Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Da die erste systematische Beschreibung der Nebenschilddrüsen in der Human- und in mehreren anderen Arten von Sandström im Jahr 1880 1, das Verständnis der Bedeutung dieser kleinen endokrine Organ für die menschliche Physiologie und Krankheit hat sich kontinuierlich verbessert. Nebenschilddrüsen sezerParatHormon (PTH), das wichtigste Regulator des Kalziumstoffwechsels. PTH ist auch ein wichtiges Hormon für Phosphat – Homöostase und Knochenumsatz 1, 2. Unbeabsichtigter Entfernung oder Beschädigung der Nebenschilddrüsen während Hals – Chirurgie ist die häufigste Ursache für Hypoparathyreoidismus, eine Krankheit , die durch einen niedrigen Blutkalzium, niedrige PTH gekennzeichnet und erhöhte Phosphor 1.
Um eine bessere Studie erworbenen Hypoparathyreoidismus und Test neuartige Therapien, zuverlässige und leicht zugängliche Mausmodelle erforderlich sind. Mäuse werden weit verbreitet in der Forschung verwendet werden, weil eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen a sindvailable in dieser Spezies für mechanistische Studien in vivo ermöglicht. Während jedoch die chirurgische Parathyreoidektomie (PTX) bei Ratten verwendet werden können , 2, 3, 4, 5 und größeren Säugetieren 6, 7, 8, ist es technisch sehr anspruchsvoll in Mäusen wegen der geringen Größe der Drüsen und ihre variable anatomischen Verteilung 9. Daher wird in Mäusen thyreo-Parathyreoidektomie (TPTX) typischerweise durchgeführt, in denen die Schilddrüse und Nebenschilddrüsen zusammen 10 entfernt werden. Allerdings sind niedrige Schilddrüsenhormonspiegel ein potentieller Störfaktor in Experimenten, dieses Modell zu komplizieren. Zusätzlich C-Zellen in der Schilddrüse, die in Nagetieren wichtig in Calciumhomöostase Calcitonin, ein Hormon produzieren, werden auch beim Entfernen der th verlorenyroids 11.
Mehrere genetische Mausmodelle von Hypoparathyreoidismus existieren, die den PTH-null – Maus 12, die GCM2-null – Maus 13 und der Maus Nuf mit einem aktivierenden Mutation in der Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR) 14, 15 umfassen. Jedoch sind diese genetische Defekte bereits während der embryonalen Entwicklung und die Funktion der Nebenschilddrüsen ist daher bereits während der Embryonalentwicklung beeinträchtigt. Dies kann die Entwicklung von Organen, wie beispielsweise das Skelett beeinflussen. Dies steht im Gegensatz zu Patienten mit postoperativen Hypoparathyreoidismus, die die Krankheit im späteren Leben zu erwerben. Außerdem zeigen einige dieser Mausmodelle frühen Letalität und verminderte Fruchtbarkeit, die ihre Anwendung 12, 13 weiter erschwert, 14.
Wir entwickelten zwei neue Maus modelle für erworbene Hypoparathyreoidismus. Unter Verwendung genetisch Mäuse, die GFP speziell in den Nebenschilddrüsen ausdrücken lassen sich die Nebenschilddrüsen ohne Entfernung der Schilddrüse für die chirurgische Entfernung leicht identifiziert werden. Diese Maus wurde erzeugt , indem die PTH-Cre Maus kreuzt, die unter der Steuerung der 5,5 kb – Promotor PTH 16 mit dem ROSA mTmG Maus Cre – Rekombinase exprimiert. Die resultierenden PTHcre; mTmG Mäuse exprimieren das grün fluoreszierende Protein spezifisch in Nebenschilddrüsenzellen. Die zweite Maus-Modell verwendet die gleiche PTH-Cre, diesmal eine STOP-Kassette aus dem induzierbaren DTR Maus, was die Expression des Diphtherietoxin-Rezeptor spezifisch in den Nebenschilddrüsen zu entfernen. Eine systemische Verabreichung von DT zerstört Nebenschilddrüsenzellen, wodurch die Tiere ohne Operation hypoparathyroid.
Die beiden Mausmodelle in dieser Studie präsentierten zeigen einen stabilen hypocalcämische Phänotyp über den dreimonatigen Beobachtungs period. Die Verfahren sind leicht durchzuführen, ist der Phänotyp reproduzierbar und die hypoparathyroid Mäuse eine hohe Überlebensrate 17 aufweisen.
Wir demonstrieren die Technik der GFP-geführten Parathyreoidektomie mit transgenen Mäusen, die mit GFP-Expression selektiv in den Nebenschilddrüsen. In den PTHcre; mTmG Mäuse, die doppelte Fluoreszenz (die grüne GFP in Cre-Zellen exprimiert und rote Tomaten in nicht-Cre ausgedrückt Zellen) konnten wir eindeutig zu identifizieren und genau alle Nebenschilddrüsen entfernen, ohne die Schilddrüsen zu entfernen. Während wir den Einsatz der Doppelfluoreszenz mTmG Mäuse für die Fähigkeit zu identifizieren leuchtrot nicht Parat Gewebe bevorzugt, sollte sich unser Verfahren auch gut einzelnen fluoreszierenden Tiere wie die Tomate rot (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 mit Arbeit ( CAG-tdTomato) hze / J) Maus. Das Verfahren ist relativ einfach durchzuführen, erfordert etwa 20 min pro Maus, und führt zu einer starken und anhalt hypoparathyroid Phänotyp.
Darüber hinaus ist ein weiterer Vorteil der GFP-positive Nebenschilddrüsen ist die einfache Detektion von aberrant Nebenschilddrüsen. Unsere Studien zeigen,Mislokalisation der Epithelkörperchen in etwa ein Viertel der B6 – Mäusen (Abbildung 1), die durch die grüne Fluoreszenz in unserem Mausmodell leicht erkannt werden. Im Gegensatz zu thyreo-Parathyreoidektomie vermeidet unserer Technik, um die Entfernung der Schilddrüse mit nachfolgender Bedarf für die Hormonersatz Schilddrüse und die unbekannte Wirkung der Entfernung von Calcitonin-produzierende C-Zellen der Schilddrüse. Fluoreszenzmarkierten Nebenschilddrüsen auch für andere Untersuchungen verwendet werden könnten, die die Isolierung der Nebenschilddrüsen erfordern. Die Begrenzung dieses Modells enthält die Forderung nach der Operation. Grund Mikrochirurgie Fähigkeiten und einem Präpariermikroskop mit einer fluoreszierenden Lichtquelle benötigt.
Eine zweite Technik zum Erzeugen hypoparathyroid Mäuse, die die Notwendigkeit einer Operation beseitigt wird demonstriert. Diphtherietoxin behandelten PTHcre-IDTR Mäuse eine mildere hypoparathyroidism Phänotyp aufweisen, sondern einfach erfordern DT intraperitoneal in die Maus injiziert wird. Der kritische Teil for Erzeugung dieses Modells wurde die Optimierung der Dosis und Dosierungsschema. Hohe Dosen von DT führte zu Toxizität, aber niedrige Dosen verringert die Wirksamkeit des Ansatzes. Wir stellten fest, dass die Dosis Regiment von 2 Injektionen bei 5 ug / kg, verabreicht 3 Tage auseinander, führte zu zuverlässigen und stabilen Hypokalzämie ohne / minimale Sterblichkeit.
Letztendlich hoffen wir, dass diese beiden Ansätze nützliche Mausmodelle für erworbene hypoparathyroidism bieten. Verwendung eines neuartigen langwirksamen PTH berichteten wir über die erste Verwendung beider dieser Modelle bei der Bestimmung der Wirksamkeit von neuen Arzneimitteln für Hypoparathyreoidismus 17.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die NIH gewährt R01-DK100584 und China State Key Laboratory of Oral Diseases Offene Finanzierung SKLOD2015OF01 (RB). Wir danken Wenping Zhao, Tadatoshi Sato und Kelly Lauter um Hilfe.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |