの赤字の多くは、このWR-ECパラダイム8、33または単独のWR 25、31への曝露後に緩和されてきました。単独WRが広く用い介入してきたが、WR-ECの組み合わせはまだWR 8の比較的短期の利益を維持する能力にもかかわらず、文献で利用されていません。この記事では、青年期にWR-ECの介入の実装について説明します。このパラダイムは、出生後早期のアルコール暴露に関連して使用されるが、脳障害のモデルにおける神経可塑性のために、脳の可能性を評価するために、種々のげっ歯類モデルに導入することができます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
倫理声明：以下のプロトコルは、デラウェア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。
1.発達暴露（またはどんちゃん騒ぎのようなエタノール曝露のモデル）
- PD3に、各動物の性別を決定し、産子数（8匹）および性別分布（雄4：4人の女性）を保持するために、必要に応じて任意の動物をクロス育成各ごみ内で一貫し。
注：実験的な交絡を避けるために、可能な限り一貫性の産子数や性別分布を維持することが重要です。このプロトコルはゴミあたり8仔（4人の男性と4人の女性）を使用していますが、代替のごみのサイズや性別分布は実験計画のニーズに合わせて調整することができます。 - 皮下各ごみの中に動物を識別するために、足に黒墨の少量を注入します。
- 擬似ランダム実験（含む50％アルコールに露出（AE）としてリットルと50％の偽挿管制御（SI）子犬を割り当てますS）または乳を飲むコントロール（SC）（PD 4から任意の挿管、テールクリッピング、または分離プロトコルを受けない動物 - 毎日）計量し、耳パンチを除く9。
- 一貫性のあるグループのサイズを保持するには、SCの同腹の2倍の実験リットルを割り当てます。
- そのホームケージに戻した後、各動物を計量。計量動物は挿管期間（ - 9 PD 4）の間、毎日発生する必要があります。
- ダムからの全体のゴミを取り除きます。
- 加熱されたパッドの上に子犬を置きます。
- 各個々の子犬の重量を記録します。
- PD4に、各動物を秤量した後、各動物あたり5.25グラム/ kg /日の合計に必要なアルコールの量を算出する（ステップ1.4からの子犬の重量に基づく）8。
- 11.9％エタノール・イン・ミルク代替（体積/体積）などのアルコールを管理します。
- 午前9時から開始し、一度に母親から1ごみの子犬を削除します。
- 各AEの子犬にエタノール・イン・ミルクの管理
- 各SI子犬8を模造挿管。
- 繰り返しは、1.5を繰り返します。 1.8を通して。各実験ごみ用。
- 最初の投与後の二時間は、第二アルコールの用量について（1.8を通じて1.5ステップ）投与手順を繰り返します。
- 第二アルコール量（ピーク毎日血中アルコール含有量が達成される時点）後の1時間半、収集し、AEとSI仔から遠心血液尾を経由して 、将来の血中アルコール含量分析35のためにクリッピング。
- 血液の60μLを収集します。
- 1 mLのマイクロ遠心チューブに血液を置きます。 25分間の1.5×gで遠心血液。
- 慎重に遠心管からの上清血清を収集し、今後の血中アルコール含有量の分析のために保存します。
- AEでの看護ができないことから、栄養障害を防止するために、エタノール中のミルクの代わりに牛乳を使用して投与手順（1.8乃至ステップ1.5）を繰り返します子犬。
- PD 4に2時間間隔で2補足ミルク用量の合計を実行します。
- 9 - 繰り返しはPD 5に（ステップ1.11を除く）1.12を介して1.4を繰り返します。
- PD9の最後の補足ミルク投与後、耳がECケージに識別のためのすべての子犬をパンチ。
- ごみ番号または識別子のいくつかの尺度でパンチ耳を座標（偶数番号リットルから動物は彼らの右耳が殴らだろうが、例えば 、コホート内の奇数リットルが自分の左耳パンチになるだろう）。これは、簡単に別の同腹仔からの複数の動物が同じpawmarkパターンを持っている必要があり、ECケージに動物を識別するために行います。
2.離乳
- 3から2のケージでPD 23、家の上のすべての動物。
- 同じケージに収容されたすべての動物は同性であることを確認してください。
- 1つのSC、1 SI、およびケージ当たり1 AE動物可能性が含まれます。
- ケージの仲間番目の数を最小限に抑えますで同じゴミからです。
- すべての動物が食料や水にアクセスすることが可能であることを確認します。
3.ホイールランニング
- PD30には、WRに動物とケージの半分を割り当てます。ハウス添付のステンレス鋼の走行輪への無料アクセスを持つケージでこれらの動物。
- 車輪が総回転数を評価するためのカウンタを持っていることを確認してください。
- PD 30とPD 36上のすべての動物を計量します。
- 毎日午前9時に各車輪の回転数を確認してください。
- 12日間、それぞれの住宅条件の動物を残します。
4.環境の複雑さ
- 実験動物用のPD 42に相当する日には午前9時前にECケージを準備します。
- 30 "×18"×36 "亜鉛メッキ鋼製のケージを取得します。
注：ケージは、複数のレベルを有する複数のラットの重量を支持することが可能で、標準で満たされるべきです寝具、水のボトルや食品のディスペンサーを取り付けるための複数の場所にしています。 - 小説、ケージ内の可変サイズや形状のカラフルなオブジェクトを配置します。
- ECケージに6大きなおもちゃを置きます。各おもちゃは同時にと相互作用する3以上のラットのために十分な大きさであることを確認してください。
- ECケージに6媒質おもちゃを置きます。同時にと対話するための4匹のラット - 各玩具は3のために十分な大きさであることを確認してください。
- ECケージに小さいおもちゃの多く（少なくとも20）を配置します。
- （説明を参照してください）ノベルティは、この介入に極めて重要であるなど 、様々な色、形、大きさ、のおもちゃを使用します。
- ケージの両端に食品の2皿を置きます。
- ケージの両端に水のボトル2本を置きます。
- 30 "×18"×36 "亜鉛メッキ鋼製のケージを取得します。
- PD 42上の午前9時、すべての動物を計量し、ECケージにWR動物を変えます。 12匹の動物 - 各ECケージは9を含める必要があります。
- 何の動物が同じpawmarkと耳しゃれの両方を持っていないことを確認しますchのパターン。
- すべての食品や水の毎日を確認してください。
- 2日毎に、ECケージからおもちゃを削除し、それらを交換する（ステップ4.1.2に従います。）。
- 3日ごとに、ECケージを掃除。
- ECケージから動物を削除し、2の一時保持ケージに入れて - 3匹の動物。
- ケージの底から寝具のすべてを削除します。
- この日は、おもちゃの交換スケジュールと一致していない限り（ステップ4.4に従った。）ケージに同じおもちゃを返します。
- 食料や水のすべてを交換してください。
- ECケージにラットを交換してください。
5.組織を収集
注：組織コレクション（ 例えば 、パラホルムアルデヒドで灌流）とストレージ（ 例えば 、凍結、パラフィン包埋）は、様々な方法で行うことができます。以下に、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で4％パラホルムアルデヒドで灌流する工程を説明します）液8。
注意：パラホルムアルデヒドは発がん性であり、また、皮膚の炎症、アレルギー性皮膚反応、または目の損傷を引き起こす可能性があります。適切な眼/皮膚の保護を使用してください。
- 軽く動物を麻酔するためにイソフルラン一度に一匹のラットを公開します。
- 腹腔内ケタミン/キシラジン混合物（ケタミンを10mLと混合し1.5 mLのキシラジン）を2mL / kgのラットを注入します。
注：ケタミンおよびキシラジンは、注射液のために組み合わせる前には100mg / mLのストック濃度で両方です。 - （;てpH = 7.2 PBS）、PBS中の4％パラホルムアルデヒド液（pH = 7.2）に続いて、ラットに0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水で動物を灌流、もはや応答して一度。
- 48時間4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒドで脳とストアを削除します。
- 2日後、30％スクロース溶液に移し、4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒドを添加しました。
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Representative Results
興味のある施策について - WRとEC - スーパー介入の効果を評価するために、我々はその構成要素のそれぞれの効果を見なければなりません。 1〜3（下記） の図は、このパラダイム8を利用して 、以前の出版物に登場しました。 図4は、博士論文36で登場しました。これらのデータは、歯状回における海馬成体の神経新生にWR-ECの影響を示しています。すべてのグラフは、平均値から単一の標準誤差を示すエラーバーで、グループの手段を説明します。 図1は、WRの成分は、通常、開発中の海馬のDGにおける細胞増殖を増加させるロバスト可能であることを示し、我々の介入のWR部以下の細胞増殖の増加を示して、早期寿命がストレス、アルコール曝露動物。 図2新生児ストレスまたはアルコールのいずれかに曝露した動物におけるDG成人発生する細胞の生存を増加させるためのECの能力を示します。 図3は、WR-ECはへの治療薬として、それが関与し、アルコールや挿管ストレスに新生児の暴露を受けた動物における成人生まれの歯状回顆粒細胞の増殖および生存を増加させることができることを示し、神経表現型に分化する細胞の増加を示しています海馬成体の神経発生における救助赤字。最後に、 図4は、樹状可塑性WR-ECの効果を確認していない：AEラットの歯状回「顆粒細胞のダブルコルチン陽性樹状突起の長さは、もはやコントロールとは異なります。 PD 4上の血中アルコール濃度（BAC）は、この露光パラダイム28、37を使用して、他の研究に匹敵する、321.19±14.03ミリグラム/デシリットル（平均±SEM）でした。以前の研究では、動物Aことが実証されていますこれらの治療群は、WR 15中に実行距離に違いはありません渡ります。
図1. WRがロバスト海馬DGにおける細胞増殖を増加させます。顕微鏡写真は、WR（A）及びソーシャルハウジング（B）以下のPD42のDG（WRの停止）AE動物におけるブロモデオキシウリジン（BrdUの）で標識されたとして、細胞の増殖における差異を示します。 WRは堅牢にかかわらず、新生児治療（C）の細胞増殖でを増加させます。 ANOVAは、出生後の治療（AE 対 。SI 対 SC）または相互作用の有意な主効果が、住宅事情（SH 対 WR）（F 1,40 = 19.703、P <0.001）の主効果を明らかにした双方向二つの要素の間で観察されました。事後比較はTukeyの試験として行きました。すべての値はrepre平均±平均の標準誤差（SEM）を送りました。 * P <0.05、＃P <0.01。この図は、ハミルトンらから再生されています。 2012年8。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
新生児アルコール暴露またはシャムストレス後の細胞の生存におけるEC救助赤字が続き図2. WR。顕微鏡写真は、WR-EC（A）と、PD41にBrdUを注射し、社会的に収容された条件（B）からAE動物にBrdUで標識された細胞における差異を示します。社会的に収容された動物は、コントロールが乳を飲むために相対的なアルコール暴露後の減少を示しました。 WR-ECのsuperintervention表示を受けた動物は、PD4後に増殖細胞の生存率を増加させ両方SI及びAEグループ（C）1。 2ウェイANOVAは、住宅事情（SH 対 WR）（F 1,29 = 11.402、P <0.01）および出生後の治療とハウジング条件の間に有意な交互作用（F 1,29 = 3.870、Pの主効果を明らかにしました< 0.05）、出生後の処置（AE 対 SI 対 SC）の有意な主効果が観察されませんでした。 SH動物内の一方向ANOVAはWREC動物内のANOVAは、出生後の治療の間に有意差は認められなかった一方通行一方、出生後の治療の主効果（F 1,19 = 3.727、P <0.05）を明らかにしました。事後比較はTukeyの試験として行きました。すべての値は平均値±SEMを表します。 * P <0.05、＃P <0.01。この図は、ハミルトンらから再生されています。 2012年8。 このfiguの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。再。
新生児アルコール暴露またはシャムストレスに続いて神経発生における図3. WR-EC救助赤字。海馬顆粒細胞中のBrdU（緑）の発現とのNeuN（赤）の共局在。蛍光共焦点画像は、免疫組織化学的手順に従って得ました。 BrdUのは、組織がPD72に収集されたPD41に注入しました。 BrdU及びNeuNの両方がDGで観察された（A、B）。 SCの動物が増殖して神経細胞の数の有意な増加を示さなかったが、AEとSIの両方の動物が社会的に収容された動物（C）と比較して、WR-ECパラダイム次（のBrdUとNeuNのとの二重標識によって示されるように）神経新生の増加を示しました。 ANOVAは、有意な主EFFEながら、住宅の条件（SH 対 WR）（F 1,28 = 20.48、P <0.001）の主効果を明らかにした双方向出生後の処置（AE 対 SI 対 SC）、またはこの2つの因子間の相互作用のCTが観察されました。事後比較はTukeyの試験として行きました。すべての値は平均値±SEMを表します。 * P <0.05、＃P <0.01。この図は、ハミルトンらから再生されています。 2012年8。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
海馬DG顆粒細胞の樹状の複雑図4. WR-EC救助赤字。 Shollは、樹状交差点の分析は、新生児アルコール暴露後の成体ラットの歯状回における樹状複雑にWR-ECの改善効果を示しています。社会住宅事情では、AEの動物はDGの顆粒細胞数の減少を持っています動物を制御するために相対的な樹状突起の交点（A）。 WRECの住宅は、社会的に収容されたコントロール（B）に比べてAE動物における交差点の数を増加させます。私たちのWRECパラダイムで飼育AE動物はWREC（c）に収容された動物を制御するために相対的な交差点の同様の番号を表示します。反復測定ANOVAを各グラフのデータに行きました。パネルaは、出生後の治療の主効果（F 1,11 = 6.265、P = 0.029）を示しています。パネルbは、住宅事情（F 1,6 = 4.181、P = 0.087）との間の主効果の傾向を示しています。パネルcはWRECハウジング条件内のSCとAE動物の間で有意な差を示しません。すべての事後比較はTukeyの試験として実施しました。すべての値は平均値±SEMを表します。 ^ P <0.01、* P <0.05。この図は、ハミルトン、2012年36から再生されています。pgの "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
上記のプロトコルでは、我々は、新生児のアルコール暴露後の神経解剖学的赤字を救うために好都合な介入を実証しました。この介入は、介入の各構成要素の堅牢性のために他の動物モデルにおいて治療薬として使用することができます。 WRの形態における自発的心血管活動は、いくつかの行動の結果38、39の利益や、（40に概説）海馬などの脳領域における機能プラスチックの変化を誘導することが示されています。これは、成長因子およびげっ歯類およびヒト21の両方で脳実質中の他の神経保護のメカニズムの発現、41に部分的にあります。これらの効果を補う、ECは、有益な細胞の6、11、42、43を誘導することができます、構造2と12薬理、げっ歯類で44変化。
動物は、機能的な走行輪への自発的なアクセスを有することWRは、ヒト症候群のこの特定のモデルにおいて最大限に有効であるために、それは重要です。毎日のホイールへのアクセスは時間45の延長量のために一日あたり少なくとも10〜12時間、好ましくは24時間（走行輪からの撤退のいくつかの副作用が報告されていました）持続させるべき。このWRパラダイムは、青年期と成人期初期に収まるようにWRとECとの組み合わせを可能にするために、12日間続きます。 （他の要因の中で）運動の持続時間、被爆時年齢、およびモダリティは、治療的介入46として運動の有効性に影響を与える可能性があり、このプロトコルまたは任意の他のWRECパラダイムを実装することを計画したときに、このような重要な要因が考慮されるべきです。このECパラダイムの重要な構成要素はnoです（14、47に見直し）環境で複数のオブジェクトと社会的相互作用のvelty。したがって、それは48時間毎に交換するには、このパラダイムの項目のために重要です。複数の項目の必要性、項目とその探査、および社会的相互作用との相互作用に基づいて、私たちは私たちのユニークなアイテム数、アイテムの交換頻度、およびケージの仲間の数は神経解剖学的措置についての治療結果を誘導するのに十分であることを見つけます私たちは評価していること。我々は、30日間の連続曝露は、新規な環境に限定露光相互作用より新生児のアルコール暴露によって誘発される欠損を克服するために、より適切であることを見出しました。
このプロトコルの目的は、心血管運動とプラスチック介入の環境新規性の両方のコンポーネントに対処するWRECパラダイムを導入することです。このような理由から、我々はparadigにすることができるの変更に対処しますメートルしかし、動物はパラダイムと同様に描画することができ、実験の結論内で相互作用の方法を変更することができる修飾の使用を警告することになります。一つの可能な変更は、EC環境に車輪を実行しているの導入であろう。その際、各成分の相対的な寄与を決定することは困難であろう。一緒にECのために必要とされる10匹の動物 - さらに、すべての動物がWRコンポーネントおよび8の筐体としてのパラダイムのECコンポーネントの両方に参加することを保証することは困難です。 （このプロトコルのメソッドは、堅牢な神経解剖学と行動の意味合い8を示しているが、33）しかし、運動への長期的なアクセスは、この介入45の有効性において重要であるので、さらなる研究は、ECへのアクセスへのWRアクセスの最適な比率に対処することができます。 EC環境内で使用される個々の項目への変更は許容されるが、それはcriticaですアイテムのためのlは、興味深い、複雑な、新規で刺激し、頻繁に14をリフレッシュします。
このパラダイムは、この「スーパー介入」を実装することを計画する際に考慮すべき私たちの手にいくつかの生来の制限が含まれていません。パラダイムのWR成分の1つの制限は、個々の動物によって実行距離を評価することができないことです。明白かつ簡単な解決策の一つは、WRのコンポーネントの間に動物の個々の住宅であろう。しかし、それは個々の住宅が広く動物に有害であるとして受け入れられ、さらには直接車輪走行48の有益な効果を打ち消すことができることを強調する必要があります。追加の代替は（時間がかかり、不完全ではあるが）ビデオレコードに動物がアクセス権を持っていることを常に走行輪になります。これは例えば 、独特の色やパットを描く（ケージ内に各動物の一意の識別子を必要とします各動物の毛皮にRNS）49。この技術はまだ同時にホイールを利用し、複数の動物の交絡の対象となります。同様の困難さは、それが（食物消費の期間を制限することなく）個々の動物を制限食品することが困難になるECに運びます。この影響を低減するために、我々は、即時の食事制限パラダイムに続く完全な30日間のECの住宅をお勧めします。 ECのうち、時間の拡張量は、このパラダイムの間に発生する誘起塑性を阻害することができました。
前述したように、この記事の重要性は、WRの形で心血管運動、次のECパラダイムとその実装の一貫性の特徴付けを可能にすることです。前ECパラダイムはWR 12、50、時間51の短い量のECケージの内側WRに触れることなくECハウジングに動物を暴露されています以下の動物52、または動物とケージ項目13のより少ない頻度の変化と時間の長い量のため、EC環境にさらされました。 ECの有益な効果は、長期的利益を示すために時間的に関連する時間窓内でWRから誘導された可塑性を必要とする可能性があります。このように、我々は、それぞれ12および30日間WRとECとを結合することは最大限に有益かつ簡潔な介入を可能にすると信じています。
この時点で、このモデルの使用は、思春期及び青年期の期間に限られていました。異なる段階で、この介入の堅牢性、およびneuroplastic利益の個体発生のさらなる検討は、今後さらに検討する必要があります。これは、このような障害に罹患した個人のための効果的な治療的介入の開発を支援するようさらに、異なる発達障害の使用は大いに奨励されています。前の文献は解除しました大人の神経新生、学習と記憶、または不安53の遺伝的マウスモデルにおいて不安様行動上のWRまたはECの独立した効果をmonstrated。これら二つの介入の堅牢性とECの相乗効果が大きくWR誘発性の利点（ すなわち 、海馬の細胞増殖および神経発生）、それはよく研究課題の多様な範囲への統合のための態勢を整えて作るの短期的影響を維持します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female Time-pregnant Long Evans Rats | Envigo (Formerly: Harlan, Inc.) | Average litter size is 8 - 10 pups | |
| Black India Ink | Higgins (Chartpak, Inc.) | 44201 | |
| Syringes and Injection Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | Assorted | For injection of pawmarking ink, administration of milk-alcohol solution |
| Ear Punch | Kent Scientific Corporation | INS750076 | |
| Running Wheels | Wahmann Labs | Wahmann Running Wheel is discontinued. One per cage. | |
| EC Cage | Martin's Cages, Inc. | R-695 | |
| Small EC Toys | Assorted | ||
| Medium EC Toys | Assorted | Should be able to fit 1 - 2 rats inside of/on top of object | |
| Large EC Toys | Assorted | Should be able to fit 3 or more rats inside of/on top of object |
References
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