Wir schlagen vor, ein Protokoll, den Transport von geladenen und ungeladenen Molekülen über Gelenkknorpel mit Hilfe von neu entwickelten experimentellen und numerischen Methoden zu untersuchen.
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Methodenartikel
Eine experimentelle und Finite-Elemente-Protokoll den Transport von neutralen und geladenen gelösten Stoffen durch Gelenkknorpel zur Untersuchung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Osteoarthritis (OA) ist eine schwächende Erkrankung, die mit einer Degeneration von Gelenkknorpel und subchondralem Knochen verbunden ist. Degeneration von Gelenkknorpel beeinträchtigt ihre tragende Funktion im wesentlichen wie es enormen chemischen Abbau, also Proteoglykan - Verlust und Kollagenfibrillen Unterbrechung erfährt. Ein vielversprechender Weg chemische Schädigungsmechanismen während OA zu untersuchen, ist die Knorpelproben mit einem externen gelösten Stoffe zu entlarven und die Diffusion der Moleküle zu überwachen. Der Grad der Knorpelschaden (dh Konzentration und die Konfiguration von essentiellen Makromolekülen) mit Kollisions Energieverlust der externen Solute assoziiert , während über Gelenkknorpel Eigenschaften im Vergleich zu gesunden Knorpel schafft unterschiedliche Diffusions bewegt. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll, das besteht aus mehreren Schritten und basiert auf zuvor entwickelten experimentellen Mikro-C14px; "> omputed T omography (Mikro-CT) und Finite - Elemente - Modellierung der Transport von geladenen und ungeladenen jodhaltigen Molekülen ersten Mikro-CT aufgezeichnet verwenden, die durch Anwendung biphasische-gelösten Stoffes und mehrphasige Finite - Elemente - Modelle zu erhalten Diffusionskoeffizienten folgt. und Ladungsdichten über Knorpels Zonen fixiert.
Einleitung
Molecular Transport spielt eine wichtige Rolle bei der Homöostase der Gelenkverbindungen, die Lieferung von Therapeutika Knorpel- und kontrastverstärkten Bildgebung Knorpel 1, 2, 3 des Gelenkknorpels. Faktoren wie Knorpel Integration und Intaktheit, gelöste Stoff Ladung und Größe sowie die Osmolalität und die Konzentration des Bades in Kontakt mit Knorpel kann die Transportrate beeinflusst 4, 5, 6. Der Transport der gelösten Stoffe, entweder neutral oder geladen ist , kann zwischen Gelenkknorpel Zonen unterschiedlich sein, da jede Zone unterschiedlicher Konzentrationen und Orientierungen der großen extrazellulären Matrixmolekülen besteht, nämlich Proteoglycanen (PGs) und Kollagen - Typ - II - 1, 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, 11. Noch wichtiger ist , von der Konzentration der Proteoglykane der Transport von geladenen gelösten Stoffen kann 8, 9 innerhalb der extrazellulären Matrix, die negativen Festladungen stark abhängig sein , die sich über Gelenkknorpel erhöht. Diese Parameter besonders feste Ladungsdichte (FCD), die Orientierung von Kollagenfibrillen und Wassergehalt Variation über Knorpel können Änderungen unterzogen werden, wie Osteoarthritis (OA) fortschreitet, wodurch angezeigt wird, die Bedeutung Diffusion über Knorpel zu studieren.
Unter Verwendung von neutralen und geladenen gelösten Stoffen in einem endlichen Bade Modell der Diffusion in der aktuellen Studie zugrunde , ein Protokoll über die zuvor festgelegte experimentelle und theoretische Studien 6, 8, 9 genau Diffusions vorgeschlagen wird unter verschiedenen Randbedingungen zu untersuchen. Ter vorgeschlagenen Methoden besteht aus Mikro Computertomographie-Bildgebung (Mikro-CT) einem System, das Knorpel- und endlicher-Bad durch erweiterte biphasische-gelösten Stoff und mehrphasige Finite-Elemente-Modelle unterstützt. Diese Modelle ermöglichen, die Diffusionskoeffizienten von neutralen und geladenen Moleküle sowie FCDS über verschiedene Zonen des Gelenkknorpels zu erhalten. Mit diesen Modellen kann ein besseres Verständnis des Verhaltens der diffundierenden neutralen und geladenen Moleküle gewinnen, die verwendet werden könnten, um die Wechselwirkungen zwischen Knorpel und Übereinander finite-Bad zu untersuchen.
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Protokoll
HINWEIS: Das Protokoll hier präsentiert wird aus den experimentellen und rechnerischen Verfahren der jüngsten Forschungsarbeiten angenommen 6, 8, 9. Das Protokoll ist in 1 dargestellt.
Die Kadaver Materialien wurden mit freundlicher Genehmigung von Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Utrecht gesammelt.
1. Probe und Badherstellung
- Ausbohren zylindrisches osteochondralen Topfen (Durchmesser von 8,5 mm) aus cadaveric equine Femurkondylen Verwendung maßgefertigte Bohrmeißel (Abbildung 1) , während kühle phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Aufsprühen Überhitzung und nachfolgende Knorpelschäden zu verhindern.
- Schrumpf die osteochondrale Stecker mit einer Kunststoffhülle schrumpft die seitliche Diffusion des überlagernden Bad zu minimieren.
- Montieren Sie den Knochen-Knorpel-Stecker mit Knorpel an the oben zunächst im Inneren der Hülse aus Kunststoff schrumpfen und folgen durch Einblasen von Heißluft zu. In nassen Baumwollstücke auf der Oberfläche des Knorpels hitzebedingten Schäden zu vermeiden.
- Bereiten finite-Bäder von geladenen (zB 650 & mgr; l, 420 mM, Ioxaglat, Molekulargewicht (MW) = 1.269 Da, Ladung = -1) und neutral (650 & mgr; l, 420 mM, Iodixanol, MW = 1.550 Da) gelösten Stoffe getrennt.
- Laden die vorbereiteten finite-Bäder auf der Oberfläche des Knorpels mit einer Spritze und legen einen Kork Stecker auf der umwickelte Probenverdampfung während der Experimente bei RT (2A) zu verhindern. Um den Stofftransport neutral zu untersuchen, legen die Iodixanol Bad und studieren, um die negativ geladenen Stofftransport statt Ioxaglat Bad auf der Knorpeloberfläche.
2. Imaging und Bildverarbeitung
- Plazieren der eingewickelten Proben isoliert mit Kork Stecker auf maßgefertigte Halter an der motorisierten Stufe eines Mikro-CT. Platz ter Probe, so dass die Knorpeloberfläche bedeckt mit Kontrastmittel-Lösung ist nach oben gerichtet.
- - Scan unter Verwendung der Micro-CT (Voxel - Größe von 40 × 40 × 40 & mgr; m 3, Zykluszeit von 2 min, Röhrenspannung von 90 kV und Röhrenstrom von 180 & mgr; A) mit einem Sichtfeld , bestehend aus Knorpel, subchondrale Platte und endliche Bad in mehreren Zeitpunkten bis zum Gleichgewichtszustand (48 h) wird (2A) erreicht wird . Der Gleichgewichtszustand erreicht wird, wenn Konzentrationswerte nicht im Laufe der Zeit ändern.
- Registrieren Sie die 3D - Bilder in verschiedenen Zeitpunkt basierend auf dem Anfangsbild Positionierung der Region of Interest zu erleichtern (ROI) mit Herstellersoftware (zB Analyse).
- Konvertieren der rekonstruierten 3D-Mikro-CT-Bilder in 2D Tagged Image File Format (TIFF) Stapel vor der Verarbeitung des Herstellers Software.
- Globally Segment (ImageJ> Anpassen> Threshold) der Knorpel aus dem subchondralen Knochen und überLiegen Bad in der Software.
- Erhalten der durchschnittliche Grauwert des Knorpels zu verschiedenen Zeitpunkten (ImageJ> Analysieren> Measure) unter Verwendung der erzeugten Maske Knorpels im vorherigen Schritt.
- Angesichts die anfängliche Badkonzentration und die anfängliche Kontrastmittelkonzentration in dem Knorpel, verwendet, um eine lineare Kalibrierungskurve den durchschnittlichen Grauwert an die tatsächlichen Konzentration der gelösten Stoffe zu überführen. Vorherige Daten stützen die Tatsache, dass Grauwerte eine lineare Beziehung mit der Konzentration von Kontrastmitteln aufrechtzuerhalten.
- Zeichnen Sie die Konzentrationen an gelösten Stoffen im Vergleich zu experimentellen Zeitpunkt.
3. Computational Modelling
HINWEIS: Die Diffusion in diesem Problem wird angenommen, in 1D nehmen (entlang der z-Achse), die mit der experimentellen Randbedingung erfüllt. Daher könnte die Geometrie beliebig erstellt.
- Baue finite-Bad auf Basis Knorpel Mehrzonen-Modelle: 1), bestehend aus Knorpel oberflächlicher Zone (20% des gesamten Knorpeldicke), mittlere Zone (50% des gesamten Knorpeldicke) und tiefere Zone (30% des gesamten Knorpeldicke) 12 und 2) finite-Bad in Febio 13, 14 (2B).
- Zuordnen, die mechanischen und physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Zonen des Knorpels und Bad in Febio. Young-Modul (10 MPa) wurde angenommen, hoch genug sein, um den osmotischen Druck, der durch das darüber liegende Bad ausgeübt zu widerstehen und daher den Knorpel vor übermäßigen Verformungen zu schützen.
- Verwenden , um eine hydraulische Permeabilität von 10 -3 mm 4 / Ns und Poissonzahl von 0. Verwendung tatsächlichen solute Diffusionskoeffizient des Bades in den Simulationen 8, 9.
- Generieren mesh (8-Knoten trilineare hexaedrischen Elemente) und verfeinern , es in der Nähe der Grenzen (2B)class = "xref"> 8, 9.
- Biphasic-solute Modell
- Anwenden anfängliche Konzentration an gelösten Stoffen in dem Bad und effektiven Druck, um es entspricht. Schauen Sie sich die Beschreibung des effektiven Drucks in 9, 15.
- Führen Sie das Modell in transienten Modus Konzentration des gelösten Stoffes als Funktion der Zeit Kurven entsprechend den vorgeschriebenen Diffusionskoeffizienten in verschiedenen Zonen Knorpels zu erhalten.
- Multiphasic Modell
HINWEIS: Die elektrische Schwankung zwischen Bad und Gewebe kann sowohl durch Zugabe von zwei einwertigen Gegenionen zu dem Bad umgangen werden, und das Gewebe.- Für Beharrungsmodelle: verwenden, um die gleichen effektiven Fluiddrücke und Konzentrationen in Knorpeln und darüber liegendes Bad während FCD auf seinen gewünschten Wert erhöht wird.
- Für transiente Modelle: schaffen, indem den gelösten Stoff Diffusionskoeffizienten in dem Bad ausreichend hoch ist ein gut gerührte finite-Bad. injizieren Sie diegelöster Stoff aus der Bad-Luft-Grenzfläche in das Bad seines gewünschten Konzentrationswert zu erreichen.
- Transient: entferne die vorgeschriebene Konzentration an gelösten Stoffen Randbedingung in dem vorherigen Schritt und kehren die Diffusionskoeffizient des finite-Bad zu seiner tatsächlichen Diffusionskoeffizienten.
- Führen Sie die Modellkurven solute Konzentrations-Zeit auf Basis angewendet FCDS und Diffusionskoeffizienten in verschiedenen Zonen Knorpels zu erhalten.
- Febio-MATLAB-Schnittstelle
- Entwickeln eines MATLAB - Code automatisch durch Simulation in Febio und Plot - Konzentrations-Zeit - Kurven (Febio-MATLAB - Schnittstelle) 8, 9.
- Ändern Diffusionskoeffizienten und FCDS in Knorpel- Zonen Febio-MATLAB-Schnittstelle. Führen Modelle in Febio und solute Konzentrations-Zeit - Kurven 8, 9 extrahiert.
- Vergleichen Sie die erhaltenen Konzentration an gelösten Stoffen Zeitkurven mit dem experimentellenDaten und erhalten Sätze von Diffusionskoeffizienten und FCDS in Zonen unterschiedlicher Knorpels auf Mindest root mean square error basiert (RMSE) 8, 9.
Abbildung 1: Experimenteller Aufbau. A) Probenextraktionsverfahren eine maßgefertigte Bohrer. B) Micro-CT - Bildgebungsverfahren Diffusionsprozess zu überwachen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Schematische.A) Experimentelles Design. B) Mehrzonen - Berechnungsmodells des finiten Bad bestehend, oberflächlich, mittleren und tiefen Zonen des Knorpels und der zugehörigen Masche. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Ergebnisse
Die repräsentativen Ergebnisse hier vorgesehen sind , aus früheren Forschungsarbeiten angenommen 6, 8, 9, 16.
In OA erfährt Gelenkknorpel signifikante Veränderungen am wichtigsten GAG Verlust und Kollagenfibrille Schaden 17, 18,
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Diskussion
Wir stellten ein experimentelles Protokoll mit einem Finite-Elemente-Modellierungsverfahren kombiniert über Gelenkknorpel die Diffusion von neutralen und geladenen gelösten Stoffe zu untersuchen. Nach unseren jüngsten Studien beschreiben die vorgeschlagenen Modelle könnten genau den Transport von sowohl neutral (zweiphasige-solute) und negativ geladene (mehrphasige) gelösten Stoffe durch verschiedene Zonen des Gelenkknorpels 8, 9. Es wird allgemein angenommen , ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren möchten ihren Dank für ihre Hilfe an Herrn Jeroen van den Berg und Herr Matthijs Wassink von der Entwicklung Mechanik Gruppe bei UMC Utrecht auszudrücken Prozess der Knochen-Knorpel-Stecker in Verpackung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Niederländischen Arthritis Foundation unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negativ geladenes Kontrastmittel |
| Visipaque | GE Healthcare | 12570511 | Nuetral Kontrastmittel |
| PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Lebenstechnologien | 10010023 | |
| Medium Mikro-CT | Perkin Elmer | Überwachung Diffusion | |
| Gefrierpunkt-Osmometer | Erweitert Instrumente | Messung der Osmolalität von Lösungen |
Referenzen
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