Method Article

Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

DOI:

10.3791/55077

⸱

January 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 2Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Jahangirnagar University, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences, 5Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine ​​etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkriptionelle Coregulatoren sind für die effiziente Transkriptionsregulation der nuklearen Chromatinstruktur von entscheidender Bedeutung. Coregulatoren spielen eine Vielzahl von Rollen bei der Regulierung der Transkription. Dazu gehören die direkte Wechselwirkung mit Transkriptionsfaktoren, die kovalente Modifikation von Histonen und anderen Proteinen sowie die gelegentliche Veränderung der Chromatinkonformation. Dementsprechend ist die Etablierung relativ schneller Methoden zur Identifizierung von Proteinen, die innerhalb dieses Netzwerks interagieren, entscheidend, um unser Verständnis der zugrunde liegenden Regulationsmechanismen zu verbessern. Die LC-MS/MS-vermittelte Identifizierung von Proteinbindungspartnern ist eine validierte Technik zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen. Durch die Immunpräzipitation eines zuvor identifizierten Mitglieds eines Proteinkomplexes mit einem Antikörper (gelegentlich mit einem Antikörper für ein markiertes Protein) ist es möglich, seine unbekannten Proteinwechselwirkungen mittels Massenspektrometrie zu identifizieren. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode der Proteinpräparation für die LC-MS/MS-vermittelte Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteininteraktionen vor, an denen nukleäre Cofaktoren und ihre Bindungspartner beteiligt sind. Diese Methode ermöglicht ein besseres Verständnis der transkriptionellen Regulationsmechanismen der anvisierten nuklearen Faktoren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Funktionen. Als solche haben diese Wechselwirkungen wurden in Signaltransduktion in Verbindung gebracht; Proteintransport durch Zellmembranen; Zellstoffwechsel; und mehrere Kernprozesse, einschließlich der DNA - Replikation, DNA - Schäden zu reparieren, Rekombination und Transkription 1, 2, 3, 4. Identifizierung der Proteine ​​in dieser Wechselwirkungen beteiligt ist daher von entscheidender Bedeutung, unser Verständnis dieser zellulären Prozesse voranzutreiben.

Immunopräzipitation (IP) ist eine validierte Technik verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu analysieren. Ist , um die Identifizierung von co-immunpräzipitiert Proteine, Massenspektrometrie häufig 5 verwendet zu erleichtern, 6, 7, 8,9. ein bekanntes Mitglied einer Protein-Komplex mit einem Antikörper von Targeting ist es möglich, den Proteinkomplex zu isolieren und seine unbekannten Komponenten über Massenspektrometrie-Analyse, um anschließend zu identifizieren. ARIP4 (Androgen - Rezeptor-interacting protein 4), eine Transkriptions coregulator, in Wechselwirkung mit der Kernrezeptorproteine, um seine Zielpromotoren in einer kontextabhängig 9, 10 zu aktivieren oder zu unterdrücken . ARIP4 interagierende Proteine ​​mit Hilfe der LC-MS / MS-System, um besser auf die Transkriptionsregulationsmechanismen verstehen diese Kernfaktoren regeln, beschreiben wir ein umfassendes Verfahren zur Reinigung und zu identifizieren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfection

  1. Samen HEK293 - Zellen in 100-mm - Kulturplatten (2 x 10 6 Zellen / Schale). Kultur die Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 100 ug / ml Streptomycin und 100 Einheiten / ml Penicillin. Inkubieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C.
  2. Am nächsten Tag Transfizieren der Zellen mit 10 ug FLAG-markiertes Plasmid ARIP4 40 ul Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers 11.

2. Protein Extraction

  1. Etwa 36 Stunden nach der Transfektion, waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS und die Zellen ernten mit einem Schaber. Übertragen Sie die Zellen in einer 1,5 mltube und zentrifugiert es bei 8000 × g für 2 min bei 4 ° C. Aspirat der Überstand und Zellpellet in 5x der Pelletvolumen von 0,4 M KCl-Puffer (Hochsalzpuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x Protease - Inhibitor - Cocktail). Drehen, um die Mischung für 20 min bei 4 ° C.
  2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 17.700 g für 10 min bei 4 ° C.
  3. Den Überstand (Ganzzellextrakt) in ein neues 2-ml - Röhrchen und fügen 3x das Anfangsvolumen von 0 M KCl - Puffer (Verdünnungspuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail).
  4. Führen Sie eine weitere Zentrifugation (17.700 × g für 10 min bei 4 ° C) und den Überstand (Gesamtzellextrakt) in ein neues 2-ml-Tube.

3. Immunoprecipitation

  1. Während der Zentrifugation (2.4), wasche 50 ul anti-FLAG Perlen mit PBS, 0,1 M Glycin-Hydrochlorid, und dann wurde 1 M Tris-Hydrochlorid, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 0,1 M KCl Puffer (Puffer mit niedrigem Salz: 20 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM b-Mercaptoethanol, Inhibitorcocktail 1x Protease). Die Zentrifugation für diesen Waschvorgang wird bei 2.000 xg für 1 min bei 4 ° C durchgeführt wird.
  2. Mischungs 50 ul FLAG Kügelchen mit den Ganzzellextrakte und drehen vorsichtig die Mischung 4 h bei 2-4 ° C (1% des gesamten Zellextrakts aus Schritt 2.4 auch bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung aufbewahrt werden sollte, als Eingang).
  3. Übertragung der Probe auf ein Mikrozentrifugensäule (Schwerkraft drop). Halten Sie die Durchfluss in einem 1,5-ml-Röhrchen, einfrieren mit flüssigem Stickstoff, und speichern Sie sie bei -80 ° C (überprüfen Sie die Proteinwerte sowohl der Eingangs- und Durchfluss Western-Blot-Analyse unter Verwendung).
  4. 1 ml 0,1 M KCl-Puffer (Puffer mit niedrigem Salz) die FLAG-Perlen (Schwere Tropfen) zu waschen.
  5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 mindestens vier weitere Male (insgesamt fünf Waschungen).

4. Elution

  1. Die Säule in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren es bei 2000 × g für 1 min; die Perlen trocknen.
  2. Verschließen Sie die Unterseitedie Kolumne.
  3. Werden 50 & mgr; l (gleich dem Volumen von FLAG beads) von 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5).
  4. Schütteln Sie die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  5. Platzieren Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren es bei 2.000 × g für 1 min.
  6. Die eluierte Lösung wird mit 10 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert; gut mischen durch Pipettieren oder durch eine Wirbelmaschine.

5. Alkylierungs- und Trypsinisierung

  1. Zugabe von 50 ul 100 mM NH 4 HCO 3, 10 & mgr; l CH 3 CN und 2 ul Dithiothreitol zum Gemisch (112 ul Gesamtvolumen).
  2. Inkubieren der Probe für 30 min bei 56 ° C.
  3. Die Probe wird bei Raumtemperatur für 10 min.
  4. Zugabe von 10 & mgr; l 333 mM Iodacetamid zur Probe und Inkubieren im Dunkeln für 30 min bei 37 ° C.
  5. Zugabe von 10 & mgr; l Trypsin (33 ng / ul) zu dem Gemisch und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.

6. LC-MS / MS-Analyse

  1. Nach über Nacht Trypsinierung, transportieren das Endprodukt zu einem LC-MS / MS - Anlage oder an einem Drittlabor Massenspektrometrie zur Analyse 12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir identifizierten ein starkes ARIP4 Signal, etwa 160 KDa, sowie diejenigen eines Mock Probe Kontrolle und mehrere andere unbekannte Proteine (Abbildung 1). LC-MS / MS - Analyse sowohl die ARIP4 komplexe Peptide und die potentiellen Peptid - Cofaktoren in der Fraktion von FLAG - Kügelchen (Tabelle 1) identifiziert. p62 (Sequestosome1), einem bekannten ARIP4 Cofaktor 11 wurde in der Analyse (Tabelle 1) identifizie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Effiziente Transfektion ist wichtig, ein erfolgreiches Ergebnis mit diesem Protokoll zu erhalten. Dementsprechend empfehlen wir Western-Blot-Analyse unter Verwendung der immunpräzipitierten FLAG-markierten Protein-Spiegel zu bestimmen. Dieser Schritt ermöglicht es Benutzern, zu überprüfen, ob ihre Protein von Interesse richtig überexprimiert und darüber hinaus, dass die IP wurde erfolgreich durchgeführt. FLAG-markierte Proteinspiegel sollte auch vor der Massenspektrometrie-Analyse überprüft werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde unterstützt von der Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), der Takeda Science Foundation (HT) und von einer Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzThermo Fisher Scientific11668019
Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei) (100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220
Micro Bio-Spin SäulenBIO-RAD732-6204

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PreparationNuclear CofactorLC MS MS AnalysisProtein InteractionTranscriptional RegulationImmunoprecipitationMass SpectrometryFlag Tagged ProteinsHEK 293 CellsSilver Staining

Related Articles