Methodenartikel

Fluss Virometry zur Analyse Antigenic Spektren von Virionen und extracellular Vesikeln

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DOI:

10.3791/55020

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25. Januar 2017

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1Section on Intercellular Interactions, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 2Laboratory of Atherothrombosis, Cardiology Department, Moscow State University of Medicine and Dentistry, 3Sidra Medical and Research Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Viren oder extrazelluläre Vesikel wurden mit 15 nm magnetischen Nanopartikeln immungefangen, die an Antikörper gekoppelt sind, die Oberflächenantigene erkennen. Die gefangenen Virionen oder Vesikel wurden mit fluoreszierenden Antikörpern gegen andere Oberflächenantigene markiert. Die resultierenden Komplexe wurden in einem hohen Magnetfeld getrennt und mit herkömmlichen Durchflusszytometern, die auf Fluoreszenz ausgelöst wurden, analysiert.

Zusammenfassung

Zellen geben kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) an das umgebende Medium ab. Bei einer Virusinfektion setzen die Zellen auch Virionen frei, die die gleiche Größe wie einige der EVs haben. Sowohl Virionen als auch EVs tragen Proteine der Zellen, die sie erzeugt haben, und sind antigenisch heterogen. Trotz ihrer Diversität wurden sowohl Viren als auch EVs überwiegend durch Bulk-Analysen charakterisiert. Hier beschreiben wir eine originelle nanotechnologiebasierte Hochdurchsatzmethode, die die Charakterisierung von Antigenen auf einzelnen kleinen Partikeln mit regulären Durchflusszytometern ermöglicht. Viren oder extrazelluläre Vesikel wurden mit 15 nm magnetischen Nanopartikeln (MNPs) immungefangen, die an Antikörper gekoppelt waren, die eines der Oberflächenantigene erkannten. Die gefangenen Virionen oder Vesikel wurden mit fluoreszierenden Antikörpern gegen andere Oberflächenantigene inkubiert. Die resultierenden Komplexe wurden auf magnetischen Säulen von ungebundenen Antikörpern getrennt und mit herkömmlichen Durchflusszytometern analysiert, die auf Fluoreszenz ausgelöst wurden. Diese Methode ist vielseitig einsetzbar und kann zur Charakterisierung der antigenen Zusammensetzung von viralen und nicht-viralen kleinen Partikeln verwendet werden, die von Zellen in vivo und in vitro erzeugt werden. Im Folgenden finden wir Beispiele für die Anwendung dieser Methode zur Bewertung der Verteilung von Wirtszellmarkern auf einzelnen HIV-1-Partikeln, zur Untersuchung der Reifung einzelner Dengue-Virionen (DENV) und zur Untersuchung extrazellulärer Vesikel, die in den Blutkreislauf freigesetzt werden.

Einleitung

Zellen in mehrzelligen Organismen haben viele einzelne Merkmale, die entweder einzigartig für eine bestimmte Zelle oder zumindest zur einzigartigen Gruppen von Zellen gehören, sein kann. Selbst kultiviert zeigen geklonten Zellen individuellen Eigenschaften durch ihre unterschiedlichen Morphologie bewiesen wie. Außerdem wird eine Zelle die Individualität in den Produkten wider es absondert. Im Fall von viralen Infektion können virale Teilchen Proteine ​​aus den Zellen tragen, die sie produziert. Beispielsweise für HIV sind viele Wirtszellproteine in der Virushülle eingebettet und Viren, die von verschiedenen Zellen erzeugt werden , können diese charakteristischen Proteine 1, 2 oder "Zell Signaturen" tragen.

Auch ohne Infektion, lassen Sie Zellen in den Medien kleine extrazellulären Vesikeln (EVs) umgibt. Biogenesis dieser Vesikel und ihre Struktur in vielen Fällen ähnlich dem von Viren, insbesondere Retroviren. In den letzten Jahren ist es klar geworden,dass EVs, die zunächst betrachtet wurden "plättchen dust" 3 bilden eine wichtige physiologische System der Zell-Zell - Kommunikation. Zusammen mit zwei anderen Systemen der interzellulären Kommunikation, nämlich Zell-Zell - Wechselwirkungen und Kontakt freigesetzt lösliche Moleküle, koordinieren EVs normale Physiologie und an verschiedenen Pathologien 4, 5 einschließlich viraler Infektionen 6, 7 verändert werden .

Obwohl beide freigegeben virale Partikel und extrazelluläre Vesikel sehr unterschiedlich sind, werden sie überwiegend von bulk-Analyse charakterisiert, in der ihre individuellen Eigenschaften verloren gehen. Verfahren ähnlich Durchflusszytometrie, die auf ihren unterschiedlichen Oberflächenantigenen basieren Zellen Phänotypen benötigt einzelne virale und virale ähnlichen Partikel zu charakterisieren. Leider kann EVs oder kleine Virionen nicht mit Standard-Flow Zyto analysiert werdenmetry Methoden, weil sie sind zu klein, um das Lichtstreuungssignal zu erzeugen, auf denen die meisten Zytometer angewiesen zu triggern. Um diese Einschränkung zu umgehen, Fluoreszenz auslösenden angewendet werden kann. wenn EVs oder Virionen jedoch mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt werden, ist es schwierig, sie von freien Antikörpern und deren Aggregate aufgrund ihrer ähnlichen Fluoreszenz und vergleichbarer Größe zu unterscheiden.

Vor kurzem haben wir eine Nanotechnologie-basierte Hochdurchsatzverfahren, die die Charakterisierung von Antigenen auf einzelne kleine Partikel mit Hilfe von regulären Durchflusszytometer 8, 9 ermöglicht. Wir beschäftigen MNPs Immunocapture Partikel von Interesse, wie sie von anderen Gruppen für vielfältige Anwendungen 10, 11, 12, 13 beschrieben worden ist ; ermöglicht es jedoch, unsere neuartige Technik für die Erfassung von einzelnen spezifischenFic Ziele durch Phänotypisierung dieser gefangenen Partikel durch die Strömung gefolgt Zytometrie Fluoreszenz unter Verwendung Auslösung statt Lichtstreuung, ohne Einmischung von frei schwebenden Antikörpern. Dieses Verfahren hat breite Anwendungen und kann verwendet werden , um die antigene Zusammensetzung nach viral- und nicht-virale kleine Teilchen von Zellen in vivo und in vitro bereitgestellt , um die Verfügbarkeit von bestimmten fluoreszierenden Antikörpern gegen Oberflächenantigene erzeugt zu charakterisieren. Wir haben bereits mit dieser Technik zu studieren mehrere biologische Probleme angewandt.

Insbesondere wir die Verteilung von Wirtszellmarker zu einzelnen HIV-1 - Partikel 9, bewertet suchten wir die Reifung von einzelnen Dengue - Viren (DENV) basierend auf der Analyse ihrer Oberflächenproteine 14 und untersucht EVs in den Blutstrom von gesunden Freiwilligen freigesetzt und Patienten mit akutem Koronarsyndrom (ACS). Obwohl basierend auf einem ähnlichen Prinzip, dasAnwendung der neuen Technik erforderliche Entwicklung von spezifischen Protokolle, die nachfolgend beschrieben werden.

Protokoll

1. Kopplung von magnetischen Nanopartikeln (MNP)

  1. Verwenden Sie kommerzielle Kopplungsverfahren und Reagenzien zu koppeln MNPs mit Antikörpern (Abs) (typischerweise 1 mg). Eisenoxid - Nanoteilchen mit einer Carbonsäure als reaktive Gruppen verwendet werden.
    1. Wenn Antikörper in einem Volumen von mehr als 0,5 ml sind, konzentrieren einen 100K-Konzentrators. Spin bei 2000 × g für 3-5 min.
  2. Am Ende des Verfahrens, nach 10 & mgr; l des Lösch Puffer hinzufügen, übertragen MNPs zu einem 12 mm x 75 mm Rohr und 3 ml Wasch- / Speicherpuffer. Das Röhrchen wird in das Mittelloch eines magnetischen Separator und verlassen über Nacht bei 4 ° C.
  3. Stellen Sie sicher, dass MNPs alle auf die Seite des Rohres gesammelt haben, und dann pipettieren aus sorgfältig alle Flüssigkeit. 3 ml frischer Wasch / Speicherpuffer, und legen Sie zurück in den Magneten.
  4. Nach mehreren Stunden, überprüfen Sie, ob MNPs an der Seite des Rohres gesammelt werden und dann die Flüssigkeit pipettieren ab. Verwenden Sie 2 ml Wasch / Speicherpufferresuspendieren MNPs und lagern bei 4 ° C.
  5. Stellen Sie sicher , dass Abs an MNPs gekoppelt , indem sie mit einem entsprechenden Fluoreszenz Fab Antikörperfragment (zB Ziege anti-Maus , wenn ein monoklonaler Maus - Ab für die Erfassung , wie in Abschnitt 2 beschrieben) Markieren und laufen auf einem Durchflusszytometer.

2. Markierung von Antikörpern zu MNP Gekoppelt

  1. Kombinieren 60 ul (3,9 x 10 12 Partikel) von MNP (pro Bedingung) und 5 & mgr; l (einer 200 & mgr; g / ml handelsübliche Lösung) markierten Fab - Fragmente, die spezifisch für das Isotyp des capture Ab in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 30 min unter kontinuierlichem Mischen.
  3. Vorbefeuchtenden einen 100K-Konzentrator mit 300 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Spin in einer Mikrozentrifuge bei 1.500 xg für 5 min.
  4. Reinige markierten Komplexe auf 100K Spalte. Drehen Sie die Mischung aus Schritt 2.2 in einer Mikro bei 1.500 × g für 5 min, Waschen mit 200 ul PBS, und erholen sich in derAnfangsvolumen.

3. Verwendung von markierten Ab-MNP-Komplexe Partikel von Interesse (Viren oder EVs) zu erfassen

  1. Inkubieren vormarkiert MNPs 60 ul (3,9 x 10 12 Partikel) mit HIV (60 & mgr; l) oder EV - Präparat (100 ul).
    1. Bereiten Sie EV Präparate mit verschiedenen Methoden. Hier reinigen EVs auf Saccharosegradienten, sammeln sie aus plättchenarmes Plasma mit exosome Präzipitationsreagenzien oder isolieren direkt aus dem Plasma 8.
      HINWEIS: Optimale Verhältnisse für jedes Experiment bestimmt werden müssen und sind auf Viruskonzentration / EV in der Vorbereitung abhängig. MNP-Ab - Fraktion sollte ~ 10 6 im Überschuss im Vergleich zur Konzentration der Virus / EV - Fraktion.
  2. Inkubieren 40 min bei 37 ° C unter leichtem Mischen für Viren, oder 1 Stunde bei 4 ° C für EVs.
  3. In 2,5% Maus-IgG / Human-IgG-Fc-Bindung zu blockieren, sanft Wirbel, brüten 3-5 min bei RT.
  4. Fügen Sie Hersteller empfohlen oder titrierten Konzentrationen jeder Erkennung Abs und Inkubation weitere 20 min bei RT.

4. Trennung der MNP-Capturing Virionen (oder EVs) aus nicht gebundenen Antikörper Magnetic Spalten unter Verwendung von

  1. Bereiten magnetische Trennsäule für die Verwendung durch sie in einem Abscheidemagneten platzieren.
  2. Vorbefeuchtenden der Säule mit 500 ul Waschpuffer (2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS). Erlauben der Waschpuffer durch die Säule zu fließen.
  3. Fügen Sie die MNP-Virus / MNP-EV-Komplexe auf die Säule gegeben und die gesamte Flüssigkeit durchfließen. Hinzufügen 500 ul Waschpuffer auf die Säule, so dass das gesamte Volumen durch.
  4. Wiederholen Sie das Waschen mit Waschpuffer 2 weitere Male.
  5. Entfernen Sie die Säule aus Magnet und in 12 mm x 75 mm Rohr für die Sammlung der zurückgehaltenen MNP-Virus / MNP-EV-Komplexe. Lassen Sie die Spalte in der Röhre stehen aus dem Magneten 3 min. In 200 ul PBS und lassendie Perlen fließen durch die Schwerkraft nach unten, fügen Sie weitere 200 ul PBS und fixieren mit 200 ul 4% Paraformaldehyd nach Elution.
    HINWEIS: Paraformaldehyd ist ein Verdacht, karzinogen und sollte in einem gut belüfteten Haube behandelt werden und sollten Handschuhe getragen werden.
  6. Einzel Virionen / EVs verwenden Volumen Einstellungen auf High Throughput Sampler (HTS) oder unmittelbar vor dem Erwerb hinzufügen gut gemischten Durchflusszytometrie Zählung Perlen zu quantifizieren.

5. Analyse von MNP-Capturing Viren / EVs mit einem Durchflusszytometer

  1. Warm up Durchflusszytometer für 30 min.
  2. Führen Sie die Qualitätskontrolle Perlen.
  3. Stellen Sie Schwelle auf Fluoreszenz von entweder MNPs oder markierten Viren / EVs. Verwenden von 0,22 um gefiltert PBS für Schwellen den Hintergrund "Rauschen" zu verringern. Stellen Sie die Schwelle durch die PMT-Spannung auf dem Niveau eingestellt, wo gefiltert PBS nicht gibt, oder nur sehr wenige, Veranstaltungen.
  4. Führen Sie Proben auf niedrig. (Verwenden Sie ein zusätzliches 0,04 um Inline-Filter für Hüllflüssigkeit in Reihe hinter dem platziertStandard 0,2 um Mantel-Filter zu beseitigen weitere falsche Ereignisse).

6. Evaluierung des Capture-Effizienz

  1. Erfassen Sie fluoreszenzmarkierten EVs oder HIV mit MNP-Abs, wie in 3.1, 3.2 beschrieben. (EVs kann entweder mit einem Membranfarbstoff oder durch ihre Ladung beschriftbar 15; HIV kann entweder durch gencodierten Farbstoff 12 16, oder mit einem Membranfarbstoff beschriftbar, 17).
  2. Bereiten magnetische Trennsäule, wie in (4,1-4,2) beschrieben.
  3. Fügen Sie die MNP-Virus / MNP-EV-Komplexe auf die Säule gegeben und die gesamte Flüssigkeit durchfließen (Durchflussfraktion). Sammeln Sie die Durchflussfraktion in Rohr.
  4. Weiter mit Fraktion auf der Säule zurückgehalten, wie in (4,4-4,5) beschrieben.
  5. Wiederholen Sie Capture-Verfahren auf der Durchflussfraktion von 6,3 mit anschließender Trennung (4,1-4,5).
  6. Analysieren Sie die zurückgehaltenen Fraktionen aus der ersten capture und zweiter Fang von ihnen auf cytometer dass Laufen eingestellt auf Triggerung auf Fluoreszenzmarkierung von EVs oder HIV. Um die Effizienz zu bewerten, zu vergleichen, um die Anzahl der Ereignisse in den beiden Fraktionen.

7. Anpassung des Protokolls für besondere Aufgaben

HINWEIS: Während kann das Protokoll zur Analyse von HIV und EVs angewendet werden, wie oben beschrieben, für die Analyse von DENV sind folgende Modifikationen eingeführt werden:

  1. Inkubieren Virionen mit 1 uM DiI im Dunkeln für 30 min bei RT. Nach Inkubation reinigen stained Virus durch Zentrifugation in Dichtegradienten-Medium (10%, 20%, 25% und 35%) bei 240.000 xg für 1,5 h bei 4 ° C ohne Bremse. Sammeln Fraktion zwischen 20% und 25% Dichtegradientenmedium Schichten 14.
  2. Inkubiere DiI DENV 1 x 10 7 (60 & mgr; l) mit einer vom Hersteller empfohlen oder getitert Konzentrationen von Detektions Ab in Gegenwart von 2,5% Maus - IgG für 20 min bei RT bezeichnet.
  3. Incubate Mischung mit vormarkiert 60 ul (3,9 x 10 12 Partikel) MNP-capture Ab - Komplexe für 40 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Mischen.
  4. Separate resultierenden Komplexe von ungebundenen Abs auf magnetischen Spalten, wie oben beschrieben und cytometer auf Fluss analysieren.

Ergebnisse

Die selektive Erfassung von zellulären Antigenen durch HIV-1-Virionen

Mit "flow virometry" ist es nun möglich, zelluläre Antigene auf einzelne Viruspartikel zu visualisieren. Als Beispiel haben wir uns auf zwei zellulären von HIV-1, LFA-1 und HLA-DR-Antigenen durchgeführt. Früher diese beiden Antigene wurden in HIV-1 - Präparate in der Masse 1 analysiert identifiziert. Wir bereiteten MNPs gekoppelt mit einem der Antikörper gegen HIV Env - Protein, VRC01 und mit diesen MNPs HIV-1 - Virionen (HIV-1 LAI.04 oder HIV-1 SF162 in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) hergestellt) eingefangen. Darüber hinaus gefärbt wir diese Virionen mit 2G12, einem anderen anti-Env-Antikörper. Strömungs virometry zeigte eine hohe Heterogenität des HIV-1-Virionen in Bezug auf das Vorhandensein von LFA-1 und HLA-DR. Im Mittel 16,7 ± 2,0% (n = 6) und 8,6 ± 0,3% (n = 3) von HIV-1 - Virionen LAI.04 durch LFA-1 und HLA-DR,beziehungsweise. Nur 4,8 ± 0,6% (n = 3) aller Virionen waren positiv für beide Antigene. Auf der anderen Stamm HIV-1, HIV-1 SF162 wurden diese Antigene auf 20,0 ± 4,4% (n = 6) und 10,8 ± 1,3% (n = 6) von Virionen jeweils während wurden beide Antigene von 6,5 ± durch 0,4% (Abbildung 1).

Die Verteilung der zellulären Proteine ​​wurde auf den Zellen abhängig, das Virus repliziert. HIV-infizierte Jurkat Zellen produzierten Virionen antigenisch verschieden von denen von infizierten PBMCs hergestellt. Virionen von HIV-1 LAI 0,4 von Jurkat - Zellen produziert durch 1,6 ± 1,4% (n = 3) und 1,6 ± 0,7% (n = 4) , LFA-1 und HLA-DR auf. Für HIV-1 SF162 - Virionen in Jurkat - Zellen produziert wurden diese Parameter 7,2 ± 2,5% (n = 3) und 5,6 ± 2,7% (n = 4). Somit antigen makeup (zumindest für HLA-DR und LFA-1) ist unterschiedlich für HIV-1 LAI.04 von zwei verschiedenen Zelle produziertTypen (p <0,02).

Fluss virometry als zur Bewertung von Dengue-Virus angewendet

DENV Reifung wird mit der Expression von prM-Proteins auf den Virionen verbunden. Wir wandten Fluss virometry zu bewerten, welcher Anteil von DENV in BHK-1 hergestellt und in LoVo-Zellen bildet reifen Viren. Virionen wurden mit einem lipidischen Farbstoff Dil gefärbt. Analyse einzelner erfasst Virionen zeigte, prM auf 48,2 ± 5,3% (n = 8) von DENVs. Im Gegensatz dazu 84,5 ± 3,4% (n = 4) von DENV in LoVo-Zellen produziert prM getragen. Der Rest der Virionen jeweils 51,8 ± 5,3% (n = 8) und 15,5 ± 3,4% (n = 4) waren prM negativ (Abbildung 2). Somit kann Fluss virometry verwendet werden voll ausgereift einzelne DENV aus unreifen (oder teilweise reifen) DENV Virionen zu unterscheiden.

Die extrazelluläre Vesikel in Blut von gesunden veröffentlichtProbanden und Patienten mit akutem Koronarsyndrom (ACS)

Um verschiedene EV Untergruppen bei Patienten mit ACS und gesunden Kontrollen zu untersuchen, gefangen wir EVs von plättchenarmes Plasma (PPP) durch Fluoreszenz-MNP-Verbindung mit Antikörpern gegen CD31, CD41a oder CD63. EVs gefangen von CD31-MNPs wurden für CD41a und CD63 gefärbt, von CD41a-MNPs gefangen EVs für CD31 und CD63 gefärbt wurden, und von CD63-MNPs gefangen EVs wurden für CD31 und CD41a (Abbildung 3) gefärbt.

Die Menge an EVs gefangen von CD31-MNPs und positiv für einen oder zwei der Nachweis-Antikörper in Patienten mit ACS war 3359 [2328; 5472] EVs / pl im Vergleich zu 1272 [714; 2157] EVs / ul bei gesunden Probanden (p = 0,001). Die Gesamtmenge an EVs erfasst von CD63 in ACS-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden war 3541 [1318; 5173] EVs / ul vs. 806 [488; 2112] EVs / ul (p = 0,007). Es gab 4752 [3238; 7173] EVs / pl in Plasma von Patienten mit ACS erfasst durch CD41a-MNPs, während im Plasma von gesunden Freiwilligen diese Zahl deutlich niedriger war, 2,623 [1,927; 4188] EVs / ul (p = 0,015). Im Allgemeinen zeigen unsere Ergebnisse, dass, während EV beträgt meist in ACS Patienten erhöht waren, der Betrag der Zunahme verschieden war in verschiedenen Subpopulationen von EVs.

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Abbildung 1: Selective Inkorporation von zellulären Antigenen in HIV-1 - Virionen in verschiedenen Zelltypen zu replizieren. HIV (HIV-1 LAI.04 oder HIV-1 SF162) Virionen von PBMCs oder Jurkat - Zellen freigesetzt wurden mit VRC01-MNPs erfasst und gefärbt mit zweiten anti-gp120 - Antikörper 2G12 und mit spezifischen Antikörpern gegen HLA-DR und LFA-1. Die gefärbten Präparate wurden einer Analyse fließen für HLA-DR (weiße Balken) und LFA-1 (schwarz bars). Mittelwert ± SEM von drei bis sechs Experimenten 9. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Ausreifung Zustand von DENV Virionen. DENV hergestellt in BHK-21 - Zellen (A, B) oder in LoVo - Zellen (C, D) wurden mit dem lipidischen Farbstoff markiert DiI und nach dem Ultrazentrifugieren in Dichtegradientenmedium, gefärbt prM - Protein mit 2H2 - Antikörpern (A, C) oder mit Isotypenkontrolle IgG2a (B, D). Die markierten Virionen wurden dann mit 3H5-1-MNPs erfasst und Analyse 14 fließen unterworfen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version davon zu sehenZahl.

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Abbildung 3: Analyse von EVs von ACS - Patienten und gesunden Kontrollen. Plasma EVs wurden mit CD31-MNPs, CD63-MNPs oder CD41a-MNPs und gefärbt mit Antikörpern gegen CD41a und CD63, gegen CD31 und CD41a und gegen CD31 und CD63 bzw. erfasst. Erfasst EVs, gefärbt mit mindestens einer der Detektions Abs, wurden visualisiert und in Flussanalyse aufgezählt. Die präsentierten Daten als Punktdiagramm mit Median und Interquartilbereich (IQB). Grüne Symbole: gesunde Freiwillige (Kontrollen), braun Symbole: ACS-Patienten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4: Evaluatiauf der Fraktion der Strömung Ereignisse, die einzelnen Virionen repräsentieren. (A) HIV-1. Die Aussetzung der Virionen wurde in zwei Teile geteilt und gefärbt entweder mit DiD (linkes Bild) oder OVI (Mitte). Nach dem Mischen der Suspension, die zwei unterschiedlich gefärbten Virionen enthielt, wurde mit VRC01-MNPs erfasst und virometry (rechtes Bild) fließen ausgesetzt. Aggregates (zweifarbige Ereignisse) gebildet wird weniger als 10% der gesamten Ereignisse. (B - D) DENV. Die Aussetzung der DiI-gefärbte Virionen wurde seriell verdünnt zweifach von 1: 2 bis 1: 256 und erwarb mit HTS auf einem Durchflusszytometer (B). Dil DENVs wurden mit 2H2 Antikörper (C) markiert oder Dil-DENVs wurden mit 3H5-1-MNPs (D) erfasst. Zubereitungen C und D wurden dann seriell zweifach verdünnt von 1: 2 bis 1: 256 und erfasst mit HTS 14. Virionen offenbar nicht, da in allen Fällen zu aggregierenist eine lineare Korrelation zwischen dem Verdünnungsfaktor und der Anzahl der Ereignisse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5: Nachweis von einzelnen Teilchen durch Durchflusszytometer. DiI-gefärbte DENV Suspension wurde seriell verdünnt zweifach von 1: 2 bis 1: 2.048 und erworbenen Zytometer auf eine Strömung eines HTS verwenden. (A) Zahl der Viren als Funktion des Verdünnungsfaktors detektiert. (B) mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von DiI markiertem DENV 14. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6: Beurteilung der Fraktion von Virionen und extrazellulärem mit MNP erfasst Vesikel gekoppelt an spezifische Antikörper. Markiertes HIV-1-Virionen oder EVs wurden mit MNP erfasst gekoppelt spezifischen Antikörpern und einer virometry zu fließen. Nach der Trennung auf magnetischen Säulen wurden die Durchfluss (nicht erhalten) Fraktionen auf das Vorhandensein von Virionen oder EVs von Interesse analysiert, die im ersten Lauf verpasst wurden. (A) Beschriftete HIV-1 BaL Virionen wurden mit 2G12-MNPs (linkes Feld) erfasst. Die Durchflussfraktion wurde erneut erfasst und unter virometry (rechts) zu fließen. Im ersten Zyklus etwa 95% der Virionen von Interesse aufgenommen wurden. (B) Beschriftete EVs wurden mit anti-CD81 MNPs gefangen und isoliert auf magnetischen Säulen (linkes Bild). Die Durchflussfraktion wurde erneut erfasst und analysiert (rechtes Bild). In der erstenZyklus etwa 99% der Vesikel von Interesse wurden 8 erfasst. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Herkömmliche Durchflusszytometer bleiben das wichtigste Instrument für die 18 Zellen auf der Grundlage ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften auf individueller Ebene zu analysieren. Die Grundprinzipien der Strömungs haben Cytometrie nicht seit seiner Entwicklung verändert: eine Zelle, die durch den Laserstrahl passiert und streut Licht bildet ein Ereignis, das die Aufzeichnung der Fluoreszenzspektren von zellgebundenen Fluoreszenz Antikörper emittiert auslöst. Kleinere Partikel unterhalb von 300 nm kann nicht durch Seitenstreuung eines cytometer erkannt werden , da sie mehr Licht unter größeren Winkeln streuen , an denen die meisten Durchflusszytometer nicht 18 Licht zu sammeln. Die hier beschriebene Technik, ermöglicht die Identifizierung und die Analyse von mehreren Antigenen auf zahlreiche einzelne Viren oder EVs durch herkömmliche Durchflusszytometer mit Fluoreszenz auszulösen.

Die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls sind die Kopplung von Antikörpern gegen MNPs. Unsere Experimente wurden PERFORmed unter Verwendung von 15 nm Eisenoxid-Nanopartikel mit Carbonsäure als eine reaktive Gruppe, wie zuvor beschrieben 9. Nach Angaben des Herstellers, die jeweils 15 nm MNP kann maximal 20-Antikörper binden; wir binden etwa 10 Antikörper pro 15 nm MNP. Diese Schätzung wird auf die Menge von Antikörpern basiert vor und nach der Kopplung und die Anzahl der Perlen / ml, wie durch Nanopartikel-Charakterisierung und Dimensionierung Instrumentierung gemessen. Grundsätzlich kann Kupplungs Aggregation von Teilchen verursachen und ist unerwünscht. Um zu überprüfen, dass die Aggregation mit unserem Protokoll nicht geschieht, überprüften wir dies mit der Nanopartikel Charakterisierung und Dimensionierung Instrumentierung. Dieses Instrument misst den hydrodynamischen Durchmesser der Partikel, die nur die Beschichtung und die Antikörperschichten, anstatt den Kern 15 nm enthält. Wir fanden heraus, dass die Mehrheit der gekoppelten Kügelchen in einem einzigen Peak (Spitzen bedeuten bei unter 73 ± 7,3 nm 64,7 ± 4,2 nm bei 90% aller Veranstaltungen) befinden. Das Mischen von Ab-MNP complexe mit Virionen oder EVs im richtigen Verhältnis ist wichtig, damit MNPs in der Konzentration von mehreren Ordnungen höher als EVs / Virionen. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass einzelne EVs / Virionen analysiert. Vermeiden Sie Zufälle der Ereignisse durch cytometer bei niedrigen Strömungs läuft. Stellen Sie sicher, den Erwerb der Fluoreszenz auszulösen und verwenden Volumen steuert die Konzentration der erfassten Einheiten zu messen.

Jedoch EVs oder Virionen aggregieren durch Vernetzung oder durch die Bindung von zwei oder mehr Virionen zu derselben Nanopartikel MNPs kann. Um dies zu überprüfen, wird ein Test für die Aggregation , wie in Abbildung 4 beschrieben , muss durchgeführt werden. Auch einzeln erfasst Virionen oder EVs können gleichzeitig den Laserstrahl des Durchflusszytometer ein. Dies wäre falsch-positiver für zwei verschiedene Antigene erzeugen. Um dies zu vermeiden, sollte das Durchflusszytometer eingestellt werden, wie beschrieben und sollten die Präparationen verdünnt werden. Man kann prüfen, ob Zufall geschieht durch die Verwendung derselbenStrategie wie im vorherigen Punkt beschrieben. Auch könnte das Fehlen der Koinzidenz durch die Analyse Reihenverdünnungen der Präparation überprüft werden , und beweisen , dass die Anzahl der Ereignisse nimmt linear mit der Verdünnung während die mittlere Fluoreszenzintensität eines fluoreszent stained Antigen bleibt konstant in allen Verdünnungen (Abbildung 5). Ein weiteres Problem ist, dass zu wenige Viren / EVs erfasst werden können. Dies kann auf die wahre Knappheit von Viren / EVs zurückzuführen sein, die Antigene durch die sie erfasst werden durch spezifische MNPs tragen. Alternativ kann die Effizienz der Erfassung gering ist aus verschiedenen Gründen (beispielsweise ineffizienten Kopplung von Antikörpern an MNPs, abweichend von den Verhältnissen von MNP zu Virionen / EVs für dieses Protokoll entwickelt, etc.). Um die letztere Möglichkeit zu vermeiden, sollten die Effizienz der Erfassung speziell ausgewertet werden. Typischerweise sollte der Wirkungsgrad etwa 90% , wie in Figur 6 sein.

Verschiedene Antikörper können aufgrund störensterische Hinderung miteinander oder mit den Antikörper gekoppelt MNP. Um zu überprüfen, dass dies nicht getestet werden, der Fall war ein Reverse-Capture-Protokoll muss (wie in Abschnitt 7 beschrieben Kurz gesagt, Virionen oder EVs sollte mit Fluoreszenzdetektion Abs zuerst gefärbt werden und dann eingefangen durch Ab-MNP-Komplexe mit anschließender Trennung von frei schwebenden Abs auf magnetische Säulen.

Strömungs virometry hat erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Methoden der Analyse der antigenen Zusammensetzung von Virionen oder EVs. Routine biochemische Methoden berichten über die allgemeine Vorhandensein bestimmter Proteine ​​in den Vorbereitungen, aber keine Auskunft über die Heterogenität der Virionen oder EVs. Dazu gehören Immunocapture von Virionen oder EVs auf großen kommerziell erhältlichen Partikel. Solche Partikel sind typischerweise von einigen Mikrometern im Durchmesser und jeder von ihnen kann Hunderte oder Tausende von Virionen oder EVs erfassen. Daher werden alle nachfolgenden Analyse mittelt die Eigenschaften der Virionen / EVsvon einem Partikel eingefangen. Im Gegensatz dazu fließen virometry verwendet MNP von 10-15 nm im Durchmesser und mit dem beschriebenen Protokoll von mindestens 90% der Ereignisse eines einzelnen Virion oder einzelne EV darstellen.

Die wichtigste Einschränkung ist, dass die gesamte Bevölkerung von Virionen oder EVs in der Vorbereitung nicht analysiert werden können, sondern nur diejenigen, die erfasst werden. Daher sind die Wahl des Antigens durch die Virionen oder EVs erfasst wird kritisch. Auch im Gegensatz zu Durchflusszytometrie der Anzahl verschiedener Antigene (die Anzahl der fluoreszierenden Antikörper gegen verschiedene Antigene) durch die kleine Oberfläche von Virionen oder EVs begrenzt. Schließlich können verschiedene Antikörper sterisch miteinander wieder aufgrund der kleinen (im Vergleich zu den Zellen) Oberfläche stören.

Das aktuelle Protokoll kann zur Analyse von Viren oder EV beliebigen Ursprungs angepasst werden, sofern die spezifischen Antikörper durch die sie zur Verfügung stehen erfasst werden. Analyse von Antigenen auf einzelnen Virionen Erlaubniss Forscher die Pathogenese der verschiedenen Fraktionen der viralen Populationen zu adressieren. Weiterhin Identifizierung einzelner EVs in Plasma kann es aufzuhalten ermöglichen, den Ursprung von EVs auf bestimmte Zellen zu verfolgen und zu normalen oder pathologischen Bedingungen dieser Zellen und den Organen, in denen sie zu berichten.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Arbeit von AA, SZ, WF, J-C. G und LM wurde vom NICHD Intramural Program unterstützt. Die Arbeit von MV wurde durch das Stipendium der Regierung der Russischen Föderation #14.B25.31.0016 unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles KonjugationskitsOcean NanotechICK-15-005
Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-100 MembranMilliporeUFC810024
5 ml PP-Reagenzglas mit rundem Boden, ohne KappeFalcon352002 DEPC-behandelt
WasserQualität Biologisch 351-068-131
SuperMAG-01 Magnetabscheider Ocean NanotechSuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Maus IgG1  BeschriftungskitThermo Fisher ScientificZ25055
Nanosep Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran 100kPall CorpOD100C34
EDTA 0,5 MCorning Cellgro46-034-CI
RinderserumalbuminlösungSigma-AldrichA9576-50ML
PBSGibco10010-23
Paraformaldehyd, EM-Qualität, GereinigteEMS15710
123 eBeads eBioscience01-1234-42
CytoCount KügelchenDakoS2366
AccuCheck Kügelchen zählenInvitrogenPCB100
Zytometer Einrichtung & Tracking Beads Kit (CST)BD Bioscience642412
Vybrant DiI-ZellmarkierungslösungThermo Fisher ScientificV22885
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung
&Mikro; MACS-Spalte Miltenyi Biotec130-042-701
OctoMACS Separator MagnetMiltenyi Biotec130-042-108
NanodropThermoFishernone
NanoSight NS300Malvernnone
BD LSRII DurchflusszytometerBD Biosciencenone
NameCompanyKatalognummer<>Comments
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Referenzen

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Virion Analysemagnetische NanopartikelDurchflusszytometrieEinfangen von ViruspartikelnEinzelpartikelanalyseHIV 1 VirionenReifung des Dengue Virus
Fluss Virometry zur Analyse Antigenic Spektren von Virionen und extracellular Vesikeln
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