Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Sedan den första systematisk beskrivning av bisköldkörtlarna inom human- och i flera andra arter av Sandström 1880 1, att förstå betydelsen av denna lilla endokrina organ för människans fysiologi och sjukdom kontinuerligt har förbättrats. Bisköldkörtlarna utsöndrar parathormon (PTH), den huvudsakliga regulatorn av kalciummetabolismen. PTH är också ett viktigt hormon för fosfat homeostas och benomsättning 1, 2. Oavsiktlig borttagning eller skada av bisköldkörteln under halskirurgi är den vanligaste orsaken till hypoparatyreoidism, en sjukdom som kännetecknas av låg kalciumhalt i blodet, lågt PTH, och förhöjda fosfor 1.
För att bättre studera förvärvade hypoparatyreoidism och test nya terapier, tillförlitlig och lättillgänglig musmodeller krävs. Möss används ofta i forskning eftersom ett stort antal olika genetiska verktyg är enTillgängligt i denna art tillåter avancerade mekanistiska studier in vivo. Men medan kirurgisk paratyreoidektomi (PTX) kan användas i råttor 2, 3, 4, 5 och större däggdjur 6, 7, 8, är det tekniskt mycket utmanande i möss på grund av den lilla storleken på de körtlar och deras variabla anatomisk fördelning 9. Därför thyro-paratyreoidektomi (TPTX) vanligen utförs på möss, där sköldkörteln och bisköldkörtlarna avlägsnas tillsammans 10. Men låga sköldkörtelhormonnivåer är en potentiell confounder i experiment, vilket komplicerar denna modell. Dessutom är C-celler inom sköldkörteln, som producerar kalcitonin, ett hormon viktigt i kalciumhomeostas hos gnagare, också förlorat vid avlägsnande av de thyroids 11.
Flera genetiska musmodeller av hypoparatyreoidism existerar, vilka inkluderar PTH-noll mus 12, den GCM2-noll mus 13, och Nuf mus med en aktiverande mutation i kalcium-sensing receptor (CASR) 14, 15. Dessa genetiska defekter finns redan under fosterutvecklingen, och funktionen av bisköldkörteln därför redan nedsatt under embryogenes. Detta kan påverka utvecklingen av organ såsom skelettet. Detta kontrasterar med patienter med postsurgical hypoparatyreoidism som förvärvar sjukdomen senare i livet. Dessutom har några av dessa musmodeller uppvisar tidig dödlighet och minskad fertilitet, vilket ytterligare försvårar deras användning 12, 13, 14.
Vi utvecklade två nya mus models för förvärvade hypoparatyreoidism. Använda genetiskt modifierade möss som uttrycker GFP specifikt i bisköldkörteln gör bisköldkörtlarna att lätt kunna identifieras för kirurgiskt avlägsnande utan att ta bort sköldkörteln. Denna mus genererades genom att korsa PTH-Cre-mus, som uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av den 5,5 kb PTH-promotorn 16 med ROSA mTmG musen. De resulterande PTHcre; mTmG möss uttrycker grönt fluorescerande protein specifikt i bisköldkörtelceller. Den andra musmodell använder samma PTH-Cre, denna gång för att ta bort en STOP-kassetten från den inducerbara DTR mus, vilket resulterar i expression av difteritoxinreceptorn specifikt i bisköldkörteln. Systemisk administrering av DT förstör bisköldkörtelceller, vilket gör djuren hypoparathyroid utan kirurgi.
De två musmodeller som presenteras i denna studie visar en stabil hypokalcemisk fenotyp under de tre månader observations period. Förfarandena är lätta att utföra, är fenotypen reproducerbar, och de hypoparathyroid möss uppvisar en hög överlevnadsfrekvens 17.
Vi visar tekniken med GFP styrd paratyreoidektomi använder transgena möss med GFP uttryck selektivt i bisköldkörtlarna. I PTHcre, mTmG möss, dubbel fluorescens (grön GFP i Cre-uttryckta celler och röd tomat i icke-Cre uttryckte celler) gjorde det möjligt att tydligt identifiera och att exakt ta bort alla bisköldkörtlar utan att ta bort sköldkörteln. Även om vi föredrar att använda dubbel fluorescens mTmG möss för förmågan att identifiera fluorescerande röd icke-parat vävnad, bör vårt förfarande även fungerar bra med enskilda fluorescerande djur såsom tomat röda (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) mus. Proceduren är relativt lätt att utföra, kräver ca 20 min per mus, och resulterar i en allvarlig och varaktig hypoparathyroid fenotyp.
Dessutom är en annan fördel med de GFP-positiva bisköldkörtlarna hur lätt detektering av avvikande bisköldkörtlarna. Våra studier visarmislocalization av bisköldkörteln i ungefär en fjärdedel av B6-möss (figur 1), vilka lätt detekteras i vår musmodell av grön fluorescens. I motsats till thyro-paratyreoidektomi, undviker vår teknik avlägsnande av sköldkörteln med efterföljande behov av sköldkörtelhormonersättning och den okända effekten av avlägsnande av kalcitonin-producerande sköldkörtel C-celler. Fluorescensmärkta bisköldkörtlar kunde även användas för andra undersökningar som kräver isolering av bisköldkörtlarna. Begränsningen av denna modell inkluderar krav på kirurgi. Grundläggande mikrokirurgi kompetens och en dissektion mikroskop med en fluorescerande ljuskälla behövs.
En andra teknik för att generera hypoparathyroid möss som eliminerar behovet av kirurgi, demonstreras. Difteritoxin-behandlade PTHcre-IDTR möss uppvisar en mildare hypoparatyreoidism fenotyp, men helt enkelt kräva att injicera DT intraperitonealt i musen. Den kritiska delen for att generera denna modell optimering av dosen och behandlingsperiod. Höga doser av DT ledde till toxicitet men låga doser minskade effekten av tillvägagångssättet. Vi bestämde att dosen regemente 2 injektioner på 5 mikrogram / kg, administrerad 3 dagars mellanrum, resulterade i tillförlitlig och stabil hypokalcemi utan / minimal dödlighet.
I slutändan hoppas vi att dessa två tillvägagångssätt ge användbara musmodeller för förvärvade hypoparatyreoidism. Med hjälp av en ny långverkande PTH, rapporterade vi den första användningen av båda dessa modeller för att bestämma effekten av nya läkemedel för hypoparatyreoidism 17.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-DK100584 och Kina staten Key Laboratoriet för munsjukdomar Open finansiering SKLOD2015OF01 (RB). Vi tackar Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, och Kelly Lauter för hjälp.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |