ADSC-sheet Transplantation Stricture nach Erweiterte Speiseröhren Endoskopische Submukosa Dissektion zu verhindern

Zusammenfassung

Diese Studie berichtet über eine erfolgreiche Methode der endoskopischen Fettgewebe abgeleiteten Stromazellen (ADSC) -Blatt Transplantation für Ösophagusstriktur Prävention nach einer ausgedehnten endoskopischer Submukosadissektion (ESD) in einem Schweinemodell.

Zusammenfassung

In den vergangenen Jahren hat sich die Zell-Blatt-Konstrukt ein breites Interesse in der regenerativen Medizin vorangetrieben, vor allem für die rekonstruktive Chirurgie. Die Entwicklung von diversifizierten Technologien Fettgewebe abgeleiteten Stromazellen (ADSCs) mit verschiedenen Biomaterialien hat für den Bau von zahlreichen Arten von Tissue-Engineering-Ersatzstoffe, wie Knochen, Knorpel und Fettgewebe aus Nager, Schweine oder menschliches ADSCs geführt kombiniert. Erweiterte Speiseröhren endoskopische Submukosadissektion (ESD) ist verantwortlich für Ösophagusstriktur Bildung. Stricture Prävention bleibt eine Herausforderung, ohne effiziente Behandlungen zur Verfügung. Frühere Studien berichteten über die Wirksamkeit der Schleimhautzellen-Blatt-Transplantation in einem Hundemodell und beim Menschen. ADSCs zugewiesen worden sind entzündungshemmende Eigenschaften, lokale immunmodulierende Effekte, Neovaskularisation Induktion und Differenzierung Fähigkeiten in mesenchymalen und nicht-mesenchymale Linien. Diese ursprüngliche Studie beschreibt die endoskopische transplantation eines ADSC Tissue-Engineering-Konstrukt Ösophagusstriktur in einem Schweinemodell zu verhindern. Das Konstrukt wurde ADSC aufeinander auf einen Papierträger geschichtet Membran aus zwei allogenen ADSC Blätter zusammen. Die ADSCs wurden mit dem PKH67 fluorophormarkiertes zu testbasierte konfokale Laser Endomikroskopie (PCLE) Überwachung ermöglichen. Am Tag der Transplantation, eine 5-cm und Hemi-Umfangs ESD bekannt Ösophagusstriktur zu induzieren, wurde durchgeführt. Die Tiere wurden sofort endoskopisch mit 4 ADSC Konstrukte transplantiert. Die vollständige Haftung der ADSC-Konstrukte wurde nach 10 min der sanften Anwendung erhalten. Die Tiere wurden am Tag getötet 28. Alle Tiere erfolgreich transplantiert wurden. Die Transplantation wurde am Tag 3 mit einem positiven PCLE Auswertung bestätigt. Im Vergleich zu transplantierten Tieren entwickelte Kontrolltieren schwere Strikturen, mit großen Entwicklungs fibrotischen Gewebes, häufigere Verdauungsleiden und verminderte Gewichtszunahme. In unserem Modell die Transplantation von allogenic ADSCs, organisiert in Doppelzellschichten, nach längerer ESD war erfolgreich und stark mit einer niedrigeren Ösophagusstriktur Rate verbunden.

Einleitung

Das Management von oberflächlichen Tumoren der Speiseröhre hat sich mit der Entwicklung neuer endoskopischer Techniken verändert. Heutzutage ist die endoskopische Resektion der First-Line-Behandlung. Tatsächlich ist es mit einer geringeren Morbidität und Mortalität als eine Operation mit gleicher onkologischen Ergebnisse ^{1, 2, 3} verbunden. EMR (EMR) und endoskopische Submukosa-Resektion (ESD) sind die am häufigsten verwendeten Techniken. Im Falle eines verlängerten oberflächlicher Tumor ist ESD bevorzugt. Im Vergleich zu EMR ermöglicht ESD en bloc Resektion, unabhängig von der Größe der Läsion und ^{4 formen, 5, 6.} Die Haupt verzögert Komplikation der ESD ist Ösophagusstriktur Bildung, die zwischen einer und zwei Wochen nach der Resektion der Regel auftritt. Jüngste Studien veröffentlicht haben, dass Strikturenbildung gezeigt korreliert dieGröße der Resektion. Die japanische Endoskopische Society empfiehlt die Vermeidung ESD Größen von mehr als ¾ der Speiseröhre Umfang, weil sie mit einer Stenose Entwicklung in mehr als 90% der Fälle und sind für schwere Fütterung Schwierigkeiten und wesentliche Verschlechterung der Lebensqualität verantwortlich verbunden sind.

Die Verhinderung von Ösophagusstriktur bleibt eine Herausforderung. Mechanismen in Strikturenbildung beteiligt sind nur teilweise bekannt. Strikturen Formationen scheint aus der Vereinigung von zwei unterschiedlichen Mechanismen zu führen: ⁷ (1) pro-inflammatorischen Zellrekrutierung und (2) eine übermäßige Fibrose Entwicklung. Mehrere präventive Behandlungen sind vorgeschlagen worden. Allerdings waren die Ergebnisse unbefriedigend, mit wenig Nutzen und schwere Nebenwirkungen ^{8, 9.} Vor kurzem wurde eine japanische Team, Ohki et al. Vorgeschlagen, eine einlagige Zellschicht von autologem Mundschleimhautzellen in die Esoph zu verpflanzenageal Narbe. Transplantation wurde durchgeführt , unmittelbar nach der ESD ^{10, 11.} Sie zeigten die Wirksamkeit dieses innovativen Ansatzes, zunächst in einem Hunde-Modell und dann bei Patienten.

Fettgewebe abgeleiteten Stromazellen (ADSCs) sind in der regenerativen Medizin vielversprechend. Ihre Anwendung in verschiedenen Bereichen hat interessante Ergebnisse gezeigt, insbesondere in den Wundheilungsprozess. ADSC Therapie bietet mehrere Vorteile, da die Zellen leicht isoliert sind und mit entzündungshemmenden Eigenschaften, lokale immunmodulierende Effekte, Neovaskularisation Induktion verbunden sind , und die Differenzierung Fähigkeiten in mesenchymalen und nicht-mesenchymale Linien ^{12, 13, 14.}

In einer früheren Studie zeigte unser Team die Wirksamkeit der Doppel ADSC-Blatt endoskopische Transplantation für Ösophagusstriktur zurückention nach längerer ESD in einem Schweinemodell ^15. In diesem Artikel Technik Berichte von ADSC-Blechkonstruktion und endoskopischer Transplantation vorgestellt.

Protokoll

Alle Tiere wurden nach dem Animal Research Ethics Committee (Richtlinien des Französisch Ministerium für Landwirtschaft) behandelt. Das Protokoll erhielt die Zustimmung der lokalen Ethikkommission genehmigten Tier Experimente an der Universität Paris Descartes (Registernummer MESR 2035,02; Medizinische Fakultät Paris Descartes, Paris, Frankreich).

1. ADSC Kultur und Labeling

1. Erhalten bestätigte ADSCs von einer privaten Institution. Kultur allogenen ADSCs bei 37 ° C und 5% CO ₂ mit alpha essentiellem Minimalmedium mit 10% fötalem Kalbsserum und 1% Antibiotika (Penicillin und Streptomycin).
2. Erhalten etwa 24 x 10 ⁶ ADSCs pro Tier unter Verwendung von Standard - Zellexpansionsverfahren (37 ° C und 5% CO _2). Ernte der ADSCs unter Verwendung einer Standard-Trypsin-Lösung (10 mL für eine T150-Schale). Führen Zellzählung mit einem Hämozytometer.
3. Führen Markierung von Zellen am Tag vor der Transplantation mit der PKH67 Färbung procedure beschrieben.
   HINWEIS: Das Ziel des Färbeverfahrens ist Zellverfolgung nach der Transplantation zu ermöglichen.
   1. Um 2 x 10 ⁶ ADSCs zu beschriften, bereiten Lösung A (2 x 10 ⁶ Zellen mit 100 & mgr; l Diluent C) und Lösung B (4 ul PKH67 mit 1 ml Diluent C).
   2. Inkubieren Lösungen A und B für 2 min. Dann fügen Sie 100 ul fötalen Kalbsserum für 1 min.
   3. Spülen der Lösung mit 300 ul mit Citrat versetztem RPMI (298,5 & mgr; l RPMI und 1,5 ul Citrat) und zentrifugieren bei 1.500 xg für 5 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 mal. Pflegen Sie die markierten Zellen und schützen sie vor Licht bis Blechkonstruktion.

2. Doppel ADSC-Blatt-Construct

1. Am Tag vor der Transplantation, bereiten eine 12-Well-temperaturempfindlichen Zellkulturschale mit 4 ml pro Vertiefung der Zellkulturmedium, wie oben beschrieben, vor PKH-Kennzeichnung. Seed die Schale mit 1,5 x 10 ⁶ PKH-labeled Zellen pro Vertiefung und Inkubation für 12 h (37 ° C und 5% CO _2).
2. Am Tag der Transplantation, abzulösen für 30 min die konfluente Zellschicht durch die Schale bei Raumtemperatur inkubiert.
3. Sanft anzusaugen einem ADSC Blatt mit einer Pipette und es auf einem hydrophoben Papierschicht (1,5 cm Durchmesser). Verwenden Sie dieses Papier als Trägermembran.
4. Fassen Sie ein anderes Blatt ADSC und sanft deponieren oben auf dem anderen eine Doppelschicht-Konstrukt zu erhalten.
5. Wiederholen Sie diese Verfahren, wie viele ADSC-Blatt-Konstrukte zu erhalten, wie erforderlich (4 pro Tier).

3. Speiseröhren Endoskopische Submukosa Dissektion (ESD)

1. Am Tag der Transplantation, Pre-medikamen die Tiere mit 10 mg / kg intramuskulär Ketamin und induzieren sie mit 8 mg / kg intravenös Propofol. Dann Intubation durchführen und die Narkose mit Isofluran 2,5% Inhalation erhalten.
2. Sobald das Tier in Narkose ist, führen ESD mit einem gastroscope, ein Videoskop und eine electro Einheit.
   1. Verwenden Sie ein endoskopisches Messer und Soft-Koagulation Hemi-Umfangsrückenmarken im Bereich von 40 cm bis 45 cm von der Zahnbogen zu erhalten.
   2. Injizieren einer Glycerinlösung Indigokarmin Farbstoff in die submucosale Schicht zur Trennung der Schleimhautschicht von der Muskelschicht enthält.
   3. Verwenden Sie ein endoskopisches Messer mit ENDOCUT I Modus Umfangs Einschnitte erhalten.
   4. Verwenden Sie ein endoskopisches Messer mit forcierter Koagulation-Modus, um die Submukosadissektion durchführen, von dem proximalen Einschnitt zum distalen Einschnitt bewegt.
3. Am Ende des ESD-Verfahrens, beobachten die Hemi-Umfangs, 5 cm lange Narbe Speiseröhren die Muskelschicht ausgesetzt wird.

4. Endoskopische Transplantation

1. Unmittelbar nach der ESD, endoskopisch Tiere transplantiert mit 4 Doppel ADSC-Blatt-Konstrukte.
   1. Fassen Sie eine ADSC-Blatt-Konstrukt mit endoskopischen Zange undschützen Sie es auf die Wundstelle während des Transports durch eine große, transparente endoskopische Kappe verwendet wird.
   2. Tragen Sie die gesamte Oberfläche des ADSC-Blatt-Konstrukt auf das Geschwür Bett.
   3. gelten vorsichtig die ADSC-Blatt-Konstrukt für 10 Minuten eine vollständige und stabile Verpflanzung zu erhalten. Zur Anwendung verwenden endoskopische Pinzette oder eine endoskopische Kappe und wenden die gesamte Oberfläche des ADSC auf die Speiseröhre Submukosa konstruieren.
2. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal für jedes Tier, um vier transplantierten und anhaftenden Doppelzelle Blatt Konstrukte zu erhalten.
   HINWEIS: Das Ziel approximativ Hälfte des verwundeten Bereich zu decken ist.

5. Postoperative Evaluierung und Follow-up

1. Für jedes Tier gewährleisten post-ESD Analgesie mit der intramuskulären Injektion von 0,2 mg / kg Morphin dreimal pro Tag für den ersten Tag und mit einer 28-Tage-anti-Säurebehandlung von Esomeprazol (40 mg / Tag). Führen Sie eine antibiotische Prophylaxe mit amoxicillin (1 g / Tag) 7 Tage lang. Autorisieren Flüssigkeiten am Tag 1 und Feststoffe am folgenden Tag.
2. Follow-up mit Tieren, die für 28 Tage. Erhalten Sie täglich klinische Bewertungen mit Mellow Pinkas Dysphagie Partituren ¹⁶ und Gewichtsschwankungen Messungen.
3. Multimodale Stenose Bewertung: unter Vollnarkose, an geplanten Tagen 3, 14 und 28 führen eine multimodale Auswertung von Strikturen Auftreten.
   1. Führen Sie eine endoskopische Auswertung mit Narbe Beschreibung, Stenose Messung und Papierträgermembran Erkennung. Messen Sie die Stenose mit dem Gastroskop durch die Stenose zu durchqueren (wobei der Durchmesser des Gastroskop beträgt 8 mm). Beachten Sie die Narbe, die Aufmerksamkeit auf die entzündliche Aspekt (Schleimhaut Erythem, Schleimhautödem und Schleimhaut spontane Blutungen) und die Abwesenheit oder Anwesenheit der Papierträgermembran innerhalb der Narbe.
   2. Bewerben PCLE grüne Sonde durch den Gastroskop Operator Kanal direkt in die Narbe Bett. Suchen Sie nach einer spontanenund Grün-Signal kompatibel mit PKH67-markierten ADSC-Blatt-Konstrukt Verpflanzung organisiert.
   3. Führen Sie zwei orthogonalen Fälle von Baryt esophagography mit einem Strahlen Reifen (vorne und linksseitige Fälle). Halten Sie die engste Inzidenz für Stenose Bewertung (Grad der Stenose (%) = [1- (Länge der kurzen Achse unter Stenose / Länge der normalen Achse unter Stenose) x 100)]) ^{17, 18.}
4. Tieropfer.
   1. Am Tag 28, am Ende des Follow-up-Periode, führen Sie das Tieropfer. Während das Tier noch unter Vollnarkose ist, injizieren 100 mg / kg intravenös Phenobarbital. Stellen Sie sicher, Tier Tod mit der klinischen Prüfung für das Fehlen eines Herzschlags und die Bewegung der Atmung.
   2. Nach einer Sternotomie und Organ Belichtung, entfernen Sie die Speiseröhre von jedem Tier getötet (mit 10% gepuffertem Formalin Fixierung, Paraffineinbettung und 4 um dicke Abschnitte). Stain die Folienmit Hematoxylin und Saffron ^15. Digitalisieren Sie die Folien für Computeranalyse und vergleichen Sie die Tiergruppen ^15.

Ergebnisse

Die Kultur der ADSCs und das Verfahren die ADSC Blatt zu erhalten , ist in Abbildung 1 dargestellt. Figur 2 zeigt den Aufbau des Transplantats, bestehend aus zwei ADSC Blätter geschichtet übereinander auf ihrer Papierträgermembran. ADSCs wurden zuvor mit dem PKH67 fluorophormarkiertes in vivo Transplantatüberwachung mit PCLE zu ermöglichen. Abbildung 3 zeigt die verschiedenen Schritte des erweiterten Speiseröhren endoskopischen ...

Diskussion

In diesem Schweinemodell war die ADSC-Blatt - Transplantation technisch erfolgreich, und die in vivo PCLE Auswertung für Zelle Verpflanzung Überwachung erlaubt. Klinische, endoskopische, radiologische und histologische Auswertungen zeigten die Wirksamkeit der endoskopischen ADSC Blatt bei Ösophagusstriktur Prävention nach längerer ESD.

Die endoskopische Transplantation eines ADSC Glycerinlösung ein Indigokarmin Farbstoffschicht enthält, ist ein innovativer Ansatz in der regenerative...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Transparente endoskopische Kappe Q180 kompatibel Olympus	Optical Co
GIF-Q180 Gastroskop	Olympus Optical Co
Videoskop System Exera II	Olympus Optical Co
Injektionsnadel 18 G	Olympus Optical Co
Elektrochirurgiegerät ERBE ICC 350	ERBE Technology
Indigo carmin 1%	Life
Endoskopisches Hybridmesser	Life
Minisonde Z pCLE grüne Sonde	Mauna Kea Technologie		Sie müssen lernen, wie man die Sonde benutzt. Die Manipulation könnte schwierig sein.
Fötales Rinderserum	Sigma Aldrich	12105C
Trypsin	Sigma Aldrich	T146
Alpha Minimum essentielles Medium	Thermo Fisher	22561-021
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 Farbstoffset	Sigma Aldrich	Mini67-KT
12-Well-Zelle mit ansprechender Temperatur Kulturschale	Upcell Thermo Scientific	174900	Fühlen Sie die Schale mit 4 mL Standard-Medium Kultur 30 Minuten vor der Aussaat der Zellen
Esomeprazol 40 mg	Biogaran
Moprhinsulfat 50 mg/ml	Lavoisier
Amoxicillin 1 g	Biogaran
Ketamin 250 mg/5 ml	Panpharma
Propofol, 10 mg/ml,	Fresenius
Hydrophobes Papier	Carrefour

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