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Methodenartikel

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

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DOI:

10.3791/55060

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23. April 2017

 ,  ,  ,  , 
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen.

Zusammenfassung

Derzeit gibt es ein beträchtliches Interesse an in einem Meer von passivierten Oberfläche geordnete Anordnungen von Adhäsionsprotein Inseln zu schaffen für zellbiologische Untersuchungen. In den letzten Jahren hat es immer deutlicher, dass lebende Zellen reagieren, nicht nur auf die biochemische Natur der Moleküle ihnen vorgestellt, sondern auch auf die Art, wie diese Moleküle präsentiert werden. Erstellen von Protein Mikromuster wird deshalb jetzt Standard in vielen biologischen Laboratorien; Nanostrukturen sind auch zugänglich. Doch im Zusammenhang mit den Zell-Zell-Interaktionen, besteht ein Bedarf an Mustern nicht nur Proteine, sondern auch Lipid-Doppelschichten. Solche Dual proteo-lipidic Musterung ist bisher nicht leicht zugänglich. Wir bieten eine einfache Technik Protein Nanopunkte auf Glas und schlagen ein Verfahren zu schaffen unterstützten den Zwischenpunktraum mit einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) verfüllen. Vom Fotobleichen des Tracers enthalten fluoreszierende Lipide im SLB, zeigen wir, dass die Doppelschicht in-pl erhebliche aufweistane Fluidität. Funktionalisierung der Proteinpunkte mit fluoreszierenden Gruppen ermöglicht es uns, Bild sie und zu zeigen, dass sie in einem regelmäßigen hexagonalen Gitter geordnet. Die typische Punktgröße beträgt etwa 800 nm und der Abstand hier gezeigt, ist 2 um. Diese Substrate werden erwartet als nützliche Plattformen für die Zelladhäsion, Migration und mechano-Sensing-Studien dienen.

Einleitung

Zelladhäsion erfolgt durch spezialisierte Zelladhäsionsmoleküle (CAMs), Proteine, die auf der Zellmembran, die zu ihrem Gegenstück der Bindung auf der extrazellulären Matrix oder auf einem anderen Zelle fähig sind. Auf adhärierten Zellen, die meisten Adhäsionsmoleküle , einschließlich der allgegenwärtigen Integrin und Cadherin, werden in Form von Clustern 1 gefunden. Die Wechselwirkung von T-Lymphozyten (T-Zellen) mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) stellt ein besonders treffendes Beispiel für die Bedeutung des Rezeptor-Cluster an der Grenzfläche zwischen den beiden Zellen gebildet - oft eine immunologischen Synapse bezeichnet. Bei der Bildung die erste Berührung mit dem APC, T - Zell - Rezeptoren (TCRs) auf der Oberfläche der T - Zellen - Form micron Skala Cluster , die dazu dienen , als Signalisierungsplattformen 2, 3, 4, und werden schließlich zentralisieren einen größeren zentralen supramolekularen Cluster zu bilden (cSMAC )lass = "Xref"> 5, 6, 7. Vor kurzem wurde es , dass auf der APC Seite gezeigt, die Liganden des TCR sind auch 8 gebündelt.

Im Zusammenhang mit der T - Zell-APC - Interaktion, die Bereitstellung von Hybrid - Systemen, wo der APC durch eine künstliche Oberfläche funktionalisierte mit relevanten Proteinen nachgeahmt wird, vorgerückt ist unser Verständnis der synaptischen Schnittstelle 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In diesem Zusammenhang ist es höchst relevant APC-Mimetikum Oberflächen zu gestalten, dass ein oder mehr Aspekte der Zielzelle erfassen. Wenn beispielsweise Liganden auf unterstützte Lipiddoppelschichten aufgepfropft werden, können sie in der Ebene der Doppelschicht diffundieren, ahmen die Situation auf der APC Oberfläche und zur gleichen Zeit der Bildung des erlaubencSMAC 6, 7. Ähnlich haben die Cluster auf der APC nachgeahmt von 14 Inseln von Liganden in einem Meer von Polymeren , 9, 10, 11, 12, 13, zu schaffen. Allerdings haben diese beiden Merkmale bisher nicht kombiniert.

Hier beschreiben wir eine neuartige Technik Nano-Dots von Anti-CD3 zu erzeugen (ein Antikörper, der den TCR-Komplexes Targets) von einer Lipiddoppelschicht mit diffundierenden Lipiden umgeben. Die Bilayer wird unter Verwendung von Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schäfer - Technik abgeschieden 7, 15, 16 und , falls gewünscht, könnte mit einem bestimmten Protein funktionalisiert werden - beispielsweise der Ligand der T - Zell - Integrin (genannt ICAM1). Darüber hinaus cou die anti-CD3-Protein dotsld mit einem anderen Antikörper oder CAM ersetzt werden. Während wir die Proteine, die für die zukünftige Nutzung als Plattform für die T-Zell-Adhäsion Studien gewählt haben, detailliert die Strategie hier kann für jedes Protein und sogar DNA angepasst werden.

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Protokoll

1. Reinigung Glasdeckel-Dias und Beobachtungskammern

  1. Ordnet die Glasabdeckung Schlitten auf einem mehr Diamagazin aus einem inerten Material wie Polytetrafluorethylen (PTFE).
  2. Taucht das Fach mit Rutschen und die Beobachtungskammer in einer Tensidlösung (jedes Produkt zu empfehlen für die Reinigung von Quarzküvetten ist geeignet).
  3. Unter Verwendung eines Ultraschallbades, ultra-beschallen in der Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
  4. Spülen Sie 5-mal mit Reinstwasser (18.2 MΩ.cm, 0,059 & mgr; S / cm).
  5. Ultra-Sonikat in Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
  6. Spülen Sie 10-mal mit Reinstwasser.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 1.5 und 1.6 zweimal.
  8. Speicher in Wasser bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C) für bis zu einer Woche.

2. Herstellung von Protein-Nano-Punkte

  1. Die Ablagerung von Perlen
    1. Deposit die Suspension von Silica-Kügelchen (2% v / v, 70 & mgr; l) tropft auf einem deckel Schieber (24 x 24 mm, Dicke 170 um) mit einer Neigung von 15 Grad gehalten wird.
    2. Lassen Sie die Suspension für ca. 1 min verteilt, während das Glas alle 15 s um 90 ° Spiegeln.
    3. Die Flüssigkeit unter Umgebungsbedingungen zu verdampfen.
    4. Speicher in einem sauberen Glas oder PTFE Kammer bei Umgebungsbedingungen für bis zu 2 Tagen.
  2. Abscheidung von Aluminium
    1. Platzieren Sie die Folien (hergestellt in Abschnitt 2.1) in einer Radiofrequenz (RF) Magnetronzerstäubungsgerät 8, auf einem Drehtisch in einer Entfernung von etwa 105 mm aus einer Aluminium (99%): Silizium (1%) vorbei.
    2. Abpumpen der Beschichtungskammer auf 2,6 x 10 -4 Pa eine Turbomolekularpumpe. Dieser Schritt ist wichtig für die Entfernung von gasförmigen Verunreinigungen möglich.
    3. Einführung von reiner Argon-Atmosphäre (5N, 99,999%) mit einem Fluss von 10 sccm bei einem Druck von 0,8 Pa (6,6 mTorr).
      Anmerkung: Der ankommende Argonfluss durch einen Massendurchflussregler und der Prozeßdruck wird überwacht, gesteuert wird, ein Druckmesser verwendet wird. Der Argongasstrom ist kontinuierlich und wird durch ein Gleichgewicht zwischen dem Einlass und Auslass Öffnen der Ventile gesteuert.
    4. Schalten Sie den HF-Leistungsgenerator.
      HINWEIS: Hier wird ein typischer Bereich von 400-600 W Hochfrequenzleistung bei 13,56 MHz verwendet wurde. Der HF-Generator ist mit einem Anpassungsnetzwerk in einem kapazitiven Kopplungsmodus Plasma verwendet. Die reflektierte Leistung wird überwacht und minimiert die Netzwerkanpassung verwenden.
    5. Nachdem das Plasma stabilisiert wird, Sputter für 2 min geschlossen, um den Verschluss zu halten mögliche Verunreinigungen von der Oberfläche des Targets zu entfernen.
    6. Öffnen des Verschlusses und ermöglichen dem Sputter weiterhin für 60 min Aluminium auf der Glasträger mit einer Dicke von 200 nm abzuscheiden.
    7. Schneiden Sie die Strömung von Argon, schließen Sie das Torventil die Turbomolekularpumpe aus der Abscheidungskammer und die Entlüftungsöffnung in die Kammer mit reinem n zu isolierenitrogen den Raumdruck zu erhalten. Wiederherstellen der aluminiumbeschichteten Folien. Speicher für bis zu einem Monat in einer sauberen und hermetisch verschlossenen Glas oder PTFE-Box unter Umgebungsbedingungen.
  3. Dampfabscheidung von Organosilan
    1. Tauchen Sie die Aluminium-beschichteten Objektträger, hergestellt in Schritt 2.2.6 in Reinstwasser bei Raumtemperatur und ultra-Sonikat für 30 s in einem Ultraschallbad (50 W, 50/60 Hz, zwischen 20 und 30 ° C).
    2. Deposit 0,5 ml (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) am Boden eines Exsikkators.
      ACHTUNG: APTES ist ein Organosilan, das leicht verdampft und ist giftig. APTES sollte nur unter einer strömungs Kapuze und mit Handschuhen angefasst werden.
    3. Setzen Sie die Objektträger aus Glas (hergestellt in 2.3.1) auf einem Keramik-Gitter und im Inneren der Exsikkator.
    4. Schließen Sie den Exsikkator mit einer Membranpumpe und läuft bei maximaler Leistung für 30 min mit einem niedrigen Vakuum zu erzeugen.
    5. Schließen Sie das Ventil des Exsikkator und schaltet die Pumpe ab.
    6. Heizen Sie den Exsikkatorauf etwa 50 ° C für 1 h.
    7. Öffnen Sie den Exsikkator und sammeln Sie die Dias.
    8. Übertragung auf ein anderes sauberes Exsikkator zur Lagerung bis zu 48 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 30 ° C).
  4. Ablagerung der ersten Schicht von Protein - Rinderserumalbumin, markiert mit Biotin (BSA-Biotin)
    1. Legen Sie eine der hergestellten Folien in Abschnitt 2.3 auf einem PTFE-Träger.
    2. Deposit 1 ml 25 ug / ml BSA-Biotin, gelöst in Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Lassen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 30 ° C).
    3. Spülen 10 mal mit PBS. Lagern Sie die Probe für bis zu 24 h bei 4 ° C entfernt von der Lichtquelle.
  5. Die Entfernung der Aluminiummaske
    1. Inkubieren den Objektträger in einer Lösung von NaOH in PBS (hergestellt durch tropfenweise Zugabe von 1 M NaOH auf etwa 100 ml PBS pH≈12 zu erhalten) über Nacht bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
      VORSICHT. NaOH ist ätzend und sollte mit Handschuhen angefasst werden.
    2. Spülen10-mal in Reinstwasser.

3. Die Ablagerung von Lipid Bilayer Stützter (SLB)

  1. Reinigen des Langmuir-Trog
    1. Entfernen des Wassers in dem PTFE Gehäuse der Langmuir-Trog mit einer Pumpe.
    2. Reinigen Sie mit einem fusselfreien Vlies Einweg-Handtuch in Chloroform getränkt.
      VORSICHT. Chloroform ist giftig und soll in einem gut belüfteten Bereich manipuliert werden, mit einer Maske (oder unter einer Strom-Haube) und mit geeigneten Handschuhen.
    3. Sauber 4mal mit lauwarmem Reinstwasser (40 bis 50 ° C).
    4. Reinigen Sie mindestens 6 mal mit kaltem Reinstwasser.
  2. Abscheiden der ersten Lipidschicht
    1. Platzieren PTFE Tabletts in dem PTFE Gehäuse der Langmuir-Trog und dann füllt sie mit Reinstwasser.
    2. Verwenden, um die Steuersoftware der Langmuir Vorrichtung den gemessenen Druck auf 0 mN / m einzustellen.
    3. Verwenden, um eine gasdichte Glas / Metall-Spritze 30 ul einer 1 mg / ml Lipidlösung abzuscheiden (1, 2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin (DOPC) in Chloroform) auf der Oberfläche des Wassers. Das Chloroform verdampft und die Lipidmoleküle spontan eine Monoschicht bilden.
    4. Verwenden, um die Steuersoftware der Lipid-Monoschicht durch Schließen der PTFE Barriere bis zum gewünschten Druck (27 mN / m für DOPC) zu komprimieren, erreicht ist.
    5. Verwenden, um die Steuersoftware des Glasobjektträger in dem Abschnitt mit Hilfe eines motorisiertes Klemme 2.5.2 in das PTFE-Gehäuse bereit zu tauchen.
    6. Halten der Folie in der Klemme, die senkrecht zu der Luft-Wasser-Grenzfläche. Mit der Steuer-Software es langsam zu erhöhen (15 mm / min) über die Schnittstelle, während einen konstanten Druck auf 27 mN / m gehalten wird.
    7. In einer trockenen Umgebung entweder für die sofortigen Gebrauch oder für die Speicherung von bis zu 24 h bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
  3. Abscheidung der zweiten Lipidschicht
    1. Aufrechterhaltung des Oberflächendruckes in dem Langmuir-Trog auf dem gewünschten Wert von 27 mN / m. Komprimieren Sie die Verwendung vonSteuersoftware der Langmuir-Vorrichtung und / oder eine geringe Menge an Lipid fügen den gewünschten Druck zu erreichen.
    2. Platzieren Sie die Glasobjektträger tragen, die Lipid-Monoschicht, hergestellt in Abschnitt 3.2.6, horizontal auf der Oberfläche des Wassers. Stellen Sie sicher, dass jede Folie über einer PTFE-Schale schwimmt.
    3. Schieben die Glasobjektträger nach unten, eine Folie zu einem Zeitpunkt, in sein entsprechendes Fach PTFE verwendet PTFE oder Metallpinzette, so dass sie in das Wasser eingetaucht sind. Vermeiden Sie die Folien Kippen während schieben.
    4. Verwenden PTFE oder Metallpinzette, die PTFE Böden enthalten die Objektträger in einen Kristallisator mit Reinstwasser sicherstellen gefüllt zu übertragen, dass die Schieber nicht der Luft ausgesetzt sind.
    5. Verwenden PTFE oder Metallpinzette zu übertragen, während unter Wasser arbeiten, ein zweischichtige beschichteten Glasobjektträger in eine Beobachtungskammer.
      HINWEIS: Die Beobachtungskammer wird unter Wasser in dem Kristallisator gegeben. Die Beobachtungskammer ist nach Maße und besteht aus einem PTFE-Ring mit einer Gummidichtung einesd Stahlgehäuse, die unter Wasser zusammengesetzt werden können, um eine wasserdichte Kammer, deren Bodenfläche der zuvor von dem Glasobjektträger mit der Lipiddoppelschicht beschichtet ist, hergestellt zu machen.
    6. Schließen die Kammer während sie weiterhin unter Wasser zu arbeiten, und um sicherzustellen, dass ca. 1 ml Wasser wird in der Kammer gefangen.
    7. Nehmen Sie die zusammengesetzte Kammer aus dem Wasser. Stellen Sie sicher, dass es wasserdicht und leckagefrei.
    8. Setzen Sie die 1 ml ultrareinem Wasser, die in der Beobachtungskammer mit PBS durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul 10-fach PBS. Stellen Sie sicher, dass die Kammer nie frei von Flüssigkeit ist.
  4. SLB Blockierungsschritt
    1. Einführung von 100 ug / ml Rinderserumalbumin (BSA) in der Beobachtungskammer die Folie, hergestellt in Abschnitt 3.3.6 und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C) enthält.
    2. Spülen Sie die Bilayer durch Entfernen und Hinzufügen von 500 ul 10-fach PBS. Die Bilayer kann 24 h bei 4 ° C aufbewahrt werden.

4. Funktionalisierung mit Liganden

  1. Hinzufügen fluoreszierende oder nicht fluoreszierende Neutravidin (NAV, eine deglykosylierte Version von Avidin nicht bei pH 7 geladen) bei 2 & mgr; g / ml in die Kammer, um die Folie in Abschnitt 3.4.2 für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° hergestellt, enthaltend C).
  2. Spülen durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul 10-fach PBS.
  3. Hinzufügen biotinylierten anti-CD3 bei 2 ug / ml in die Kammer, um den Schieber in Abschnitt 3.4.2 enthält, hergestellt. Bei Doppel Funktionalisierung des SLB und die Punkte, fügt Fc-ICAM-1 His-Tag bei 5 & mgr; g / mL (hier die Doppelschicht aus DOPC + 1% Nitrilotriessigsäure (NTA) Lipiden hergestellt wird). Lassen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
  4. Spülen durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul PBS 10mal
  5. Ersetzen der PBS mit Zellmedium (PBS + 0,1% BSA) durch Zugabe und 500 & mgr; l des Zellmediums 10 mal entfernt wird.
  6. Lassen Sie 200 ul Zellmedium in der chambeR mit der Folie.
  7. Platzieren Sie die Kammer für 10 min bei 37 ° C vor der Zugabe von Zellen.

5. Zellablage (Referenz 7 für Details)

  1. deponieren vorsichtig 400 ul der Zellsuspension in die Kammer. Inkubieren der Zellen für 30 min bei 37 ° C.
  2. Fix die Zelle mit 2% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei 37 ° C. Ersetzen des PFA mit PBS durch wiederholte Entfernung und Zugabe von 500 & mgr; l PBS.

6. Beobachtung

  1. Proteo-lipidischen Nanomuster und SLB Fluidität
    1. Verwenden eines Fluoreszenzmikroskops dem Bild das Proteinmuster im Auflicht-Fluoreszenz - Modus geeignete Beleuchtungswellenlänge (639 nm) und Filterwürfel (zB hier EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688).
      HINWEIS: Die Intensität des Signals kann die Menge an Protein innerhalb und außerhalb des Punktes abzuschätzen quantifiziert werden. Verwenden, um eine geeignete Beleuchtungswellenlänge (330 nm) und Filter Würfel Bild mit der Doppelschicht (BP 365/12, FT 395, LP 397), die mit dunkelen Löchern hell erscheint.
    2. Verwenden kontinuierliche Fotobleich (CPB) -Technik 13, 15 , um die Diffusionskonstante des Tracers Lipide in der Doppelschicht zu messen. Diese Beobachtung wird vorzugsweise kurz nach der SLB Abscheidung hergestellt.
      ANMERKUNG: Um die Diffusionskonstante, zwei Parameter gemessen, während CPB Prozess zu quantifizieren: die spezifische Bleichzeit des Farbstoffs (Taut) und die Abklinglänge des Fluoreszenzprofil des Halo um die gebleichte Fläche (Taud) gebildet ist. Die erste ist durch Aufzeichnen der Zeitentwicklung der Fluoreszenzintensität in der Mitte des beleuchteten Feldes während des CPB Verfahrens erhalten. Das zweite ist, die durch Auftragen der Intensitätsprofil am Rand des ausgeleuchteten Zone (gemittelt über 12 Zeilen und 5 Bilder nach dem stationären Zustand erreicht ist) erhalten. Die Kurven sind ausgestattet Taut und Taud zu erhalten. Die Diffusionskonstante wird durch ta gegebenuD 2 / Taut (D = figure-protocol-1 ).

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Ergebnisse

Die Fluoreszenzbilder wurden analysiert, um den Abstand und die Größe der Punkte zu messen. Typische Abstände wurden gefunden 1.900 ± 80 nm und typischer Punktgrßenauswahlmittel sein betrug 600 ± 100 nm (Figur 1g). Der Abstand wird durch die Größe der Perlen für die Maske verwendet, eingestellt. Die Punktgröße wird durch die sickenGröße sowie Abscheidebedingungen eingestellt. Der SLB ist eindeutig um die Protein - Punkte und nicht auf sie (Figur 2), mit ...

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Diskussion

Die kritischen Schritte in dem oben beschriebenen Protokoll werden zur Bildung der Nano dots Protein verwandt oder der Hinterfüllen des Raumes um die Punkte, die durch einen unterstützten Lipiddoppelschicht. Der erste kritische Schritt in Bezug auf Protein-Nanopunkten ist die Herstellung der Wulstes-Maske. Die Reinigung des Deckelschlitten ist kritisch. Die Folien müssen entweder mit einer Reinigungslösung gereinigt werden, die für die Reinigung von Quarzküvetten, oder mit einem Sauerstoffplasma wird empfohlen. Andere R...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken Laurent Limozin, Pierre Dillard und Astrid Wahl für fruchtbare Diskussionen über zelluläre Anwendungen fort. Wir danken auch Frederic Bedu von PLANETE Reinraum für seine Hilfe bei SEM Beobachtungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Europäischen Forschungsrat über Zuschuss Nr 307104 FP / 2007-2013 / ERC finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GlasdeckgläserAssistent, Karl Hecht KG 
Selbstgemachtes
alkalisches Tensidkonzentrat (Hellmanex)Hella Analytics9-307-011-4-507
UltraschallgerätThermoFisher
ExsikkatorLabbox
Kristallisator Shott
NeutravidinThermo Fischer Scientifique84607
PBS Sigma-aldrichP3813
Wasser MQ ELGA, Veolia Frankreich
KieselsäurekügelchenCorpuscular Inc147114-10
APTESSigma-aldrichA3648
BSA-BiotinSigma-aldrichA8549
DOPCAvanti Polare Lipide850375C
Dansyl-PEAvanti Polare Lipide810330C
ChloroformSigma-aldrich650471
Gasdichte Spritze Dominique Dustcher , Frankreich74453
FilmwaageNIMAMedium
MikroskopZeiss, DeutschlandTIRF-III System
Aluminium Target Kurt J. Lesker Compagny, USA
Hochfrequenz-Magnetron-Sputtersystem me modifiziertes SMC 600 Werkzeug von ALCATEL , Frankreich

Referenzen

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