Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultur der Maus Urnierengang (WD). Wir haben auch ein detailliertes Verfahren für ganze Berg Immunfärbung von kultivierten / frisch isolierten RDG mit fluoreszenz getaggten Antikörper nachweisen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken die Untersuchung von WD Entwicklung, Wickeln und Differenzierung.
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Methodenartikel
Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tubal Morphogenese ist eine grundlegende Voraussetzung für die Entwicklung der meisten Säugetierorganen, einschließlich des männlichen Fortpflanzungssystems. Der Nebenhoden, ein integraler Bestandteil des männlichen Reproduktionstraktes, ist verantwortlich für die Spermien Lagerung, Reifung und Transport. Der erwachsene Epididymis ist ein hoch gewundenes Rohr, das als Urnierengang (WD) bekannt von einer einfachen und geraden embryonale Vorläufer entwickelt. Die richtige Wickeln der Epididymis ist von wesentlicher Bedeutung für die männliche Fruchtbarkeit, wie Spermien im Hoden sind nicht in der Lage eine Eizelle zu befruchten. Jedoch bleibt der Mechanismus für epididymale Entwicklung und Aufwickeln unklar, teilweise aufgrund des Fehlens von ganzen Organkultur und Abbildungsverfahren. In dieser Studie beschreiben wir ein in - vitro - Kultursystem und whole mount Immunofluoreszenz Protokoll besser , den Prozess der WD Wickel- und Entwicklung sichtbar zu machen , die auch zu studieren anderen röhrenförmigen Organen angewendet werden kann.
Einleitung
Das männliche Fortpflanzungssystem besteht hauptsächlich aus Hoden, der Ort für Keimzellentwicklung und -differenzierung und einem komplexen duktalen System, das für die Reifung, den Transport und die Lagerung von Spermien benötigt wird. Epididymis ist ein röhrenförmiges Organ , das mit Hoden Samenleiter und vorrangig im post-Hoden - Entwicklung und Reifung der Keimzellen verbindet 1. Die hoch Coiled erwachsenen Maus Epididymis entwickelt sich aus einer einfachen und geraden Vorläuferrohr, Urnierengang (WD) 1. Die komplexe und gewundene Struktur der Epididymis ist von wesentlicher Bedeutung für die Spermien die Fähigkeit zu erwerben , weibliche Keimzellen 2 zu befruchten. Wie solch ein wichtiges Organ für die männliche Fruchtbarkeit entwickelt und wird in Form ist nicht gut verstanden. Verschiedene Signalwege sind in der Entwicklung von WD wie der Wnt - Signalwegs 3,4 und dem Androgen - Signalweg 5 einbezogen werden gezeigt. Unsere jüngsten Arbeiten hat die Forderung von bal etabliertgene Wnt - Signalisierung für WD Wickel während der vorgeburtlichen Entwicklung 4. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Mechanismen in der postnatalen epididymal Wickeln, Zelldifferenzierung und Zell-zu-Zelle innerhalb des epididymal Epithel und mit interstitiellen Zellen Kommunikation beteiligt zu verstehen.
Genetisch veränderte Mausmodelle haben sich bewährt , für die Identifizierung / Validierung von molekularen Mechanismen ein mächtiges Werkzeug , um zugrundeliegende Entwicklung und Krankheit verschiedener Organsysteme 6. Trotz seiner umfangreichen Gebrauch gibt es erhebliche Einschränkungen der genetisch veränderten Maus-Modellen, einschließlich der unpredicted Phänotyp gezielte Mausmutanten in Bezug auf vermutete Genfunktion und keine Phänotyp in Null-Mutanten in einigen Modellen Einfluss von genetischen und Umweltfaktoren, arbeitsintensiv und zeitraubender Prozess Mausmodelle zu entwickeln. Daher ist die Interpretation der Bedeutung der Ergebnisse nur aus genetisch modiFied Mausmodellen ist nicht immer einfach 6. Diese Einschränkungen können mit in vitro - Organkultursystem überwunden werden , die wir die Flexibilität gibt , um mehrere Signalwege in Echtzeit in kontrollierten Kulturbedingungen zu manipulieren. Organkultursystem ist instrumental 7 die Physiologie und Pathologie der ganzen Organen zu verstehen. Außerdem Abbildungs ganzer Organe gefärbt mit Fluorophor markierten Antikörper erlaubt es, die Marker von Interesse in einem dreidimensionalen Rahmen zu visualisieren, wie er in vivo vorliegt, um dadurch ein besseres Verständnis für die Form des Organs bietet, die Struktur und Funktion 8.
Hier haben wir die Methoden zur Isolierung von embryonalen Maus - Genitalleiste, in - vitro - Kultur und whole mount Immunofluoreszenz Bildgebung von RDG beschrieben, die angewendet werden können , eine Vielzahl von Fragen zu beantworten über die Morphogenese von röhrenförmigen Organen wie RDG. In diesem Protokoll wirisolierten Maus embryonale urogenitalen Grate von 15,5 Tagen nach coitum (DPC) schwanger Dämme und kultiviert sie für 3 d durch Immunfärbung für eine epitheliale Zellmarker gefolgt (Zytokeratin 8, CK8), einer Zellproliferationsmarker (Phospho-Histon 3, PH 3) und aktiv βcatenin.
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Protokoll
Tierpflege und experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Animal Care und Ethikkommission der Universität von Newcastle und bestätigt die New South Wales Animal Research Act, New South Wales Tierforschung Verordnung und der australischen Code für die Pflege durchgeführt und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke. Alle an Mäusen durchgeführten Verfahren wurden von der Tierpflege und Ethikkommission der Universität von Newcastle genehmigt.
1. Zeit Mating
- Paar 6 - 8 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen unmittelbar vor dem Ende der Sommerzyklus.
- Schauen Sie sich die Frauen für das Vorhandensein von Vaginalpfropf frühen Morgen (am oder vor 08.00 Uhr), jeden Tag. Tag der Stecker als 0,5 dpc betrachtet.
- Übertragen Sie das Weibchen mit Vaginalpfropfens in einen neuen Käfig (ohne Stecker) und das Datum der Stecker beschriften.
2. Isolierung von embryonalen Maus-Genitalleiste
- Isolieren Maus embryonic Genitalleiste von 15,5 dpc schwangeren Frauen , wie in 9, mit einigen Modifikationen beschrieben , wie unten beschrieben.
- Führen Sie Dissektion vor Mittag als die Zeit schwangere Frauen berücksichtigt werden in den nächsten Tag der Schwangerschaft bis zum Nachmittag zu betreten.
- Sacrifice 15,5 dpc trächtige Weibchen Zervikaldislokation (oder gemäß dem genehmigten Protokoll, das von den institutionellen Tierethikkommission).
- Halten Sie die Maus auf dem Rücken auf saugfähige Tissuepapier und sprühen die ventrale Seite des Bauches mit 70% Ethanol.
- Heben Sie die untere Bauchhaut (Bauchseite) mit einer Pinzette und machen einen seitlichen Schnitt chirurgische Schere, von urogenitalen Öffnung bis zum Ende Brustkorb verläuft. Ziehen Sie die Haut in Richtung des Kopfes des Tieres den Bauch zu belichten.
- Schneiden Sie die Bauchmuskeln mit chirurgische Scheren Bauchhöhle zu belichten. Besorgen Sie sich die graviden Uterus mit einer Pinzette gerade über dem Gebärmutterhals und einen Schnitt zu machen. Nun heben Sie die Gebärmutter, indem auf to der Harnblase und schneiden Sie die Uterus breit durch Schnitte gefolgt Band an den uterotubale Kreuzungen Uterus aus der Bauch Befestigung zu lösen.
- Übertragen Sie die Gebärmutter in einen 50-ml-Röhrchen eiskaltem HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) enthält. Waschen Sie die graviden Uterus sanft mit eiskaltem HBSS das überschüssige Blut zu entfernen.
- Halten Sie die Gebärmutter in einer Petrischale mit eiskaltem HBSS und auf Eis halten. Schneiden Sie die Gebärmutterwand und nehmen Sie die Embryonen aus. Halten Sie die Embryonen in einer frischen Petrischale mit HBSS auf Eis.
- Nehmen Sie ein sauberes sterile Tissue-Papier und legte es auf eine neue Petrischale. Spray 70% -igem Ethanol auf das Tissue-Papier. Halten Embryo auf dieser Tissue - Papier auf der lateralen Seite und schneiden Sie es aus Unterbauch eine sterile Klinge in Richtung verwendet , wie durch die gestrichelte Linie in Abbildung 1 dargestellt.
- Befestigen Sie den Embryo auf einem sterilen Schwamm Basis durch die Wirbelsäule feststecken.
- Legen Sie sie unter dem Sezieren Stereomikroskop und vorsichtig entlang der ventralen Mittellinie geschnitten. Entfernen Sie die Leber und Darm. Die Maus Urogenitalsystems (Niere, Harnleiter, Hoden, WD und vas deferens) sollte nun erkennbar sein.
- Schneiden Sie den Hoden und WD aus und halten eine frische Petrischale mit HBSS in, auf Eis. Um die WD und Hoden herausnehmen, schneiden Sie die Samenleiter der Nähe ihrer Befestigung an der Harnröhre und schneiden Sie die Befestigung des unteren Teils von WD von gubernaculum.
- Pool die Hoden und RDG aus den Embryonen von der gleichen Gruppe (dies gemäß dem Versuchsplan können variieren).
3. Kultur embryonaler Genitalleiste (Abbildung 2)
- Bereiten Medium für die embryonale Genitalleiste Züchten von DMEM / F12 mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) ergänzt, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% L-Glutamin. Erwärmen Sie die Medien auf 37 ° C in einem Wasserbad.
- In 300 & mgr; l Medium pro Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte.
- Nehmen Sie eine frische Petriplatte und einen kleinen Tropfen steriler HBSS auf sie. Setzen Sie ein Polycarbonat Spur Etch-Membran (0,881; m) auf dieser Tropfen HBSS mit seiner glänzenden Oberfläche die HBSS gegenüber.
- Mit sauberen Pinzette legte zwei RDG und Gonaden auf der Membran (auf seiner rauen Oberfläche, nach oben gerichtet ist) und die maximale Menge an HBSS mit sterilen Tüchern / saugfähigem Papier entfernen. Nicht das Gewebe mit saugfähigem Papier berühren; andernfalls wird es in das Gewebe beschädigen.
- Stellen Sie sicher, dass weder die RDG noch die Gonaden einander berühren. Andernfalls werden sie zusammen bei der anschließenden Inkubation bleiben.
- Übertragen, um die Membran mit den Geweben in die Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 300 & mgr; l Kulturmedium und Kultur sie an der Luft-Medium-Schnittstelle. Zu viel Kulturmedium auf Membranen führt zu einem zystischen Wachstum von RDG.
- Inkubieren der Platte bei 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2.
- Wechseln Sie jeden Tag das Kulturmedium. Um das Medium mit der Pipette zu ändern, entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen erste und fügen Sie dann 300 ul der vorgewärmten frisches Medium.
Hinweis:Um den Effekt der verschiedenen Signalwege auf WD Morphogenese studieren, chemische Aktivatoren und / oder Inhibitoren bei den erforderlichen Konzentrationen können zu dem Kulturmedium zugegeben werden. - Kultur die Gewebe für 3 d. Innerhalb von 3 d, gesammelt abgewickelte RDG aus einem 15,5 - dpc - Embryonen verwandeln sich in stark gewundene Rohre (3B). Die Zugabe des Wnt - Inhibitor, IWR1, führt zu einer Hemmung von WD Aufwickeln (3C).
- Für die Ernte nehmen diese Gewebe eine Petrischale mit eiskaltem PBS. Übertragen Sie die Membran mit kultivierten Gonaden und WD in die Petrischale. Die Membran wird auf dem PBS schweben. Drücken Sie die Membran in PBS zu versenken und die Gonaden und WD herausnehmen.
- Fixieren Sie die Gewebe mit 4% Paraformaldehyd (PFA) O / N bei 4 ° C oder für 1 h bei RT. Bei Bedarf nehmen Hellfeldbilder der RDG vor der Fixierung.
4. Ganze Berge Immunofluoreszenz
- Waschen Sie 3x die fixierten Gewebe mit PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) mit langsamen rocking, 10 min jeweils bei RT.
- Entwässern das Gewebe in einer abgestuften Reihe von Ethanol (25%, 50%, 75% und 100%), 10 min jeweils bei 4 ° C unter langsamem rocking (~ 30 rpm). Bei diesem Schritt können die Gewebe bei 4 ° C in 75% Ethanol aufbewahrt werden.
- Um das Ethanol zu ändern, halten Sie die ungestörte Gewebe für 2 Minuten und lassen Sie sich die Gewebe beruhigen. Nehmen Sie so viel Überstand wie möglich und dann die nächst höhere Konzentration an Ethanol hinzu. Um eine Beschädigung der Gewebe zu vermeiden, sollte die Pipettenspitze berühren nicht die Gewebe in jedem Stadium.
- Folgende Dehydratisierung rehydratisieren die Gewebe in einer abgestuften Reihe von Ethanol (100%, 75%, 50% und 25%), 10 min jeweils bei 4 ° C unter langsamem rocking.
- Waschen der Gewebe mit PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 min jeweils bei RT unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm).
- Blockieren die Gewebe für 1 h bei RT mit Blockierungspuffer (PBS + 1% BSA + 0,2% fettfreier Trockenmilchpulver + 0,3% Triton X-100).
- after zu blockieren, übertragen die Gewebe zu primären Antikörperlösung (verdünnt in Blockierungspuffer) und O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm) inkubiert. Verdünnungen der primäre Antikörper verwendet werden , in der Material Tabelle beschrieben.
- Am nächsten Tag waschen Gewebe mit PBS-MT (PBS + 2% fettTrockenMilchPulver + 0,5% Tween-20), 4x, jeweils 30 min bei RT unter leichtem Schütteln (~ 30 min).
- Nach diesem Waschschritt hinzufügen sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 250 (dieser Schritt benötigt Optimierung für einzelne Antikörper) in Blockierungspuffer und Inkubation für 1 h bei RT unter leichtem Schütteln.
- Ab sofort halten weiter die mit Aluminiumfolie abgedeckt Gewebe Lichteinwirkung zu verhindern, als Sekundärantikörper mit lichtempfindlichen Fluorophoren markiert sind.
- Waschen Sie die Gewebe 3x mit PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), jeweils 30 min, unter leichtem Schütteln.
- Bereiten Sie Folien für die gefärbten Gewebe Montage.
- Dazu schneiden Sie die Glasplättchenin dünne Streifen einen Diamantstift und kleben zwei Streifen übereinander auf dem Glasträger mit Nagellack. Machen Sie zwei Grenzen und Platz Gewebe zwischen diesen beiden Grenzen.
- In DAPI enthält Eindeckmediums und auf einem Deckglas. Bewerben Nagellack an den Ecken des Deckglases um es zu beheben, um die Folie.
Hinweis: Die Gewebe sind nun bereit für die Bildgebung. Bewahren Sie diese Folien bei -20 ° C.
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Ergebnisse
Während der Entwicklung erfährt der WD signifikanten Veränderungen bei der eine einfache und gerades Rohr in einem hochkomplexen und Spiralkanal umgewandelt wird. Verwendung von oben beschriebenen Verfahren unterzogen RDG eine ähnliche Umwandlung in Kulturbedingungen. Hier haben wir die Ergebnisse von RDG kultiviert 3 d (Figur 3) dargestellt. Zur molekularen Mechanismen sezieren in WD Morphogenese beteiligt sind, kann das Kulturmedium mit Inhibitoren und Aktivatoren verschiedene Signalwege gezielt ergän...
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Diskussion
Das Organkultursystem hat viele Vorteile gegenüber der traditionellen Zellkultursystem. Das System behält die ursprünglichen strukturellen Beziehungen und Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen. Es ahmt in vivo - Systemen und gibt genauere Informationen als Zellkulturstudien , bei denen die Nische Faktor fehlt. Die Verwendung von Organkultursysteme haben sogar Vorteile gegenüber das ganze Tier mit. Dazu gehören die höheren Kosten für die Nutzung des ganzen Tieres, einfache Pflege und Wartung von Organku...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir möchten, dass die Mitglieder der Gynäkologie Onkologie Gruppe für das kritische Lesen des Manuskripts danken. Diese Arbeit wird teilweise durch Mittel aus dem National Health and Medical Research Council, der Australian Research Council und der Cancer Institute NSW (PST) unterstützt. MK ist ein Empfänger von der University of Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 24-Well-Platten | Corning, USA | 3524 | können bei anderen Anbietern erworben |
| werden Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | kann von anderen Anbietern erworben werden |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 ° C Wasserbad vor Gebrauch |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Interpath, Australien | SH30034.02 | 10 % FBS im Kulturmedium |
| verwendet L-Glutamin | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034,01 | 1 % Konzentration verwendet |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1 % Konzentration verwendet |
| Whatman Nuclepore Polycarbonat Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membran (0,8 &Mikro; m) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 &Mikro; M-Konzentration verwendet |
| Paraformaldehyd (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% Lagerbestand, 4% in PBS zur Verwendung. GIFTIG - tragen Sie Handschuhe und können nicht entsorgt werden in der Spüle entsorgt |
| werden Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, machen Sie 25, 50 und 75% mit milliQ Wasser. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Sehr viskos, vorsichtig beim Dosieren |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Sehr viskos, vorsichtig beim Dosieren |
| von Di-Natriumhydrogenphosphat | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | kann bei anderen Anbietern erworben werden |
| Natriumdihydrogenphosphat | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | kann bei anderen Anbietern erworben werden |
| Natriumchlorid | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | kann bei anderen Anbietern erworben werden |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in Blocking-Puffer |
| aktiv Β Catenin | Zellsignaltechnologie USA | D13A1 | 1:200 in Blockierungspuffer |
| Phospho-Histon 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in Blockierungspuffer |
| Alexa488 Ziege Anti-Kaninchen | IgG Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in Blockierungspuffer |
| Alexa594 Ziege Anti-Ratte IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in Blockierungspuffer |
| Glycerin | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | kann von anderen Anbietern erworben werden |
| n-Propylgalate | Sigma, USA | 2370-2 | |
| -(4-amidinophenyl)-1H -indol-6-carboxamidin (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Zur Färbung von Nukleinsäuren (DNA) |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | |
| Lösungsmittel Deckgläser (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
