Method Article

Dos técnicas para crear ratones hipoparatiroidismo: Una paratiroidectomía utilizando GFP Glándulas y Difteria-mediadas por toxinas paratiroidea Ablación

DOI:

10.3791/55010

⸱

March 14th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Endocrine Unit, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2West China School of Stomatology, Sichuan University, 3Department of Oral Medicine, Infection and Immunity, Harvard School of Dental Medicine, 4State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los ratones con hipoparatiroidismo adquirido serían útiles para estudiar nuevas terapias farmacológicas para el hipoparatiroidismo. Se demuestran dos procedimientos para crear este tipo de ratones. El ratón GFP-PTX se genera mediante paratiroidectomía quirúrgica guiada por glándulas paratiroides fluorescentes verdes. Un segundo abordaje, no quirúrgico, se basa en la expresión paratiroidea específica del receptor de la toxina diftérica.

Abstract

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El hipoparatiroidismo (HP) es un trastorno caracterizado por bajos niveles de PTH que conducen a hipocalcemia, hiperfosfatemia y bajo recambio óseo. La causa más común de la enfermedad es la extirpación accidental de las glándulas paratiroides durante la cirugía de tiroides. Se necesitan terapias novedosas para la HP, pero para probarlas se necesitan modelos animales fiables de la HP adquirida.

Aquí, demostramos la generación de dos modelos de ratón de HP adquiridos. En el modelo GFP-PTX, se crearon ratones con proteína verde fluorescente (GFP) expresada específicamente en las paratiroides (PTHcre-mTmG) cruzando ratones PTHcre+ con ratones Rosa-mTmGfl/fl. Las glándulas paratiroides fluorescentes verdes se identifican fácilmente bajo un microscopio de disección de fluorescencia y la paratiroidectomía se realiza en menos de 20 minutos. Después de la cirugía guiada por fluorescencia, los ratones presentan una hipocalcemia profunda. A diferencia de la tiroparatiroidectomía tradicional, este enfoque quirúrgico preciso deja intactas las glándulas tiroides y la función tiroidea. El segundo modelo, que no requiere cirugía, se basa en un enfoque de difteria-toxina. Los ratones PTHcre-iDTR, que expresan el receptor de la toxina diftérica (DT) específicamente en las paratiroides, se generaron cruzando el ratón DTR inducible con el ratón PTHcre. De este modo, las células paratiroideas se vuelven sensibles a la toxina diftérica (DT) y pueden destruirse selectivamente inyectando sistemáticamente DT a ratones. El fenotipo hipocalcémico resultante es estable.

Introduction

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Desde la primera descripción sistemática de las glándulas paratiroides en humanos y en otras especies por Sandström en 1880 1, la comprensión de la importancia de este pequeño órgano endocrino para la fisiología humana y la enfermedad ha mejorado continuamente. Estas glándulas secretan la hormona paratiroidea (PTH), el principal regulador del metabolismo del calcio. La PTH es también una hormona importante para la homeostasis fosfato y el recambio óseo 1, 2. La eliminación accidental o daño de las paratiroides durante la cirugía de cuello es la causa más común de hipoparatiroidismo, una enfermedad caracterizada por niveles bajos de calcio, PTH baja, y el fósforo elevados 1.

Para un mejor estudio adquirida hipoparatiroidismo y la prueba de nuevas terapias, fiable y fácilmente se requieren modelos de ratones accesibles. Los ratones se usan ampliamente en la investigación debido a una amplia variedad de herramientas genéticas son unavailable en esta especie que permiten estudios sobre los mecanismos sofisticados in vivo. Sin embargo, mientras que la paratiroidectomía quirúrgica (PTX) se puede utilizar en las ratas 2, 3, 4, 5, y los mamíferos más grandes 6, 7, 8, es técnicamente muy difícil en los ratones, debido al tamaño pequeño de las glándulas y su distribución anatómica variable de 9. Por lo tanto, Thyro-paratiroidectomía (TPTX) se lleva a cabo normalmente en ratones, en los que la tiroides y glándulas paratiroides se retiran juntos 10. Sin embargo, los niveles bajos de la hormona de la tiroides son un potencial de confusión en los experimentos, lo que complica este modelo. Además, las células C dentro de la glándula tiroides, que producen calcitonina, una hormona importante en la homeostasis del calcio en los roedores, también se pierden después de la retirada de los THyroids 11.

Existen varios modelos genéticos de ratón de hipoparatiroidismo, que incluyen el ratón PTH-12 nulos, el ratón nulo GCM2 13, y el ratón Nuf con una mutación activadora en el receptor sensible al calcio (RSCa) 14, 15. Sin embargo, estos defectos genéticos ya están presentes durante el desarrollo embrionario, y la función de las paratiroides tanto, es ya deteriorados durante la embriogénesis. Esto puede afectar el desarrollo de órganos tales como el esqueleto. Esto contrasta con los pacientes con hipoparatiroidismo postquirúrgico que adquieren la enfermedad más adelante en la vida. Por otra parte, algunos de estos modelos de ratón exhiben letalidad temprana y reducción de la fertilidad, lo que complica aún más su uso 12, 13, 14.

Hemos desarrollado dos nuevos ratón modelos el hipoparatiroidismo adquirida. Utilizando ratones manipulados genéticamente que expresan GFP específicamente en las paratiroides permite a las glándulas paratiroideas para ser fácilmente identificados por la extirpación quirúrgica sin la eliminación de la glándula tiroides. Este ratón se generó por cruzar el ratón PTH-Cre, que expresa Cre recombinasa bajo el control del promotor de PTH 5,5 kb 16 con el ratón ROSA mTmG. Los PTHcre resultantes; mTmG ratones expresan la proteína verde fluorescente específicamente en las células paratiroideas. El segundo modelo de ratón utiliza el mismo PTH-Cre, esta vez para eliminar un casete de STOP del ratón DTR inducible, lo que resulta en la expresión del receptor de toxina de la difteria específicamente en las paratiroides. La administración sistémica de DT destruye las células paratiroideas, haciendo que los animales hipoparatiroidismo sin necesidad de cirugía.

Los dos modelos de ratón presentados en este estudio demuestran un fenotipo hipocalcemia estable en los peri observación de tres mesessobredosis. Los procedimientos son fáciles de realizar, el fenotipo es reproducible, y los ratones hipoparatiroidismo exhiben una alta tasa de supervivencia 17.

Protocol

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Este estudio ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) del Hospital General de Massachusetts. Obtener la aprobación institucional adecuado para este estudio en animales antes de comenzar. Algunas técnicas podrían tener que ser ajustados de acuerdo con los requisitos locales IACUC.

1. Los ratones GFP-PTX

  1. Obtener ratones PTHcre + y ratones Rosa-mTmG a las 8 - 10 semanas de edad para su posterior acoplamiento.
  2. Retrocruzamiento los ratones PTHcre + (129 mixtos; FVB fondo) con ratones C57BL / 6 de 6 generaciones para obtener ratones con C57BL / 6 antecedentes.
  3. Ratones inbreed PTHcre + para obtener PTHcre + / + ratones 17.
    NOTA: Para realizar el genotipado, extraer el ADN de la punta de la cola y utilizarla para PCR. Los cebadores de PCR para detectar la heterocigosidad y homocigosidad del transgén PTHcre son los siguientes: cebador directo A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, cebador inverso A ', TCAGATCACACCACACAGCA, forward imprimación B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, cebador inverso B ', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17.
  4. Cruz PTHcre + / + ratones con 16 ratones Rosa-mTmG 18. Destetar PTHcre; crías cuando mTmG 4 semanas de edad.
  5. Anestesie 8 - 10 semanas de edad PTHcre; ratones mTmG por inyección ip de tribromoetanol (Avertin) a 0,6 mg / g de peso corporal, o de otros agentes, como la ketamina / xilazina. Utilice buprenorfina 0,1 mg / kg sc cada 12 h como analgésico para 48 h después de la cirugía de acuerdo con un protocolo aprobado. Asegúrese de profundidad adecuada de la anestesia por el reflejo del dedo del pie pizca retirada u otros medios. Colocar el animal en posición supina.
  6. Ampliar y preparar a la región ventral del cuello por el afeitado de la piel con cuchillas de simple canto. Desinfectar la piel afeitada con una almohadilla antiséptica de povidona yodada.
  7. Cubrir el animal con paños quirúrgicos estériles para reducir la contaminación de la zona quirúrgica y el uso de micrófono autoclaverosurgical instrumentos para el procedimiento quirúrgico.
  8. Cortar una incisión longitudinal 2 cm en la piel con un bisturí quirúrgico. Diseccionar la fascia y empujar las glándulas salivales a la banda mediante disección roma con pinzas dentadas curvadas.
  9. Bajo el microscopio de disección usando luz de halógeno y un 4 - aumento de 5X, cortar y separar los músculos paratraqueales Con unas pinzas afiladas puntas y exponer la tráquea.
  10. Identificar la glándula tiroides con la derecha y la izquierda del lóbulo situado al lado de la tráquea.
  11. Cambie la fuente de luz para la luz fluorescente y visualizar las dos glándulas paratiroides verde-fluorescente.
    NOTA: Por lo general, las dos glándulas paratiroides están localizadas en la superficie o cerca de la glándula tiroides, pero en ocasiones, se encuentran más lejos.
  12. Retirar con cuidado las glándulas paratiroides verdes utilizando pinzas quirúrgicas y tijeras. Utilice una gasa estéril para la hemostasia y comprobar cuidadosamente a lo largo de la tráquea para asegurar que todo el tejido verde ha sido retirado.
  13. Cierre los músculos paratraqueales sutura interrumpida por el uso de 6-0 poliglactina 910 puntos de sutura. Cerrar la incisión de la piel mediante sutura Halsted utilizando 6-0 poliglactina 910 puntos de sutura.
  14. Opcional: Inyectar 10 l / g de peso corporal solución normal estéril de cloruro de sodio 0,9% a los ratones para la reposición de líquidos.
  15. Coloque animales posquirúrgicas a una jaula separada en una incubadora caliente (37 ° C) para la recuperación de la temperatura corporal. Una vez que los ratones son despierto y en la posición reclinada, poner Chow pellet y agua con algo de comida de gelatina en el suelo de la jaula.
  16. Después de un periodo de observación post-quirúrgica de 2 h, ratón regresar a las instalaciones de los animales y los requisitos locales para el cuidado postoperatorio.
  17. 3 días después de la paratiroidectomía, obtener sangre de la cola 10 l y medir ionizado Ca ++ usando un analizador de sangre, tales como el sistema de gases en sangre Ca ++ / analizador de pH. Paratiroidectomía resultados exitosos en la sangre ionizadas Ca ++ igual o inferior a -2 DE de con operación simuladalos ratones de control (1,20 mmol / L en nuestros experimentos de n = 30).

2. PTH-CRE-IDTR ratones

  1. Obtener PTHcre + y DTR fl / fl ratones a las 8 - 10 semanas de edad para el apareamiento.
  2. Retrocruzamiento los ratones PTHcre (129 mixtos; FVB fondo) con ratones C57BL / 6 de 6 generaciones para obtener ratones con C57BL / 6 antecedentes.
  3. Inbreed la PTHcre + (C57BL / 6 antecedentes) ratones para obtener PTHcre + / + ratones 17.
    NOTA: Para realizar el genotipado, se extrajo y se utiliza para la PCR de ADN de ratones puntas de la cola. Los cebadores de genotipado: cebador directo, un cebador inverso, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA A ', TCAGATCACACCACACAGCA, el cebador B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, cebador inverso B', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17.
  4. Aparearse PTHcre + / + ratones con 16 DTR fl / fl ratones 19 para obtener ratones PTHcre-IDTR.
  5. Preparar la solución DT diluyendo diphtheriun polvo de toxina con solución salina estéril hasta una concentración de 0,5 mg / ml. Filtro estéril, y almacenar alícuotas a -80 ° C.
  6. Elija 8 - 10 semanas de edad ratones PTHcre-IDTR para experimento de inyección. Descongelar DT alícuota a temperatura ambiente, administrar DT intraperitonealmente a 5 mg / kg (10 l / g) de peso corporal del animal. Para una eficiencia máxima y menos toxicidad, administración DT se repite para un total de 2 inyecciones en un intervalo de 3 días 17.
  7. 3 días después de la segunda inyección, tomar 10 l de sangre de la cola de cada PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmG ratón y medir el Ca ++ sangre utilizando un Sistema de Ca ++ analizador de gases en sangre / pH.
    NOTA: Definimos ratones con sangre ionizados Ca ++ menor que 1,18 mmol / L como ratones hipoparatiroidismo, que es igual a 2SD por debajo de la media de los ratones de control con vehículo inyectado (n = 22).

Results

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Ubicación de la glándulas paratiroides

En primer lugar, se registró la distribución de las glándulas paratiroides de 54 ratones PTHcre-mTmG como se observa bajo el microscopio de disección fluorescente. 74% (40/54) ratones tenían dos glándulas paratiroides verdes (Figura 1 A, C, E), 26% (14/54) ratones tenían un tercer glándula paratiroidea adicional (Figura 1 B, D, F). No se observó ratón con un solo glándula o más de tres glándulas. Por lo general, las glándulas paratiroides se encuentran cerca del borde superior de la glándula tiroides (58%, 71/122; Figura 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) glándulas se encuentran cerca del borde inferior de la glándula tiroides (Figura 1C (1), D (3), F (1)), y el 13% (16/122) se encuentra lejos de la tglándula hyroid (Figura 1B (3), E (1), F (2)). Nuestros resultados son consistentes con los resultados anteriores y se extienden de diferentes lugares de las glándulas paratiroides 20.

Los ratones GFP-PTX

La cirugía completa de la anestesia para el cierre de la incisión de la piel se llevó aproximadamente 20 min por ratón. La tasa de supervivencia de los ratones posquirúrgicas más de un período de observación de 3 meses fue del 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) ratones GFP-PTX exhibieron niveles de calcio ionizado que eran 2 DE por debajo de la media de los ratones de control con operación simulada o inferior. El fenotipo hipoparatiroidismo en los ratones GFP-PTX (hipocalcemia, bajo PTH y fosfato sérico elevado) se mantuvo estable durante todo el tiempo de observación de 3 meses. Es importante destacar que la función tiroidea no era diferente de los animales con operación simulada 3 meses después de la cirugía (TSH = 42 ± 24 frente a 30 ± 15 mU / L, p = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs. 3,1 ± 0,9 mg / dl, p = 0,707 (Figura 2).

PTH-cre-IDTR ratones

DT ratones inyectados con PTH-Cre-IDTR hipoparatiroidismo desarrollado (calcio ionizado en sangre baja, fósforo arterial elevada, y los niveles de PTH inapropiadamente bajos de lo normal). Anteriormente hemos informado de que las células positivas algunos de PTH escapar de la ablación por toxina de la difteria, explicando la medible PTH circulante y la por lo tanto, el fenotipo algo más suave de estos ratones 17.

Hipoparatiroidismo en ratones GFP-PTX y PTH-cre-IDTR ratones

Se observaron reducciones significativas de Ca ++ en la sangre y los niveles séricos de PTH en PTX-GFP ratones 3 días después de la cirugía, en comparación con los niveles encontrados en los ratones con operación simulada (Ca ++ = 1,05 ± 0,40 vs. (Figura 3A, reimpreso con el permiso del (referencia # 17)). Después de 2 inyecciones de 5 mg / kg DT en 3 días de intervalo, una dosis y régimen optimizado para utilizar la menor cantidad de DT para dar el fenotipo hipoparatiroidismo máxima, el DT inyectado ratones de IDTR PTH-cre mostraron hipocalcemia significativa y la reducción de la PTH en comparación con los ratones de control del vehículo, que persistieron durante el periodo de observación de 90 días (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / L vs 1,26 ± 0,05 mmol / l, p <0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml frente a 572 ± 164 pg / ml, p <0,05) (Figura 3B, reimpreso con el permiso del (referencia # 17)).

figure-results-1
Figura 1: (A, C, E) o tres (B, D, F) glándulas paratiroides verdes. Glándulas paratiroides La mayoría se encuentran cerca del borde superior (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F cerca del borde inferior (3) o de la glándula tiroides (C (1), D (3), F (1)). En casos raros, algunos se encuentra ectópica (B (3), E (1), F (2)). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: la TSH y T4 Nivel de ratones GFP-PTX. 3 meses después de GFP-PTX, se obtuvo el suero de TSH y T4 measurem entos. GFP-PTX ratones mostraron concentraciones de TSH (42 ± 24 mU / L) las concentraciones de (A) y T4 (3,0 ± 0,6 mg / dl) (B) que no eran diferentes de los ratones de control (TSH = 30 ± 15 mU / L, P = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: La sangre de Ca ++ y los niveles de PTH en ratones GFP-PTX y DT-ratones inyectados IDTR PTH-cre. Ambos ratones GFP-PTX (A) y DT inyectaron PTH-cre-IDTR ratones (B) exhibió hipocalcemia estable y reducen los niveles de PTH más de 3 meses periodo de observación (N = 6 - 8, *** p <0,001) (re-impreso con la autorización de referencia # 17).en / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

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Demostramos la técnica de paratiroidectomía GFP guiada por el uso de ratones transgénicos con la expresión de GFP selectivamente en las glándulas paratiroides. En los PTHcre; mTmG ratones, el doble de fluorescencia (GFP verde en las células expresadas por Cre y tomate rojo en la no-Cre expresó células) nos ha permitido identificar con claridad, y para extraer con precisión todas las glándulas paratiroides sin la eliminación de la tiroides. Aunque preferimos el uso de la doble fluorescencia mTmG ratones para la capacidad de identificar tejido no paratiroidea rojo fluorescente, nuestro procedimiento también debería funcionar bien el uso de animales fluorescentes individuales tales como el rojo tomate (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) / J del ratón Hze). El procedimiento es relativamente fácil de realizar, requiere aproximadamente 20 min por ratón, y los resultados en un fenotipo grave hipoparatiroidismo y sostenido.

Además, otra ventaja de las glándulas paratiroides positivas para GFP es la facilidad de detección de las glándulas paratiroides aberrantes. Nuestros estudios demuestranmislocalization de las paratiroides en aproximadamente un cuarto de los ratones B6 (Figura 1), que son detectados fácilmente en nuestro modelo de ratón por la fluorescencia verde. Contrariamente a Thyro-paratiroidectomía, nuestra técnica evita la eliminación de la tiroides con la consiguiente necesidad de reemplazo de la hormona tiroidea y el efecto desconocido de la eliminación de células C de la tiroides productoras de calcitonina. glándulas paratiroides marcadas fluorescentemente se podrían también utilizar para otras investigaciones que requieren el aislamiento de las glándulas paratiroides. La limitación de este modelo incluye el requisito para la cirugía. Se requieren habilidades básicas de microcirugía y un microscopio de disección con una fuente de luz fluorescente.

Una segunda técnica para generar ratones hipoparatiroidismo que elimina la necesidad de cirugía se demuestra. La toxina de la difteria-ratones tratados PTHcre-IDTR exhiben un fenotipo más leve hipoparatiroidismo, sino que simplemente requieren la inyección de DT por vía intraperitoneal en el ratón. La parte fundamental for generando este modelo fue la optimización de la dosis y el régimen de dosificación. Las altas dosis de DT llevaron a toxicidad, pero las dosis bajas disminuyó la eficacia del enfoque. Se determinó que el regimiento dosis de 2 inyecciones a 5 mg / kg, administrada 3 días de diferencia, dio lugar a hipocalcemia fiable y estable sin mortalidad / mínima.

En última instancia, esperamos que estos dos enfoques proporcionan modelos útiles de ratón para el hipoparatiroidismo adquirida. Usando una nueva PTH de acción prolongada, se informó de la primera utilización de ambos de estos modelos para determinar la eficacia de nuevos fármacos para el hipoparatiroidismo 17.

Disclosures

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R01-DK100584 y Laboratorio Estatal de China de las Enfermedades Orales SKLOD2015OF01 Financiación abierta (RB). Agradecemos a Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, y Kelly Lauter en busca de ayuda.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ratones ROSAmT/mGRatones The Jackson Laboratory7676
PTH-CreThe Jackson Laboratory5989
iDTRmiceThe Jackson Laboratory7900
6-0 polyglactin 910 sutura con agujaEthicon, IncJ510G
Hojas de afeitar de seguridad de un solo filoAmericana de Navajas de Afeitarde Seguridad66-0089
Maquinilla de afeitar de seguridad de plumasbisturí desechable72042-11
Almohadillas de preparación de povidona-yodoDynarex Corporation1108
Gasade capa Busse. IncBHD707
Solución de cloruro de sodio al 0,9%HOSPIRA Worldwide, Inc07983-09
1 mL 29 g Jeringa de insulinaBECTON DICKINSON329622
cortinas de inciso quirúrgicas3M6640EZ
Pinzas de Dumstar BiologyRoboz Surgical Instrument Co., IncRS-4984
Micro Tijeras de resorte de disecciónRoboz Surgical Instrument Co., IncRS-5605
PortaagujasMILTEX.,IncV98-42
2,2,2-TribrometanolSigma-AldrichT48402
2-Metil-2-ButanolSigma-Aldrich152463para disolver el polvo de toxina diftérica 2,2,2-tribrometanol
Sigma-AldrichD0564Disolver en una solución de cloruro de sodio al 0,9% a 1 mg/mL como solución madre en -80 ° C
Tubos capilares de extracción de sangre MulticapSiemens Healthcare Diagnostics Ltd855578Para la extracción de sangre en el análisis de iCa2+ utilizando el analizador RapidLab 348 Ca2+/pH
RapidLab 348 Ca2+/pHSiemens Healthcarepara el análisis de iCa2+
Compañía de Co., LTD

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