Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Summary

Hochauflösende Respirometrie verwendet mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Dies ist eine einfache Technik mitochondrialen Atmungskette Komplexe '(I-IV) Atmungsraten, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und mitochondrialen Außenmembran Integrität zu bestimmen.

Abstract

Ein hochauflösender Oxygraph ist ein Gerät zur Messung des zellulären Sauerstoffverbrauchs in einem geschlossenen Kammersystem mit sehr hoher Auflösung und Empfindlichkeit in biologischen Proben (intakte und permeabilisierte Zellen, Gewebe oder isolierte Mitochondrien). Das hochauflösende Oxygraph-Gerät ist mit zwei Kammern ausgestattet und verwendet polarographische Sauerstoffsensoren, um die Sauerstoffkonzentration zu messen und den Sauerstoffverbrauch in jeder Kammer zu berechnen. Die Sauerstoffverbrauchsraten werden mit Hilfe von Software berechnet und als Picomole pro Sekunde pro Anzahl von Zellen ausgedrückt. Jede hochauflösende Oxygraph-Kammer enthält einen Stopfen mit Injektionsanschlüssen, wodurch sie sich ideal für Substrat-Entkoppler-Inhibitor-Titrationen oder Detergenztitrationsprotokolle zur Bestimmung effektiver und optimaler Konzentrationen für die Permeabilisierung der Plasmamembran eignet. Die Technik kann zur Messung der Atmung in einer Vielzahl von Zelltypen angewendet werden und liefert auch Informationen über die mitochondriale Qualität und Integrität sowie die maximale Kapazität des mitochondrialen respiratorischen Elektronentransportsystems.

Introduction

Mitochondria erfüllen eine wichtige Rolle in der zellulären Energiestoffwechsel, insbesondere von Sauerstoff unter Verwendung von Adenosintriphosphat (ATP) zu erzeugen. Sie werden in den Zelltod und in verschiedenen menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) kombiniert entlang der Elektronentransportkette mit Sauerstoffverbrauch und die ATP-Synthese Elektronentransport. Die mitochondriale Tricarbonsäure (TCA) -Zyklus ist , bei der Umwandlung von Proteinen, Kohlenhydraten und Fetten in energiereiche Verbindungen , wie Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und Flavin - Adenin - Dinukleotid (FADH ₂₎ beteiligt. Elektronen des NADH und FADH ₂ werden dann an die Atemelektronentransportkette Protein - Komplexe überführt (I bis IV) in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert. Darüber hinaus wurden zwei weitere Redoxreaktionswege können Elektronen übertragen Transportkette Elektronen: i) die mitochondriale Elektronenübertragungs Flavoprotein (ETF), die auf der Matrix Fläche des inneren Mito befindetchondriale Membran und liefert Elektronen aus Fettsäure β-Oxidation; und ii) die mitochondriale Glycerophosphat-Dehydrogenase, die Glycerophosphat zu Dihydroxyacetonphosphat und speist Elektronen an der mitochondrialen Elektronentransportkette oxydiert. Komplex IV (das ultimative Elektronenakzeptor) überträgt die Elektronen auf ein Sauerstoffmolekül, Sauerstoff zu zwei Molekülen Wasser umwandelt. Bewegen der Elektronen von respiratorischen Elektronentransportkette Komplex I bis IV ist gekoppelt mit Protonenfluss aus der mitochondrialen Matrix in die Intermembranraum, die einen elektrochemischen Gradienten über der mitochondrialen inneren Membran herstellt. Danach pendelt mitochondrialen Komplex V (ATP-Synthase) die Wasserstoffionen wieder in die mitochondriale Matrix und synthetisiert ATP-Moleküle. OXPHOS Funktion kann in vivo und in vitro unter Verwendung verschiedener Techniken und verschiedene mitochondriale Atmung Zustände beurteilt werden kann , erhalten werden. In isolierten Mitochondrien der folgende den Resry Zustände gemessen werden: i) die basale mitochondriale Atmung (Zustand 1), ii) Sauerstoffverbrauch nach der Zugabe von spezifischen Substraten der mitochondrialen Atmungskette Komplexe (Zustand 2), iii) maximale mitochondrialen Sauerstoffverbrauch nach der Zugabe von sättigenden Konzentrationen von Adenosindiphosphat (ADP) (Zustand 3) und iv) Ruheatmung nach ADP Verbrauch (umgerechnet auf ATP) (Zustand 4). In intakten Zellen können die folgenden Atmungszustände gemessen werden: i) basalen zellulären Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart von endogenen Substraten und ADP, ii) basalen zellulären Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Oligomycin (Oligomycin-insensitive Atmung) und Oligomycin empfindlichen Atmung (ATP Umsatz), iii) FCCP ungekoppelten Atmung und iv) nicht-mitochondrialen Atmung nach der Zugabe von Antimycin A und Rotenon. In permeabilisierten Zellen können spezifische Substrate der Elektronentransportkette Komplexe und ADP hinzugefügt werden und die maximale komplexe abhängigen s Atmungsratenuch als komplexe I-, II- und IV-abhängige können Atemfrequenz gemessen werden.

Messungen der Zellatmung liefern wichtige Einblicke in mitochondrialen Atmungskapazität spezifischen Komplexe I-IV, mitochondriale Integrität und Energiestoffwechsels ^{1, 2, 3.} Eines der Geräte , die Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch mit hoher Genauigkeit, Auflösung und Empfindlichkeit ermöglichen die hochauflösende Oxygraph ^4. Die hochauflösende Oxygraph Gerät enthält zwei Kammern mit Injektionsöffnungen und jede Kammer mit einem polarographischen Sauerstoffsensor ausgestattet. Cellular oder isolierte Mitochondrien-Suspensionen werden kontinuierlich in der respirometer gerührt. Um die Funktion der Mitochondrien, Substrate und Inhibitoren für mitochondriale komplexe Tätigkeit beurteilen können nach Standardprotokollen hinzugefügt werden. Substrate und Inhibitoren können durch Injektion int titriert werdeno die Kammern des Oxygraph und Sauerstoffverbrauch Raten werden mit einer Software berechnet und als Picomol pro Sekunde Anzahl der Zellen. Hochauflösende Respirometrie bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen und üblichen polarographischen Sauerstoffelektrodeneinrichtungen einschließlich der erhöhten Empfindlichkeit und der Fähigkeit, mit einer kleinen Anzahl von biologischen Proben wie intakten oder permeabilisierten Zellen zu arbeiten. Zusätzlich enthält jede Vorrichtung zwei Kammern, und Atemfrequenzen gleichzeitig für Vergleiche der Sauerstoffkonzentration aufgezeichnet. Das hochauflösende Oxygraph hat auch den Vorteil einer verringerten Austreten von Sauerstoff aus den Vorrichtungskammern im Vergleich zu herkömmlichen polarographischen Sauerstoffelektrode Geräte. Ein anderes Gerät vor kurzem Verbrauch zu messen zellulären Sauerstoff entwickelt ist der 96-Well - extrazellulären Fluss Analysator ^5. Die extrazelluläre Fluss-Analysator wird mit Fluoreszenz ausgestattet anstelle von polarographischen Sensoren. Die Vorteile der extrazellulärenFlußmittel Analysators verglichen mit dem hochauflösenden Oxygraph sind i) es ist eine weitgehend automatisierte Vorrichtung, ii) es ist möglich, den Sauerstoffverbrauch in 24- und 96-Well-Platten für die Hochdurchsatz-Screening zu messen und erfordert daher geringere Mengen an biologischen Proben, und iii) zusätzliche Messung von zellulären glycolytic Fluss möglich ist. Die Nachteile des extrazellulären Flux Analyzer im Vergleich zum hochauflösenden Oxygraph sind i) die hohen Kosten des Gerätes und der Verbrauchsmaterialien wie fluoreszierende Platten, die sind nicht wiederverwendbar sind, und ii) nur vier Verbindungen pro Test / gut sind injizierbare daher ist das System für das Substrat-Entkoppler-Inhibitor Titration Protokolle nicht durchführbar.

In der vorliegenden Studie verwenden wir hochauflösende Respirometrie mitochondriale Atmung zu bestimmen. Für zellulare Sauerstoffverbrauch Experimente werden die Zellen permeabilisiert den Eintritt von exogenen ADP und oxidierbaren mitochondrialen Substrate zum Zuführen von Elektronen in complexe zu ermöglichens des Atmungssystems. Dieser Ansatz ermöglicht die Zerlegung der einzelnen mitochondrialen Komplexe Atemkapazitäten, die einen deutlichen Vorteil im Vergleich zu intakten Zellen (viele Substrate sind zell impermeant). Jedoch Zellmembranpermeabilisierung wird die Barriere zwischen dem Cytosol und extrazellulären Raum und Medium (Auswaschen der cytosolischen Solute) und der Zusammensetzung des intrazellulären Raum stören wird mit dem extrazellulären Medium äquilibriert. Einer der Nachteile von permeabilisierten Zellen über intakten Zellen ist, dass der mitochondrialen Außenmembran beschädigt werden können, wenn große Mengen an Detergens während Zellpermeabilisierung eingesetzt werden. In intakten Zellen können basal, an- und abgekoppelt Atmung von intakten Zellen gemessen werden. Dieses Verfahren wertet Sauerstoffverbrauch von intakten Zellen ohne Zugabe von exogenen Substraten und ADP, die Atmungsfunktion in der integrierten Zelle wiedergeben und auch Informationen über die maximale mitochondrialen Elektronen transpo Bereitstellenrt Kapazität ^{6, 7.} Einer der Vorteile von intakten Zellen über permeabilisierten Zellen, die zelluläre Umgebung nicht gestört wird und Mitochondrien sind in Kontakt mit den gesamten Komponenten der Zellen. Um die zelluläre Plasmamembran, Detergenzien wie Digitonin permeabilisieren haben ⁸ verwendet. Jedoch kann mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigt werden, wenn überschüssige Mengen an Digitonin eingesetzt werden. Um diese mitochondrialen Außenmembran-Integrität zu bestätigen ist nicht in permeabilisierten Zellen beeinträchtigt wird Digitonin-Titration durchgeführt, um die optimale Konzentration für zellulare Permeabilisierung zu bestimmen. Für diese Experimente werden die Zellen in Medium resuspendiert und Atmungs Digitonin Konzentration wird durch Respirometrie in Gegenwart von Substraten und mitochondriale ADP titriert und Atmungsraten gemessen werden. Respiration von intakten, nicht-permeabilisierten Zellen nicht in Gegenwart von mitocho stimuliertendrial Substrate und ADP. Allerdings nachfolgende schrittweise Digitonin Titration allmähliche Permeabilisierung der Plasmamembranen und optimale Digitonin Konzentration erhalten würde ergeben wird. Dies wird durch die Zunahme der Atmung bis zur vollen Permeabilisierung gezeigt. Mitochondriale Qualität und der äußeren Membran Integrität kann durch Zugabe von exogenen Cytochrom - c - ^{2, 9} überprüft werden. Cytochrom c ist ein 12 kDa Elektron tragende Protein der mitochondrialen Elektronentransportkette ^{10, 11, 12.} Es ist in der mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert und wird in den Sauerstoffverbrauch, Trage Elektronen von Komplex III-Komplex IV beteiligt. Sobald der mitochondrialen Außenmembran beschädigt ist, wird Cytochrom c freigesetzt und mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs reduziert wird. Nach der Zugabe von exogenen Cytochrom c ist jede Augmentation in die mitochondriale Atmung eines indikativenmitochondrialen Außenmembran gestört.

In permeabilisierten Zellen, Substrate und Inhibitoren der mitochondrialen Komplex - Aktivität zugesetzt werden , nach verschiedenen Protokollen ^{3, 9.} Beispielsweise um die mitochondriale Komplex-driven Atmungsraten zu untersuchen, kann das folgende Protokoll verwendet werden. Nach der Permeabilisierung der Zellen wird zunächst Komplex I durch die Substrate Malat und Glutamat stimuliert, die NADH als Substrat zu der Atmungskette erzeugen und die Aktivierung von komplexen I. provozieren Danach wird ADP für die Umwandlung in ATP hinzugefügt (Zustand 3 aktive Komplex I-abhängige Atmung). Nachdem ein stabiles Signal erreicht wird, Rotenon (mitochondriale Komplex I - Inhibitor) verabreicht Komplex I zu hemmen Rotenon ₂ von Succinat zu FADH gefolgt ist und komplexe II (Zustand 3, aktive Komplex II-abhängige Atmung) zu aktivieren. Um komplexe IV abhängige Atmung, erste Komplex III zu messen-abhängigen Atmung wird durch Zugabe von Antimycin A (mitochondriale Komplex III-Inhibitor) gehemmt. Danach Komplex IV abhängige Atmung wird durch Verabreichung von Ascorbat und tetramethylphenylendiamine (TMPD) stimuliert. TMPD durch Subtrahieren Atmungsraten in dem Atmungspuffer daher die maximale Komplex IV abhängigen Atmungsrate (Zustand 3) berechnet automatisch oxidieren vor und nach der Zugabe von Natriumazid, einem Inhibitor der mitochondrialen Komplex IV. Die Atmungs Experimente können in zwei Kammern eines Oxygraph in parallel-on durchgeführt werden, dienen als Kontrolle (nicht-stimulierte Zellen), die andere mit den stimulierten Zellen. Offensichtlich können die Zellen auf verschiedene Weise vorbehandelt werden, beispielsweise mit Medikamenten mitochondrialen Funktionen beeinflussen, bevor ihre Sauerstoffverbrauch in der Oxygraph Kammer gemessen wird. Dieses Protokoll ermöglicht funktionelle Untersuchung der einzelnen mitochondrialen Atmungskette Komplexe. Zusätzlich kann eine maximale ADP-stimulierte messenAtmung (Zustand 3) von permeabilisierten Zellen, exogene Fettsäure in Form von Palmitat verwendet wird. (: 1-Molverhältnis Palmitat: BSA 6) In diesem Protokoll konzentrierte Vorräte an Natriumpalmitat sind mit ultra Fettsäure freies Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert. Danach ersten Zellen mit Digitonin und mitochondriale Atmung permeabilisiert werden, wird durch die Zugabe von Carnitin beurteilt und Palmitate durch Zugabe von ADP (Zustand 3, maximal Atmung) gefolgt. Dann Oligomycin zugegeben Zustand 4 (Stand 4o) und Atemkontrollverhältnis (RCR-Wert) zu imitieren, wird als Zustand 3 / Zustand 4o berechnet. β-Oxidation fördert Herstellung von Acetyl - CoA (die in der TCA - Zyklus eintritt) und die Erzeugung von FADH ₂ und NADH, die Elektronen von dem auf die Elektronentransportkette durch Elektronentransferierendes Flavoprotein und β-Hydroxyacyl-CoA - Dehydrogenase geben werden. Mitochondrien sind in der Mitte des Fettsäurestoffwechsels und beschrieben Palmitat-BSA-Protokoll von den Forschern verwendet werden kann Fett untersuchenty Säureoxidation. In intakten Zellen, Aktivatoren und Inhibitoren der mitochondrialen Komplex - Aktivität werden nach einem anderen Protokoll hinzugefügt ^{6, 9.} Für diese Experimente ersten Sauerstoffverbrauch von nicht-permeabilisierten Zellen in Abwesenheit von exogenen Substraten gemessen (Atmungsrate phosphorylieren). Dann wird die nicht-Phosphorylierungsmittel Atmungsrate nach der Zugabe von Oligomycin gemessen wird, die ein Inhibitor der mitochondrialen ATP-Synthase ist. Danach wird das Cyanid protonophore carbonyl p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in verschiedenen Konzentrationen verabreicht und die maximale mitochondrialen ungekoppelten Atmungsrate gemessen wird. Protonophoren wie FCCP kann eine Steigerung in Protonendurchlässigkeit der inneren Membran, so dass passive Bewegung von Protonen induzieren die chemiosmotic Gradienten abzuleiten. Eine Erhöhung der Protonen Permeabilität abkoppelt oxidativen Atmung (kein ATP-Produktion) und induziert eine Erhöhung oxygen Verbrauch. Danach werden Rotenon und Antimycin A hinzugefügt mitochondriale Atmung zu hemmen, und nicht-mitochondriale Atmung wird von allen anderen Atmungsraten subtrahiert.

Die Sauerstoffverbrauchsraten können als IO ₂ [pmol x sec ^-1 x 10 ^-6 Zellen] (Sauerstofffluss pro Million Zellen) ausgedrückt werden , die durch Teilen volumenspezifische Sauerstofffluss (in der geschlossenen Sauerstoffkammer), JV, O berechnet ₂ [pmol x sec ^-1 x ml ^-1] von Zellkonzentration in der Zellkammer (Anzahl der Zellen pro Volumen [10 ⁶ Zellen ∙ ml ^{1]) 15.} Zell-Masse spezifische Sauerstofffluss, JO ₂ [pmol x sec ^-1 x mg ^-1] ist Fluss pro Zelle, IO ₂ [pmol x sec ^-1 x 10 ^-6 Zellen], dividiert durch die Masse pro Zelle [mg ∙ 10 ⁶ Zellen]; oder volumenspezifische Fluss, JV, O ₂ [pmol x sec ^-1 x ml ^-1], durch Masse pro vol geteiltume [mg ∙ ml ^1]. ₂ JO ist der Sauerstofffluss pro Zellprotein, Trockengewicht oder Zellvolumen.

In der vorliegenden Studie hochauflösenden Respirometrie verwenden, beschreiben wir Protokolle i) eine optimale Digitonin Konzentration für die vollständige zelluläre Plasmamembran Permeabilisierung (Digitonin Titrationsassay), ii) die mitochondriale Außenmembran Integrität mit exogenen Cytochrom c, iii) die mitochondriale Atmungskette Komplexe I zu bestimmen, , II und IV maximale Atmungsraten in Digitonin-permeabilisierten HepG2-Zellen in Gegenwart von exogenem ADP und der mitochondrialen Atmungskette Substrate und iv) basal, gekoppelt und maximal ungekoppelten Atmung (maximale Elektronentransportkapazität) von intakten Zellen ohne Zugabe von exogenen Substraten und ADP, Wiedergeben der Atmungsfunktion in der integrierten Zelle.

Protocol

1. Zellkultur

1. Kultur menschlicher Hepatomzellen HepG2 - Zelle ⁶ in 25 cm ² Zellkulturflaschen in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C in einem Inkubator (5% CO _2, 95% Luft) (Aussaatdichte: 1 x 10 ⁶ Zellen pro 25 cm ² Zellkulturflasche, Inkubationszeit in dem 37 ° C Inkubator 48 h, Zelldichte bei Konfluenz: 4-5 x 10 ⁶ Zellen pro 25 cm ² Zellkulturflasche).
2. Führen Sie die Experimente, wenn die Zellen 90% bis 95% konfluent sind.

2. Hochauflösende Respirationstest Kalibrierung von Polarographische Sauerstoffsensoren

1. Pipette 2,1 ml Atmungspuffer in eine Oxygraph Kammer und rühren Sie den Puffer kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer unter Verwendung von (700 rpm) bei 37 ° C für 1 Stunde, bis eine stabile Sauerstofffluss Signalder polarographischen Sauerstoffsensor erhalten wird.
   HINWEIS: Polarographische Sauerstoffelektroden in jeder Oxygraph Kammer messen Sauerstoffkonzentration und Berechnung des Sauerstoffverbrauchs (Fluss) in jeder Kammer. Die Sauerstoffkonzentration und der Sauerstoffverbrauch Raten (Fluss) sind Echtzeit-Online in einem Computer zur Datenerfassung und Analyse unter Verwendung von Software angezeigt.
2. Führen Sie eine Luftkalibrierung des polarographischen Sauerstoffsensors nach Protokollen des Herstellers ^14.
   HINWEIS: Die Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren in Atmung Medien und Sauerstoffkonzentration in den Medien bei Luftsättigung experimentellen Temperatur nur einmal täglich am Morgen durchgeführt wird. Anschließend können die Medien aus den Kammern und Zellen in einem frischen Atmung Medien resuspendiert werden zu einer Oxygraph Kammer gegeben und Atemfrequenz gemessen werden. Nach dem ersten Versuch kann die Kammer gewaschen und weitere Reihe von Experimenten in t durchgeführt werden kanner derselben Kammer ohne weitere Kalibrierung.

3. Trypsinisierung von adhärenten Zellen, Zellzählung

1. Am Tag des Experiments absaugen DMEM von der 25 cm ² Zellkulturflasche.
2. Spülen der Zellkultur-Monoschicht in der Kulturflasche mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
3. Pipette 0,5 ml 25 mg / ml Trypsinlösung (vorgewärmt auf 37 ° C in einem 37 ° C Wasserbad) in die Zellschicht in dem Kulturkolben und Inkubation für 5 min bei 37 ° C in einem Inkubator (5% CO ₂ Luft, 95%).
4. Pipette 5 ml DMEM 10% FBS in die abgelösten Zellen in der Zellkulturflasche enthält und die Zellen durch Pipettieren suspendieren.
5. Transfer-Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 350 xg bei Raumtemperatur und dekantiert den Überstand resuspendiert.
6. Zellpellet in 1 ml Atmungspuffer ¹³ (T können 1).
i> Zähle die Zellen mit einem Zellzähler verwenden und sie in dem Atmungspuffer auf eine endgültige Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml resuspendieren. Da die Zellatmung Raten auf die Zellzahl normalisiert werden, um die Zellen mit einer genauen und präzisen Zellzähler zählen.

4. Hochauflösende Respirationstest

1. Nach Luftkalibrierung (täglich nur einmal durchgeführt, 2,1-2,2 Stufen), aus einer Kammer des Oxygraph die Atmungs Medium absaugen und aus dem Schritt 3.7 der Kammer 2.1 ml der Zellsuspension (1 x 10 ⁶ Zellen / ml) hinzufügen.
2. Schließen der Oxygraph Kammer durch Einführen des Stopfens.
3. Rühren Sie die Zellen kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer unter Verwendung von (700 rpm) bei 37 ° C und Aufzeichnung der Zellatmung für 5-10 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
   HINWEIS: Die Sauerstoffkonzentration und Sauerstofffluss-Signal in Echtzeit online in einem Computer angezeigt unter Verwendung von Software zur Datenerfassung und Analyses = "xref"> 14.
4. Anschließend injizieren Substrate und Inhibitoren für die mitochondriale Atmung durch die Titan-Injektionsöffnungen der Anschläge die folgenden Protokolle verwenden.

5. Digitonin Titration in intakten Zellen durch Respirationstest

1. Vorbereiten eines Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension (1 x 10 ⁶ / ml) nach der beschriebenen Vorgehensweise in den Schritten 4.1 bis 4.3 des Protokolls.
2. Injizieren 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 uM), "Vorsicht" in die Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen unter Verwendung einer Spritze und die Zellatmung für 5-10 min aufgezeichnet, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird .
   Hinweis: alle Injektionen in den folgenden Schritten werden durch die Titan-Injektionsöffnungen von Anschlägen durchgeführt Spritzen verwenden. Die Zugabe von Rotenon ist optional (es verhindert Reverse-Elektronenfluss) und kann für Digitonin Titrationsexperimenten weggelassen werden, sieheSchritt 6.3.
3. Einzuspritzen 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Kammer und Oxygraph aufnehmen Zellatmung für 5-10 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
4. Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Kammer und Oxygraph aufnehmen Zellatmung für 5-10 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
5. Injizieren 2 ul 2 mM Digitonin (2 & mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung für 2-5 min, bis eine stabile Sauerstoffsignal erreicht wird.
6. injizieren Wieder 2 ul 2 mM Digitonin in die Oxygraph Kammer und aufzeichnen für 2-5 min Zellatmung, bis ein stabiler Sauerstoffsignal erreicht wird.
   HINWEIS: Die schrittweise Zugabe von Digitonin zu den Zellen wird eine Erhöhung der zellulären Sauerstoffverbrauch und den Sauerstoffflusssignal erhöht induzieren.
7. Weiterhin 2-4 & mgr; l 2 mM Digitonin schrittweise (2-4 uM jede Stufe) in die Kammer eingespritzt wird. Nach jedem Schritt erfassen die Zellatmung für 2-5 min bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
   HINWEIS: Stoppen Sie die Injektion Digitonin, wenn der Sauerstoffflusssignal einen maximalen Pegel und weitere Injektionen von Digitonin erreicht nicht erhöhen die Atmungsrate. Die Leser sollten optimal Digitonin Konzentration in ihren Labors bestimmen ihren Reagenzien und Verwendung erhalten optimale Digitonin-Konzentration in den Schritten 6.2 und 7.2 der folgenden Protokolle für ihre Experimente.

6. Auswertung der mitochondrialen Außenmembran Integrität: Cytochrome C

1. Vorbereiten eines Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension (1 x 10 ⁶ / ml) nach der beschriebenen Vorgehensweise in den Schritten 4.1 bis 4.3 des Protokolls.
2. Injizieren 2 ul 8 mM Digitonin (8 uM) in die Oxygraph Kammer mit der Zellsuspension (1 x 10 ⁶ / ml) und Permeabilisierung der Zellen für 5 min.
3. Einzuspritzen 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Kammer und Oxygraph aufzuzeichnen zellulare respiratIon für 5-10 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
4. Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Kammer und Oxygraph aufnehmen Zellatmung für 5-10 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
   HINWEIS: Die Zugabe von ADP zu den Zellen wird komplexen I stimulieren und eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs induzieren und Sauerstoff Flußsignal erhöhen und zu stabilisieren.
5. Injizieren Sie 5 ul 4 mM Cytochrom c (10 & mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung für 5-10 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
6. Schließlich injizieren 1 ul 4 mg / ml Oligomycin (2 ug / ml) und die Zellatmung erfassen, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.

7. Maximal ADP-stimulierte Respiration (State 3) von permeabilisierten HepG2-Zellen

1. Vorbereiten eines Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension (1 x 10 ⁶ / ml) nach der beschriebenen Vorgehensweise in den Schritten 4.1 bis 4.3 des Protokolls.
2. Injizieren 2 ul 8 mM Digitonin (8 & mgr; M) in die Kammer Oxygraph die Zellsuspension enthält, und Permeabilisierung der Zellen für 5 min.
3. Injizieren von 12,5 & mgr; l von 0,8 M von Malat (5 mM) und 10 ul 2 M von Glutamat (10 mM) in die Kammer Oxygraph. Nehmen Sie die Zellatmung, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
4. Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Kammer und Oxygraph aufzuzeichnen Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal erhöht und stabilisiert.
   HINWEIS: Die Zugabe von ADP zu den Zellen eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal erhöht induzieren.
5. Injizieren Sie 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 uM) "Vorsicht" in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert.
6. Danach injizieren 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Kammer und Oxygraph Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal zunimmt aufzeichnenund stabilisiert.
7. Dann injizieren 2 ul 5 mM A (5 uM) "VORSICHT" in die Oxygraph Kammer Antimycin und die Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert sich aufzunehmen.
8. Dann injizieren 2,5 ul von 0,8 mM Ascorbat (1 mM) und unmittelbar nach der 2,5 & mgr; l von 0,2 mM TMPD (0,25 mM) in die Kammer zu injizieren und Oxygraph Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal erhöht und stabilisiert aufzuzeichnen.
9. injizieren schließlich 10 ul 1 M Natriumazid (5 mM) "Vorsicht" in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert.

8. Sauerstoffverbrauch intakter Zellen

1. Vorbereiten eines Oxygraph Kammer enthaltenden Zellsuspension (1 x 10 ⁶ / ml) nach der beschriebenen Vorgehensweise in den Schritten 4.1 bis 4.3 des Protokolls.
2. Injizieren 1 ul 4 mg / ml Oligomycin (2 ug / ml) in die Kammer Oxygraph enthaltenden Zellsuspension eind Aufzeichnung der Zellatmung, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
3. Danach injizieren 1 ul 0,2 mM FCCP (0,1 uM) "VORSICHT" in die Oxygraph Kammer und die Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal erhöht aufzeichnen und stabilisiert.
4. Injizieren 3 ul 0,2 mM FCCP (0,4 & mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal weiter ansteigt und stabilisiert.
5. Titrieren FCCP in 0,1 bis 0,3 uM Schritten von 1-3 & mgr; l von 0,2 bis 1 mM FCCP Injektion (0,1 bis 2 & mgr; M Endkonzentration in der Kammer) in die Kammer, bis das Oxygraph Sauerstofffluß Signal erreicht ihren maximalen Niveaus und keine weiteren Erhöhungen und dann beginnt rückläufig.
   HINWEIS: Stoppen Sie FCCP Injektion, wenn der Sauerstoffsignal ein maximales Niveau erreicht und beginnt rückläufig.
6. Dann injizieren 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 & mgr; M) und 2 ul 5 mM A (5 uM) Antimycin in die Kammer. Nehmen Sie die Atmung bis ter Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert.

Results

Bestimmung der optimalen Digitonin Konzentration für Cellular Permeabilisierungs: Digitonin Titrationsexperiment

Digitonin Titration wird durchgeführt, um die optimale Konzentration für die Permeabilisierung von HepG2-Zellen zu bestimmen. Für diese Experimente wurden Digitonin in intakten Zellen in Gegenwart von Rotenon, Succinat (mitochondriale Komplex II Substrat) und einer sättigenden Menge an ADP titriert (Komplex II-abhängig...

Discussion

Das Ziel des vorliegenden Protokolls war hochauflösende Respirometrie zu verwenden, um die mitochondriale Atmungskette Komplexe "(I-IV) Atemfrequenz, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und der mitochondrialen Außenmembran Integrität messen.

Es gibt einige wichtige Schritte im Rahmen der vorliegenden Protokoll. Zuerst werden zellulare Sauerstoffverbrauchsraten der Regel auf die Anzahl der Zellen normiert (pmol / [sec x Anzahl der Zellen]). Deshalb wird vor der ze...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A 4386	Chemikalie
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemikalie, in Ethanol auflösen
Ascorbat	Merck	1.00127	Chemikalie
BSA	Sigma	A 6003	Chemikalie
FCCP	Sigma	C 2920	Chemikalie, in Ethanol auflösen
Countess automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automatisiertes Zellzählinstrument
Cytochrom c	Sigma	C 7752	Chemikalie
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemikalie, lösen in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemikalie
FBS	Gibco	26010-074	Medium Komponente
Glutamat	Sigma	G 1626	Chemikalie
Hepes	Sigma	H 7523	Chemikalie
KCl	Merck	1.04936	Chemikalie
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemikalie
K-Lactobionat	Sigma	L 2398	Chemikalie
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemischer
O2k-Kern: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Hochauflösendes Respirometrie-Gerät
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemikalie, in Ethanol lösen
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Chemikalie
Natriumazid	Sigma	S2002	Chemikalie
Rotenon		Sigma R 8875	Chemikalie, in Ethanol lösen
Succinat	Sigma	S 2378	Chemikalie
Taurin	Sigma	T 8691	Chemikalie
TMPD	Sigma	T 3134	Chemikalie
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemikalie