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Methodenartikel

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als

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⸱

DOI:

10.3791/55113

⸱

16. Februar 2017

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache In - vivo - Methodik , die verwendet werden können , um systematisch und effizient Komponenten komplexer Signalwege und regulatorische Netzwerke in vielen wirbellosen Embryonen zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Bemerkenswert wenige Zell-zu-Zell-Signaltransduktionswege sind während der Embryonalentwicklung notwendig, um die große Vielfalt an Zelltypen und Geweben in der adulten Körperform zu erzeugen. Dennoch werden jedes Jahr mehr Komponenten einzelner Signalwege entdeckt, und Studien deuten darauf hin, dass es je nach Kontext eine signifikante Wechselwirkung zwischen den meisten dieser Signalwege gibt. Diese Komplexität macht die Untersuchung der Zell-zu-Zell-Signalübertragung in jedem in vivo Entwicklungsmodellsystem zu einer schwierigen Aufgabe. Darüber hinaus sind effiziente Funktionsanalysen erforderlich, um Moleküle zu charakterisieren, die mit Signalwegen assoziiert sind, die aus den großen Datensätzen identifiziert wurden, die von Differential-Screens der nächsten Generation generiert wurden. Hier veranschaulichen wir eine einfache Methode zur effizienten Identifizierung von Komponenten von Signaltransduktionswegen, die das Zellschicksal und die Achsenspezifikation in Seeigelembryonen steuern. Die genomische und morphologische Einfachheit von Embryonen, die denen des Seeigels ähneln, machen sie zu leistungsfähigen In-vivo-Entwicklungsmodellen für das Verständnis komplexer Signalinteraktionen. Die hier beschriebene Methodik kann als Vorlage für die Identifizierung neuartiger Signaltransduktionsmoleküle in einzelnen Signalwegen sowie der Wechselwirkungen zwischen den Molekülen in den verschiedenen Signalwegen in vielen anderen Organismen verwendet werden.

Einleitung

Gene regulatorische Netzwerke (KNS) und Signaltransduktionswege schaffen die räumliche und zeitliche Expression von Genen während der embryonalen Entwicklung, die verwendet werden, um die erwachsenen tierischen Körper Plan zu bauen. Zell-Zell-Signalwege sind wesentliche Bestandteile dieser regulatorischen Netzwerke, die Bereitstellung der Mittel, durch die Zellen in Verbindung stehen. Diese zellulären Interaktionen etablieren und die Expression von regulatorischen und Differenzierung Gene in und zwischen den verschiedenen Gebieten während der Embryonalentwicklung 1, 2 zu verfeinern. Wechselwirkungen zwischen sezerniert extrazellulären Modulatoren (Liganden, Antagonisten), Rezeptoren und Co-Rezeptoren steuern die Aktivitäten von Signaltransduktionswegen. Eine Auswahl von intrazellulären Molekülen wandelt diese Eingänge in veränderter Genexpression, Abteilung führt, und / oder die Form einer Zelle. Während viele der Schlüsselmoleküle bei den extrazellulären und intrazellulären Spiegel in den Hauptwegen verwendet werden,bekannt ist, ist es eine unvollständige Kenntnis der Komplexität der einzelnen Signalwege zu einem großen Teil. Zusätzlich interagieren verschiedene Signalwege oft miteinander entweder positiv oder negativ auf den extrazellulären, intrazellulären und Transkriptionsebenen 3, 4, 5, 6. Wichtig ist , dass die Kernkomponenten von Signaltransduktionswegen hoch in allen metazoan Spezies konserviert, und bemerkenswert, führen die meisten der wichtigsten Signalwege oft ähnliche Entwicklungsfunktionen in vielen Arten , wenn Organismen von eng verwandten Stämmen insbesondere 7, 8, 9 zu vergleichen, 10, 11.

Die Studie der während der Entwicklung Signalgebung ist eine schwierige Aufgabe in jedem Organismus, undmehrere bedeutende Herausforderungen zu studieren Signalwege in den meisten Deuterostomia Modelle (Vertebraten, Invertebraten Chordaten , Kiemenlochtiere und Echinoderme): 1) In Vertebraten gibt es eine große Anzahl von möglichen Liganden und Rezeptor / Co-Modulator - Wechselwirkungen, die intrazelluläre Transduktion Moleküle sowie mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Signalwegen aufgrund der Komplexität des Genoms 12, 13, 14; 2) Die komplexe Morphologie und morphogenetische Bewegungen bei Wirbeltieren oft erschweren funktionelle Interaktionen in und unter Signaltransduktionswege zu interpretieren; 3) Die Analysen in den meisten Nicht-echinoderm invertebrate Deuterostomia Modellarten werden durch kurze Fenster von gravidity mit Ausnahme einiger tunicate Arten 15, 16 begrenzt.

DasSeeigel embryo hat einige der oben erwähnten Beschränkungen und bietet viele einzigartige Eigenschaften für eine detaillierte Analyse von Signaltransduktionswegen in vivo durchgeführt wird . Dazu gehören die folgenden: 1) Die relative Einfachheit des Genoms Seeigel reduziert signifikant die Anzahl der möglichen Ligand, Rezeptor / Co-Rezeptor und intrazellulären Transduktion Molekül - Wechselwirkungen 17; 2) Die KNS die Spezifikation und die Strukturierung der Keimblätter und die wichtigsten embryonalen Achsen steuern gut in Seeigel - Embryonen etabliert, in dem Verständnis der regulatorischen Kontext der Zelle / Gebiet Beihilfe Empfangen der Signale 18, 19; 3) Viele Signaltransduktionswege können zwischen frühen Spaltung und Gastrula Stadien untersucht werden , wenn Embryonen von einem einschichtigen Epithel , deren Morphologie bestehen ist einfacher zu analysieren; 4) Die Moleküle beinhaltend in Bahnen in den Seeigeln Signalisierung leicht manipuliert werden; 5) Viele Seeigel sind für 10 bis 11 Monate im Jahr (zB Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus trächtig).

Hier präsentieren wir eine Methode, um systematisch und effizient Komponenten der Signalwege zu charakterisieren, die angeben, und das Muster Gebiete in Seeigel-Embryonen, die Vorteile zu verdeutlichen, dass mehrere wirbellosen Modellsysteme in der Studie von komplexen molekularen Mechanismen bieten.

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Protokoll

1. Hoher Durchsatz Morpholino Design Strategy

  1. Identifizieren eines Gens (e) von Interesse (zB Kandidatengen - Ansatz, cis-regulatorische Analyse, RNA-Seq und / oder Proteom - Differential - Bildschirme).
  2. Verwenden Sie genomischen, Transkriptom und Genexpressionsdaten auf häufig aktualisierte Webseiten (zB SpBase http://www.echinobase.org 20 und S. purpuratus Genom suchen http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html), um festzustellen, dass der Raum-Zeit-Expressionsprofil überlappt sich mit dem Entwicklungsmechanismus in Frage. Wenn kein Ausdruckdaten verfügbar ist, dann erzeugen qPCR Primer und / oder ein Antisense - in - situ - Sonde , die die Genexpressionsmuster zu beurteilen.
  3. Nach der räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster zu bestimmen, erhalten von den genomischen Websites die DNA-Sequenz.
    1. Zur Erzeugung von Morpholino-Oligonukleotide Translation-blocking, erhalten Sequenz of die 5 'un-translatierte Region (5' - UTR) direkt stromaufwärts vom Initiationscodon von exprimierten Sequenz - Tag (EST) der verfügbaren Datenbanken auf SpBase oder S. purpuratus Genom Search Websites. Wenn diese Informationen für das Gen von Interesse nicht verfügbar ist, führen Sie dann 5 'RACE.
    2. So entwerfen Sie einen Spleiß-Blocking - Morpholino, suchen Sie nach der genomischen Sequenz einschließlich der Exons und Introns mit dem Gerüst blastn- Werkzeug in SpBase oder S. purpuratus Genom Search Tool.
  4. Verwenden Sie das Oligonukleotid-Design Website http://oligodesign.gene-tools.com, um die gewünschte 25-Basenpaar-Morpholino-Sequenz zu entwerfen.
    1. Für eine translatorische blockierungs Morpholino, verwenden, um die mRNA-Sequenz von 5 'zu 3' als Quelle der Translationszielsequenz. Fügen Sie die UTR-Sequenz 5 '(ca. 70 Nukleotide stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle) plus 25 Basen der kodierenden Region (hinter der Startstelle) mit dem Start-Codon markierten with Klammer (ATG).
    2. Für eine Spleiß-blocking Morpholino, wählen Intron-Exon oder Exon-Intron-Grenze-Sequenz und umfassen 50 Basen (25 Basen von Exon-Sequenz und 25 Basen von Intron-Sequenz) um die Grenzbereiche. Scannen des Genoms mit dem Morpholino-Sequenz zu überprüfen, ob die Sequenz einzigartig ist.

2. Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

  1. Bereiten Sie 3 mM Stammlösungen der Morpholino-Oligonukleotide durch Zugabe von 100 ul Nuklease-freies Wasser in die 300 nmol Morpholino Fläschchen.
    HINWEIS: Verwenden Sie nicht DEPC behandeltem Wasser für die Wieder Suspension verwenden, da Diethylpyrocarbonat die Morpholino beschädigen können.
  2. Zum ersten Rekonstitution Spin-Down das Fläschchen mit dem Lager-Oligonukleotid-Lösung für 30 s bei voller Geschwindigkeit, die (14.000 - 16.000 · g), kurz Wirbel, Wärme bei 65 ° C für 5 bis 10 min, kurz Wirbel, und halten Sie die Morpholino Lager bei Raum Temperatur für mindestens 1 h. Morpholino-Stammlösung s werden von -20 ° C bis + 4 ° C gelagert.
  3. Bereiten Injektionslösung morpholino Oligonukleotiden in der gewünschten Konzentration enthält. Diese Lösung enthält in der Regel 20% Glycerin oder 125 mM KCl als Trägerstoff und 15% FITC-Dextran (Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran 10.000 MW 2,5 mg / & mgr; l Vorratslösung). FITC-Dextran und anderen fluoreszierenden Dextran-Konjugate werden routinemäßig zur Identifizierung injizierten Embryonen durch Epifluoreszenzmikroskopie verwendet. Store Injektionslösungen bei -20 ° C.
  4. Erhitzen Sie das Morpholino-Lösung bei 65 ° C in einem Heizblock oder Wasserbad für mindestens 2 - 5 min.
  5. Kurz Spin für 30 s bei voller Geschwindigkeit die Morpholino-Lösung (14.000 - 16.000 xg), Wirbel für 1 min und Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (14.000 - 16.000 · g) für mindestens 10 min.
  6. Laden Sie die Injektionsnadeln mit der Morpholino-Lösung. Für eine detaillierte Mikroinjektionsprotokoll finden Sie unter Stepicheva und Song, 2014 21 und Prost und Ettensohn 2004"> 22.

3. Fixierung und In - Situ - Protokoll bei 24 h nach der Befruchtung (HPF) in S. purpuratus Embry

Hinweis: Dieses Protokoll von Arenas-Mena et al modifiziert wird. 2000 23 und Sethi et al. 2014 24.

  1. Fixierung
    1. Fügen Sie einige Tropfen Fixierungsmittel (siehe unten) zu Vertiefungen, die Embryonen vorsichtig mischen durch Pipettieren, und es ihnen ermöglichen, zu begleichen. Entfernen Sie die Fixierungslösung, und dann Embryonen mischen mit zwei zusätzlichen 180 ul Waschungen von Fixiermittel.
      Hinweis: Während der Wäschen durch sanftes Auf- und Abpipettieren mehrmals Es ist wichtig, gründlich die Embryonen mischen. Geschieht dies nicht , kann das Signal - Rausch - Verhältnis zu senken.
    2. Lassen Sie die Embryonen in der zweiten Fixierungsmittel waschen zu fixieren für 50 min bis 1 h bei Raumtemperatur (RT) in 4% Elektronenmikroskopie Klasse Paraformaldehyd, bestehend aus 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20 und künstliche seawater (ASW). Machen Sie diese Lösung jedes Mal für die besten Ergebnisse frisch. Zusätzlich zur einfachen und Praktikabilität Embryonen werden in Platten mit 96 Vertiefungen fixiert.
      1. Für 20 ml Fixiermittel Verwendung 5 ml 16% Paraformaldehyd, 15 ml ASW, 200 & mgr; l 1 M MOPS pH 7,0, und 20 & mgr; l Tween-20.
    3. Waschen 5mal bei RT mit 180 & mgr; l MOPS-Waschpuffer von 0,1 M MOPS pH 7,0, bestehend, 0,5 M NaCl und 0,1% Tween-20 für mindestens 5 min oder bis Embryonen bis zum Boden des Bohrlochs fallen. Auch hier ist es wichtig, dass die Embryonen in die Waschpuffer durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mehrmals gründlich zu mischen. MOPS Waschpuffer kann für 2 Tage verwendet werden, wenn bei 4 gespeichert ° C.
      1. Für 40 ml waschen MOPS - Puffer Gebrauch 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH 2 O und 40 ul Tween-20.
      2. Fest Embryonen für 2 Tage bei 4ºC gelagert werden.
        HINWEIS: Wenn fixierte Embryonen länger speichern, dann mit 0,2% Natriumazid in MOPS-Puffer waschen Bakterienwachstum zu verhindern.
  2. Vorhybridisierung
    1. Absaugen MOPS Waschpuffer und 180 ul einer 2 hinzuzufügen: 1-Verhältnis von MOPS waschen, um Hybridisierungspuffer Puffer, mischen Embryonen in die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals, und Inkubation mindestens 20 min bei RT. Hybridisierungspuffer besteht aus 70% Formamid, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA und 0,1% Tween-20.
      1. Für 40 ml Hybridisierungspuffer Verwendung 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH 2 O, 0,04 g BSA und 40 ul Tween-20. Gut mischen durch Vortexen, fügen Sie 28 ml Formamid und Wirbel wieder.
    2. Entfernen Sie die 2: 1-Verhältnis von MOPS waschen und Hybridisierungspuffer und fügen 180 ul einer 1: 2-Verhältnis von MOPS-Puffer waschen, um Hybridisierungspuffer, mischen Embryonen in die Lösung und Inkubation für mindestens 20 min bei RT.
    3. Vor sanft Sondenhybridisierung Embryonen mischen in 100-150 ul Hybridisierungspuffer. Inkubieren Embryonen bei 50 ° C für mindestens 1h.
      HINWEIS: Inkubieren Embryonen über Nacht akzeptabel ist. Vor der Inkubation dichten die Vertiefungen mit einer Klebefolie um ein Verdampfen zu verhindern.
  3. Hybridisation
    1. 0,3 ng / & mgr; l-Sonde und 500 ug / ml Hefe-tRNA in Hybridisierungspuffer, dann Wirbel sanft Sonde Lösung zu schaffen - in einem separaten Röhrchen 0,1 hinzuzufügen. Hefe-tRNA wird an die Sondenlösung hinzugefügt des anti-sense Sondenbindungs ​​unspezifische zu verringern. Vorzuwärmen, diese Lösung auf 50 ° C und absaugen Hybridisierungspuffer.
    2. Mischungs vorhybridisiert Embryonen in 100 & mgr; l der Sondenlösung, Abdichten mit einer Klebefolie und hybridisieren bei 50 ° C für 2 bis 7 Tage , je nach der Sonde (die foxq2 Sonde kann für 2 Tage inkubiert werden).
      HINWEIS: Die Inkubationszeiten variiert die Sonde basiert. Einige Gene auf einem niedrigen Niveau exprimiert benötigen bis zu einer 7-tägigen Inkubation. 96-Well-Platten können in einer feuchten Box als Versicherung gegen Verdunstung, wenn die Klebs platziert werdenive Blatt nicht richtig abdichten.
    3. Waschen 5 mal bei 50 ° C mit 180 & mgr; l frisch zubereiteter MOPS-Waschpuffer für insgesamt 3 h. Dann wird 3x waschen (15 min) mit 180 & mgr; l MOPS-Waschpuffer bei RT. Denken Sie daran, Embryonen in die Wäsche zu mischen jedes Mal Puffer durch mehrmals vorsichtig pipettieren.
  4. Antikörperinkubation
    1. Absaugen MOPS Waschpuffer und mischen Embryonen in 180 & mgr; l der Blockierung über Nacht Puffer, bestehend aus 10% normalem Schafserum und 5 mg / ml BSA in MOPS Waschpuffer und Inkubation für mindestens 45 min bei RT oder 4 ° C.
    2. Entfernen Blocking-Puffer und dann Embryonen Mischung in einen Blockierungspuffer, enthaltend 1: 1.500-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase konjugierten anti-Digoxigenin-Antikörper, verdünnt in Blockierungspuffer. Inkubieren über Nacht bei RT in einem verschlossenen Platte Verdunstung zu vermeiden. HINWEIS: Lassen Sie keine Antikörper auf mehr als über Nacht.
    3. Waschen Embryonen 6-mal (5 min oder bis Embryonen fallen) in MOPS-Waschpuffer bei RT. Embryonenwerden über Nacht bei 4 ° C gelagert.
  5. In - situ - Entwicklung
    1. Waschen Embryonen 3 mal (10 min) bei RT mit frisch pH 9,5 - Puffer, bestehend aus 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2, 1 mM Levamisol und 0,1% Tween-20.
      1. 20 ml pH 9,5 - Puffer verwendet 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 & mgr; l 5M NaCl, 1 ml 1 M MgCl 2, 20 & mgr; l Tween-20, 16,6 ml dH 2 O und 0,0048 g Levamisol.
    2. Inkubieren Embryonen bei 37 ° C in Färbepuffers vor Licht geschützt. Färbepuffer besteht aus 10% Dimethylformamid, 4,5 & mgr; l / ml 4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 3,5 ul / ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) in frisch pH 9,5-Puffer, .
      1. Für 1 ml Färbepuffers verwenden 100 ul Dimethylformamid, 4,5 ul NBT und 3,5 ul BCIP.
    3. Stoppen Sie die alkalische Phosphatase-Reaktion von 3 bis 5 Mal in MOPS Waschen Waschpuffer. Die Reaktion with die foxq2 Sonde dauert in der Regel 30 min bis 1 h. Einige Sonden benötigen Inkubation über Nacht bei entweder RT oder bei 4 ° C.
    4. Mischen Sie Embryonen in eine Lösung von 70% MOPS waschen und 30% Glycerin. Das Glycerin stellt einen Brechungsindex, die für die Mikroskopie. Embryos können in dieser Lösung für mehrere Wochen gelagert werden. Verschließen Sie die Platten mit Kunststoff-Paraffin Verdunstung zu verhindern.
  6. Slide Vorbereitung und Bilderfassung
    1. Vorbereitung einer Folie durch drei kleine Streifen des doppelseitigen Klebebandes in ein Dreieck mit kleinen Lücken zwischen den Streifen auf einem Objektträger angeordnet werden.
    2. Übertragen Sie die Embryonen in der 70% MOPS waschen und 30% Glycerin-Lösung in die Mitte des Dreiecks und die Abdeckung mit einem Deckglas.
    3. Deckglasränder durch eine Schicht von Auftragen von Nagellack um die Ränder des Deckglases.
    4. Zum Aufzeichnen von Bildern eine Verbindung Lichtmikroskop mit einem 20x-Objektiv mit und einer angeschlossenen Kamera.

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Ergebnisse

Im Seeigel Embryo wir haben gezeigt , dass drei verschiedene Wnt - Signalzweige (Wnt / β-Catenin, Wnt / JNK und Wnt / PKC) 4, 25 interact ein Wnt - Signalnetzwerk zu bilden , die von vorne nach hinten (AP) Strukturierung regelt. Eine der wichtigsten Folgen dieser Signalisierungsereignisse besteht darin , dass die anfängliche breit ausgedrückt anterioren Neuroektoderm (ANE) GRN auf ein kleines Gebiet um den vorderen Pol durch den ...

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Diskussion

Die Methodik präsentiert hier ist ein Beispiel, das die Macht der Verwendung von Embryonen mit weniger genomischen und morphologische Komplexität als Wirbeltiere zeigt die Signalübertragungswege und KNS Regierungs grundlegenden Entwicklungsmechanismen .. Viele Labors verwenden ähnliche Tests während der frühen Seeigel Entwicklung zu verstehen, die zu sezieren Signalisierung in anderen Zellschicksal Spezifikation Ereignisse beteiligt Wege (zB Notch, Igel, TGF - β und FGF - Signalisierung) ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Robert Angerer für seine sorgfältige Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts. Das NIH R15HD088272-01 sowie das Office of Research and Development und das Department of Biological Sciences der Mississippi State University unterstützten RCR bei diesem Projekt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Translationsblockierendes Morpholino und/oder Spleißblocker MorpholinoGene Tools LLCCustomizedWeitere Informationen unter www.gene-tools.com
GlycerolInvitrogen15514-011
FITC (Dextran Fluorescein isothiocyanat)Invitrogen, Life TechnologiesD1821Herstellung von 25 mg/ml Stammlösung
Paraformaldehyd 16% Lösung EMGrade Electron Mikroskopie Wissenschaften15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamidSigma Aldrich47671-1L-F
Hefe tRNAInvitrogen15401-029
Normales ZiegenserumSigma AldrichG9023-10mL
Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Digoxigenin-AntikörperRoche11 093 274 910
Tetramisolhydrochlorid (Levamisol)Sigma AldrichL9756-5G
Tris Base UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
NatriumchloridFisher ScientificBP358-10
MagnesiumchloridSigma Aldrich7786-30-3
BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphatRoche11 383 221 001
4 Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT)Roche11 383 213 001
DimethylformamidSigma AldrichD4551-500mL
KaliumchloridSigma AldrichP9541-5KG
NatriumbicarbonatSigma AldrichS5761-500G
MagnesiumsulfatSigma AldrichM7506-2KG
CalciumchloridSigma AldrichC1016-500G

Referenzen

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