Identifizierung von Fettsäuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

Zusammenfassung

Wir schlagen ein Protokoll vor, um Fettsäuren zu identifizieren, ohne sie reinigen zu müssen. Es kombiniert Informationen über die Retentionszeiten mit den Massenspektren von drei Arten von Fettsäurederivaten: Fettsäuremethylester (FAMEs), 4,4-Dimethyloxazolinderivate (DMOX) und 3-Pyridylcarbinylester (Picolinyl).

Zusammenfassung

Die Bacillus - Arten enthalten Kette und ungesättigte Fettsäuren (FAs) mit unterschiedlichen Positionen der Methylverzweigung verzweigten (iso oder anteiso) und der Doppelbindung. Änderungen in FA Zusammensetzung, die eine entscheidende Rolle bei der Anpassung der Bakterien an ihre Umgebung zu spielen. Diese Modifikationen beinhalten eine Änderung in dem Verhältnis von iso gegen anteiso FAs verzweigt, und der Anteil an ungesättigten FAs relativ zu gesättigten FAs mit Doppelbindungen an spezifischen Positionen erstellt. Genaue Identifizierung des FA Profil ist notwendig , um die Anpassungsmechanismen von Bacillus - Spezies zu verstehen.

Viele der FAs von Bacillus sind nicht im Handel erhältlich. Die vorgeschlagene Strategie identifiziert hierin FAs von Informationen über die Retentionszeit (Berechnung der äquivalenten Kettenlänge (ECL)) mit den Massenspektren von drei Arten von FA-Derivaten kombiniert: Fettsäuremethylester (FAME), 4,4-Dimethyl-oxazolin Derivate (DMOX) und3-pyridylcarbinyl Ester (Picolinyl). Diese Methode kann die FAs ohne die Notwendigkeit erkennen, das Unbekannte FAs zu reinigen.

Vergleichen chromatographischen Profile von FAME hergestellt aus Bacillus cereus mit einem handelsüblichen Gemisch von Standards ermöglicht die Identifizierung von geradkettigen gesättigten FAs, die Berechnung der ECL, und Hypothesen über die Identität des anderen FAs. im Vergleich zu linearen gesättigten FAs mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen FAMEs verzweigter gesättigter FAs, iso oder anteiso, in der ECL, eine konstante negative Verschiebung anzuzeigen. FAMEs ungesättigter FAs kann durch die Masse ihrer Molekülionen, und führen zu einer positiven Verschiebung der ECL im Vergleich zu den entsprechenden gesättigten FAs detektiert werden.

Die Verzweigungsposition von Fas und die Doppelbindung Position von ungesättigten FAs kann durch die elektronen Ionisations-Massenspektren von Picolinyl und DMOX Derivate bzw. identifiziert werden. Dieser Ansatz identifiziert die unbekannten gesättigten Zweiged FAs, ungesättigte geradkettige FAs und ungesättigte verzweigte FAs aus dem cereus Extrakt B..

Einleitung

Fettsäuremethylester (FAME), Gaschromatographie (GC) ist ein wesentliches Verfahren zur Lipid Charakterisierung. Sie trennt sich rasch und quantifiziert die verschiedenen Fettsäuren (FAs) einer Probe nach einer kurzen Extraktionsschritt. Derivate von Methylester sind sehr volatil, stabil und inert gegenüber der chromatographischen Säule, wodurch vermieden wird Tailing Spitzen. Ihre Identifizierung ist ziemlich einfach, wenn die Probe von bekannten FAs besteht, weil die chromatographischen Profile entweder veröffentlicht oder im Vergleich zu Standards. Darüber hinaus ist die wiederholte Injektion von Kalibrierungsstandards zur Quantifizierung verschiedener FAs nicht erforderlich, da die fast konstante Reaktion auf Flammenionisationsdetektion (FID) ^1.

Neben FID stellt Massenspektrometrie (MS) Detektion einer komplementären Reihe von Informationen zu FAME bestätigen. Wenn jedoch FAMEs berechnet werden unter Verwendung Elektronenionisation (EI), die resultierenden Spektren erlauben nicht immer für the Identifizierung von FA Feinstruktur. Beispielsweise Verzweigungsposition (dh eine verzweigte Methylgruppe) ist schwer vorherzusagen , da die diagnostische Ionen schwer ¹ und die charakteristische Änderung Ionenabundanz in Ziel zu erfassen ist maschinenabhängig, was die Verwendung von Massenspektren Bibliotheken ² verhindert wird . Eine weitere Herausforderung liegt in der Doppelbindung Position zu identifizieren, weil EI-Doppelbindung Migration verursacht. So FA Isomere mit Doppelbindung Positionen unterschiedlicher nicht durch ihre Massenspektren unterschieden werden. Glücklicherweise andere Werkzeuge wurden für FA Identifikation entwickelt. Zum Beispiel kann die Anwesenheit und die Position oder der Doppelbindungen in FAs Verzweigungs kann durch Berechnen der äquivalenten Kettenlänge (ECL) ³ gemutmaßt werden.

Andere Derivatisierung Verfahren führen zu unterschiedlichen Massenspektren, abhängig von der Position einer Doppelbindung oder einer verzweigten Methylgruppe ist. 4,4-Dimethyl oxazolinderivaten (DMOX) ⁴ ermöglichen easy Identifizierung der Position der einfach ungesättigten Fettsäure-Doppelbindungen. 3-pyridylcarbinyl ester (Picolinyl ester) Derivate zur eindeutigen Identifizierung der Lage von Methyl ermöglichen verzweigten FAs ^5. Kombination von chromatographischen Retention (ECL) und Massenspektren (DMOX und Picolinyl) Information erlaubt die Identifizierung der meisten FAs ohne die Notwendigkeit , komplexe Reinigungsverfahren zu verwenden, wie ¹ für die Kernspinresonanz (NMR) -Spektrum, das unhinterfragbares Methode zur strukturellen Charakterisierung erforderlich .

Bakterien der Gattung Bacillus, die einige menschliche und tierische Pathogene umfassen, können sehr unterschiedliche Nischen zu kolonisieren und werden daher in der Umwelt weit ⁶ verteilt. Unter der Gattung Bacillus, der Zusammensetzung FA durch die ökologische Nische der Spezies mit Modulationen in FA Muster beeinflusst zu einem breiten Spektrum von Umgebungsänderungen (zB Wachstumsmedium, Temperatur, anzupassenpH, etc.) ^7-9. Aufgrund der relativen Homogenität des FA Muster über Spezies der Gattung Bacillus während des Wachstums in standardisierten Bedingungen, Bestimmung der FA Zusammensetzung ist eines der wesentlichen Kriterien verwendet , um die Bacillus - Arten definieren. Ein einzigartiges Merkmal der Gattung Bacillus ist die Fülle an verzweigtkettigen FAs enthält 12-17 Kohlenstoffe ^10-12 mit dem Verhältnis zwischen iso und anteiso Isomere ein wichtiger Faktor für die Anpassung an Umweltbedingungen zu sein. Bacillus species anzupassen auch gegenüber Umweltschwankungen , indem der Anteil an ungesättigten Fettsäuren zu verändern. In einigen Arten, wie Bacillus cereus, zwei Fettsäure-Desaturasen schaffen Doppelbindungen in unterschiedlichen Positionen der Alkylkette ¹³ mit unterschiedlichen Rollen in Anpassung ^9. Das Beispiel des Bacillus genus veranschaulicht die Bedeutung der eben die Doppelbindung Position zu identifizieren und FA Verzweigung. Sammelnhungsweise, hat Identifizierung von Bacillus FA Muster mehrere nützliche Anwendungen. Hier schlagen wir eine neue GC-MS - Ansatz für Bacillus FA Mustererkennung, die die inhärenten Grenzen eines klassischen GC-MS - Analyse überwindet.

Dieser innovative Ansatz kann direkt auf rohen biologischen Material verwendet werden, und besteht aus einer Kombination von bestehenden Techniken: Informationen über die Retentionszeiten (ECL) und Massenspektren verschiedener FAs Derivate (FAME, DMOX und Picolinyl-Ester).

Wir verwenden die folgende FA-Nomenklatur. i, a und n iso anzuzeigen, verzweigten anteiso Methyl und geradkettige Fettsäure, respectively. Ungesättigte FAs wurden durch C genannt: d, wobei C die Zahl der Kohlenstoffatome in der Fettsäure ist und d die Anzahl der Doppelbindungen ist. Δ ^x gibt die Position der Doppelbindung, wobei die Doppelbindung auf der x - ten Kohlenstoff-Kohlenstoff - Bindung befindet, von der Carbonsäure Ende zählen.

Protokoll

1. Bakterienkulturen

1. Bereiten Sie einen Rasen der Bakterien (Bacillus cereus Stamm ATCC 14579) durch Spreizen 100 ul einer Übernachtkultur des bei 30 ° C inkubiert Stamm in LB (Luria-Bertani - Medium), über die Oberfläche einer Platte von LB - Agar - Medium. Die Platte über Nacht bei 30 ° C.

2. ECL: Entspricht Kettenlänge

1. Berechnen ECL wie folgt: mit:
   i, der gelöste Stoff von Interesse;
   n die Kohlenstoffzahl der geradkettigen gesättigten Fettsäuremethylester vor solute Eluieren I;
   n + 1, die Kohlenstoffzahl der geradkettigen gesättigten Fettsäuremethylester nach solute Eluieren I;
   RTI, Rtn, Rt (n + 1) die Retentionszeiten der FAME-Spitzen oben beschrieben.
   HINWEIS: Erhalten der Retentionszeiten von geradkettigen gesättigten Fettsäuren Methylester durch Injektion einer Mischung von Standards (BEIN ICH).

3. FAME Herstellung und Analyse

1. Um Lipid Fettsäuren, Ernte Bakterienzellen zu erhalten , indem Kolonien von der Agar - Platte und übertragen 40 mg (Frischgewicht, das entspricht 10 ⁹ lebenden Zellen) von Bakterien in einem 10 ml Glasröhrchen mit Schraubverschluss und PTFE - Dichtungen Schaben.
2. Führen Sie die Umesterung über die Esterbindung Methode ^14,15 unten detailliert beschrieben.
   1. 5 ml 0,2 M KOH in Methanol zu den frischen Bakterienzellen und Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. Diese Reaktion besteht aus alkalischer Methanolyse, die Esterbindung in der Lipid Brechen und Fettsäuremethylester zu erzeugen.
   2. 1 ml 1 M Essigsäure den pH-Wert auf 7,0 zu senken. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Teststreifen.
   3. 3 ml Hexan FAMEs zu extrahieren.
   4. Übertragen Überstand (organische Phase) in saubere Röhrchen und konzentriert durch Abdampfen bei Raumtemperatur unter einem kontinuierlichen Stickstoffstrom etwa 200 & mgr; l zu erhalten,Extrakt. Übertragen Sie die Probe in ein GC-Fläschchen mit Einsatz.
   5. Injizieren Extrakte in eine Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) System.

4. GC / MS-Bedingungen

1. Injizieren FAME Proben in ein GC-MS-Gerät ausgestattet mit einer Kapillarsäule ZB-WAX (Länge, 30 m, Durchmesser 0,25 mm; Filmdicke, 0,25 & mgr; m).
2. Stellen Sie die Einspritzöffnung (in splitless Modus) Temperatur auf 250 ° C. Verwenden Helium als Trägergas mit einer linearen Geschwindigkeit von 37 cm / sec. Halten der Ofentemperatur bei 50 ° C für 1 min, erhöht auf 190 ° C mit einer Geschwindigkeit von 20 ° C / min, und weitere Steigerung auf eine Endtemperatur von 230 ° C mit einer Rate von 2 ° C / min.
3. Für die MS, notieren Sie die Massenspektren von Elektronen-Ionisation (EI) bei 70 eV, und stellen Sie den Erwerb des gesamten Ionenstrom zwischen 50 und 400 atomaren Masseneinheiten (amu) (2 Scans / s).
4. Wenn es erforderlich ist, injizieren excep DMOX und Picolinyl Derivate unter den gleichen Bedingungent die Temperaturprogramm Ofen wie folgt:
   DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min bis 210 ° C und 2 ° C / min bis 240 ° C (5 min);
   Picolinyl: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min bis 220 ° C und 2 ° C / min bis 250 ° C (20 min).

5. Picolinyl Ester Herstellung von FAME ¹⁶

1. Man dampft das FAME Auszug aus Kapitel 3 mit einem Stickstoffstrom (mindestens 10 mg trockenes Material) und in 1 ml trockenem Dichlormethan aufzulösen.
2. Bereiten einer 1,0 M Lösung von Kalium - ter t-butylat in Tetrahydrofuran.
3. Fügen Sie den FAME-Extrakt und 0,2 ml 3-pyridinemethanol bis 0,1 ml Lösung hergestellt in Schritt 5.2.
4. Die Lösung wird bei 40 ° C für 30 min in einem geschlossenen Glasfläschchen.
5. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur abgekühlt, gereinigt VE - Wasser (2 ml, siehe Materialien Tabelle) und Hexan (4 ml). Mischen Sie mit einem Wirbel, erlauben Phase zu trennen und sammeln die organische Phase ab.
6. DRy durch wasserfreiem Natriumsulfat, bis die organische Phase Zugabe ist vollkommen klar. Bringen Sie es in ein sauberes Röhrchen. Dann verdampfen zu 200 ul. Übertragen Sie die Probe in ein GC-Fläschchen mit Einsatz.

6. DMOX Herstellung von FAME ¹⁷

1. Man dampft das FAME Auszug aus Kapitel 3 mit einem Stickstoffstrom (mindestens 10 mg trockenes Material).
2. Zum Trockenextrakt FAME, fügen 250 mg 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol. Spülen Sie das Gefäß mit Stickstoff, fügen Sie einen Stopper, und legen Sie sie in einem Heizblock über Nacht bei 190 ° C.
3. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 3 ml Dichlormethan zu dem Rohr und 5 ml gereinigtes deionisiertes Wasser (siehe Materialien Table).
4. Schütteln Sie für die Phasentrennung und entfernen Sie dann die wässrige Phase.
5. Die organische Phase wird mit 5 ml Wasser. Schütteln Sie für die Phasentrennung und entfernen Sie dann die wässrige Phase.
6. Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat, bis die organische Phase Zugabe ist vollkommen klar undübertragen sie in ein sauberes Röhrchen. Man dampft unter einem Stickstoffstrom, bis ein Volumen von 200 & mgr; l zu erreichen. Übertragen Sie die Probe in ein GC-Fläschchen mit Einsatz.

Ergebnisse

Die Strategie der FA Identifizierung von Bakterienzellen ist in 1 dargestellt. Jeder Schritt liefert ergänzende spektrale Information oder Informationen über chromatographische Retention. Schritt 1 besteht aus vorläufigen FA Identifizierung einer Standardlösung verwenden. Schritt 2 ermöglicht die Auslegung von FAME EI-Spektren und ihre ECL, um die Produkte zu vorläufig zu identifizieren. Schritt 3 identifiziert die genaue Abzweigstelle in verzweigtkettigen-FAs. Schließli...

Diskussion

Die FAs Chromatogrammprofile in Tabelle 1 dargestellten entsprechen B. cereus ATCC 14579 auf einer Agarplatte Oberfläche gewachsen. Ähnliche Profile wurden erhalten , wenn das Bakterium in belüfteten flüssigen Medien bei der gleichen Temperatur ⁸ gezüchtet wurde. Im Falle von in flüssigen Medien gezüchtet Bakterien, die bakterielle Biomasse durch Zentrifugation von dem Wachstumsmedium gesammelt und kann nach zuvor beschriebenen Protokollen gewaschen werden je nach Wachstumsbedingunge...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
GC/MS	Shimadzu	QP2010
Kapillarsäule ZB WAX	Phenomenex	7HG-G007-11	30 m x 0.25 mm x 0.25  &Mikro; m
Methanol Lichrosolv	VWR	1.06018.2500
Kaliumhydroxid	Aldrich	P1767
THF	Hipersolv Chromanorm	28559.320
Dichlormethan	Hipersolv Chromanorm	23373.320
Hexan	Hipersolv Chromanorm	24575.320
3-Pyridinemethanol	Aldrich	P6-680-7
Kaliumtertiobutoxid	Aldrich	156671
2-Amino-2-methyl-1-propanol		A-9879
MilliQ Academic	Millipore	ZMQS50001
Bakteriensäuremethylester (BAME) Mix	Sigma-Aldrich	47080-U Supelco