Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Reinigung von Legionella pneumophila (L. pneumophila) , äußere Membranvesikel (OMVs) aus Flüssigkulturen. Diese gereinigten Vesikel werden dann für die Behandlung von Makrophagen verwendet, ihre pro-inflammatorischen Potentials zu analysieren.

Zusammenfassung

Bakterien sind in der Lage, eine Vielzahl von Molekülen über verschiedene sekretorische Systeme abzusondern. Neben der Sekretion von Molekülen in den extrazellulären Raum oder direkt in eine andere Zelle können gramnegative Bakterien auch Vesikel der äußeren Membran (OMVs) bilden. Diese Membranvesikel können ihre Fracht über weite Strecken transportieren, und die Fracht wird durch Proteasen und Nukleasen vor dem Abbau geschützt.

Legionella pneumophila (L. pneumophila) ist ein intrazellulärer, gramnegativer Erreger, der eine schwere Form der Lungenentzündung verursacht. Beim Menschen infiziert es Alveolarmakrophagen, wo es den lysosomalen Abbau blockiert und eine spezialisierte Replikationsvakuole bildet. Darüber hinaus produziert L. pneumophila OMVs unter verschiedenen Wachstumsbedingungen. Um die Rolle von OMVs im Infektionsprozess menschlicher Makrophagen zu verstehen, haben wir ein Protokoll zur Reinigung von bakteriellen Membranvesikeln aus Flüssigkulturen erstellt. Das Verfahren basiert auf der differentiellen Ultrazentrifugation. Die angereicherten OMVs wurden anschließend hinsichtlich ihrer Protein- und Lipopolysaccharid-Menge (LPS) analysiert und dann für die Behandlung einer humanen monozytären Zelllinie oder von maurischen Makrophagen aus dem Knochenmark verwendet. Die proinflammatorischen Reaktionen dieser Zellen wurden mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay analysiert. Des Weiteren wurden Veränderungen in einer nachfolgenden Infektion analysiert. Zu diesem Zweck wurde die bakterielle Replikation von L. pneumophila in Makrophagen mittels koloniebildender Unit-Assays untersucht.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Aufreinigung von L. pneumophila OMVs aus Flüssigkulturen durch Ultrazentrifugation und für die nachgelagerte Analyse ihres proinflammatorischen Potenzials an Makrophagen.

Einleitung

Bakterien können sich ¹ Virulenzfaktoren über verschiedene Mechanismen absondern. Neben den bekannten sekretorischen Systemen, Gram-negative Bakterien können Informationen austauschen und Virulenzfaktoren über äußere Membranvesikel (OMVs) liefern, die klein sind, Sphäroid Vesikel 10-300 nm im Durchmesser und mit einer doppelschichtigen Membranstruktur. Sie sind in einer Vielzahl von Wachstumsumgebungen (Flüssigkultur, Festkultur und Biofilme) und in allen Wachstumsphasen ^{2, 3} sezerniert. OMVs ein wichtiges Beförderungsmittel (beispielsweise für Proteine, Adhäsine, Toxine und Enzyme sowie für LPS, die auf der Oberfläche gefunden wird OMV) ^4. Der intraluminale Ladung wird vor proteolytischem Abbau geschützt ist , so ist es möglich , über große Entfernungen zu wirken, und die Vesikel können ^{5, 6} in Körperflüssigkeiten und entfernten Organen gefunden ^werden,"xref"> ^{7, 8.} Sie können nicht nur von eukaryotischen Zellen ^{9, 10} erkannt und aufgenommen werden, sondern darüber hinaus, sie sind in der Lage , die Bindung von Bakterien und deren Invasion in Wirtszellen ⁴ zu erleichtern. Legionella pneumophila (L. pneumophila) ist ein Gram-negatives Bakterium , das OMVs freigeben kann. In der menschlichen Lunge, die er infiziert , in erster Linie Alveolarmakrophagen, obwohl seine natürliche Wirt sind Süßwasser Amöben ^11. Eine Infektion L. pneumophila kann Legionärskrankheit, eine schwere Form der Lungenentzündung ¹² verursachen. Es blockiert phagosome-Lysosomen-Fusion in der Wirtszelle. Sie akquiriert auch Host - Organellen, wodurch eine Replikation Nische, die Legionellen -haltigen Vakuole (LCV), ^{13, 14} gebildet. Lysosomalen Abbau gehemmt wird nicht nur durch die Effektor-Protein translocation über das Sekretionssystem vom Typ IV, aber auch durch die Freisetzung von OMVs ^15.

Die Reinigung von OMVs aus Bakterienkulturen erforderlich ist ihre Wirkung auf Empfängerzellen zu analysieren. Frühere Studien über den Proteingehalt von OMVs L. pneumophila fokussiert und auf den Einfluss der Vesikel auf Alveolarepithelzellen ^16, aber spätere Studien mit menschlichen Lungengewebetransplantate zeigten , daß L. pneumophila OMVs durch Alveolarmakrophagen ¹⁷ aufgenommen.

Als OMVs vorhanden pathogen-associated molecular Muster (PAMPs) und andere bakterielle Antigene, sie könnten einen Einfluss auf die Infektion eukaryontischer Zellen sind und die Immunantwort des Wirts ¹⁸ modulieren. L. pneumophila OMVs verschmelzen schnell mit Wirtszellmembranen und sie darüber hinaus aktivieren die membranöse TLR2 ^19. Wie es , dass L. pneumoph bekanntila OMVs ¹⁶ Makrophagen und Epithelzellen in einer pro-inflammatorischen Weise ^{stimulieren, 17,} analysierten wir die Auswirkungen von OMVs auf den Infektionsprozess in humanen und murinen Makrophagen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Kultivierung von L. pneumophila in flüssiger Kultur das sekretierte OMVs durch differentielle Ultrazentrifugation zu isolieren und um die Auswirkungen der Vesikel auf eukaryotischen Wirtszellen zu bewerten, die entweder direkt oder einer Infektion nach.

Protokoll

1. Bereiten Sie Medium und Agar-Platten

1. Bereiten Sie 1 l Brühe-Medium (YEB). Man löst 10 g ACES und 10 g Hefeextrakt in 900 ml destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9 mit KOH (5 N). 10 ml L-Cystein (0,4 g in 10 ml destilliertem Wasser) und 10 ml Fe (NO _{3) 3} x9H ₂ O (0,25 g in 10 ml destilliertem Wasser). Füllen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser und filtern Sie die Lösung (Porengröße: 0,22 & mgr; m) zu sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C.
2. Bereiten Sie gepufferte Kohle Hefeextrakt (BCYE) Agarplatten. Man löst 10 g ACES und 10 g Hefeextrakt in 900 ml destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9 mit KOH (5 N). Werden 15 g Agar und 2,5 g Aktivkohle. Füllen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser und Autoklaven.
   1. 10 ml L-Cystein (0,4 g in 10 ml destilliertem Wasser) und 10 ml Fe (NO _{3) 3} x9H ₂ O (0,25 g in 10 ml destilliertem Wasser, sterilisiert sowohl durch Filtration durch 0,22 um -Poren) zu kühl BCYE (ca. 50 ° C). Gießen Platten und lagern bei 4 ° C.

2. Pflegen L. pneumophila

1. Verbreiten Sie L. pneumophila - Stamm Corby (Wildtyp, WT) auf BCYE Agar - Platten und inkubieren bei 37 ° C für 3 Tage. Beimpfen von 10 ml YEB bei einer OD ₆₀₀ von 0,3 mit L. pneumophila aus der Vorkultur Platte; brüten die Bakterien bei 37 ° C auf einem rotierenden Schüttler (150 rpm) für 6 h.
2. Überprüfen Sie die Reinheit der Flüssigkeit Kultur durch auf einer Blut-Agar-Platte 100 & mgr; l der Suspension zu verbreiten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
3. Das restliche flüssige Kultur zu 90 ml frischem YEB - Medium und Inkubation auf einem rotierenden Schüttler (37 & deg ; C und 150 rpm) , um eine OD ₆₀₀ von 3,0-3,5 zu erreichen , die etwa 16-20 h erfolgt.

3. Bereiten Sie und Quantifizieren L. pneumophila OMVs

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Zentrifugationsschritts unter sterilen Bedingungen und bei 4 ° C.

1. Zentrifugieren Sie die Flüssigkultur bei 4000 × g für 20 min um die Bakterien zu pelletieren. Den Überstand an die frische Zentrifugenröhrchen, entsorgen Sie das Bakterienpellet, und wiederholen Sie die Zentrifugation (4000 × g für 20 min). Wiederholen Sie einmal diesen Schritt.
2. Sterile-Filter der verbleibende Überstand zweimal (Porengröße: 0,22 & mgr; m). Übertragen Sie die bakterienfreien Überstand zu Ultrazentrifuge Rohre und Ultrazentrifuge bei 100.000 × g für 3 h.
3. Den Überstand abgießen und entsorgen. Resuspendieren OMV Pellet in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Ultrazentrifuge (100.000 × g für 3 h) und kontaminierende Proteine ​​LPS zu entfernen.
4. Überstand verwerfen und resuspendieren OMV Pellet in 500 ul sterilem PBS. Streak 20 & mgr; l auf einer Blut-Agar-Platte und auf einer BCYE Agarplatte bakterielle Kontamination der hergestellten Vesikel auszuschließen. Inkubieren Sie die Blut-Agar-Platte über Nacht und die BCYE Agar-Platte für 3 Tage (beide bei 376; C).
5. Quantifizierung der Proteinmenge aus der OMV Präparat erhalten eine Bicinchoninsäure Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Die Konzentration von 100 ml L. pneumophila Kultur liegt normalerweise bei 1 ug / ul. Speichern Sie die vorbereitet und quantifizierten OMVs bei -20 ° C.

4. vorzubehandeln Makrophagen

1. Bereiten THP-1-Zellen.
   HINWEIS: THP-1 ist eine monozytische Zelllinie von einem Leukämiepatienten abgeleitet.
   1. Hinzufügen 2x10 ⁵ THP-1 Zellen pro 24 Vertiefungen und zu differenzieren , sie durch Zugabe von 20 nM Phorbol - 12-Myristat - 13-acetat (PMA) in Makrophagen-ähnliche Zellen. Inkubieren für 24 h bei 37 ° C.
   2. Ersetzen Sie das Medium mit 500 & mgr; l frisches Medium und Inkubation für weitere 24 h; das optimale Medium für die THP-1-Zellen besteht aus hoch RPMI 1640 Glucose mit 10% fötalem Kälberserum besteht.
2. Isolierung der Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen (mBMDM), wie beschrieben in SieheENCE 20.
3. Behandeln Sie THP-1-abgeleiteten Makrophagen oder mBMDM mit OMVs.
   1. Auftauen die OMVs hergestellt in Schritt 3 und fügen sie entsprechend ihrer Proteinmenge (0,1, 1 und 10 ug / ml) auf die menschliche oder murine Makrophagen. Inkubieren der Makrophagen mit OMVs bei 37 ° C für mindestens 20 h. Verwenden Sie den Überstand für ELISA oder bewegen Sie sich mit Schritt 5.

5. Infect die Makrophagen und Beurteilen Bakterienreplikation mit einer Kolonie bildende Einheit (CFU) Assay

1. Verwenden L. pneumophila aus Schritt 2.1 vorbehandelten THP-1 - Zellen oder mBMDM aus Schritt 4.3 und nicht Makrophagen als Kontrollen vorbehandelt (2x10 ^5/24 wells). Sie nicht das Medium austauschen.
2. Infect THP-1 - Zellen mit L. pneumophila Corby WT und mBMDM mit einem Flagellin-fehlt - Mutante von L. pneumophila Corby (beide mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,5; 1x10 ⁵ L. pneumophila / 24 wells) und Inkubation für 24 und 48 h, respectively. bereiten Sie both L. pneumophila Corby (WT oder Flagellin-fehlt - Mutante) , wie in Schritt 2.1 beschrieben.
3. Lysieren die Zellen in ihrem Medium durch Zugabe von Saponin (Endkonzentration: 0,1%) und für 5 min bei 37 ° C inkubieren.
4. Resuspendieren der Bakterien durch Pipettieren und übertragen die Suspension in ein Reaktionsgefäß. Bereiten serielle Verdünnungen der L. pneumophila -haltigen Medien in sterile PBS.
5. Streak 50 & mgr; l der erforderlichen Verdünnungen auf Agarplatten BCYE und für 3 Tage bei 37 ° C inkubieren.
6. zählen visuell die gebildeten Kolonien. Berechnen Sie die CFU Normalisieren der CFU Zählergebnis nicht vorbehandelt, aber infizierten Makrophagen, die auf 100% eingestellt werden.

Ergebnisse

Der Versuchsaufbau L. pneumophila OMVs vorzubereiten und deren Einfluss auf die pro-entzündliche Reaktion der Makrophagen zu analysieren Infektion nach ist in Abbildung 1 dargestellt. Die pro-inflammatorischen Potentials der hergestellten OMVs auf PMA-differenzierten THP-1 - Zellen analysiert werden, die in Abbildung 2 dargestellt ist. THP-1-Zellen reagieren mit einer zeit- und dosisabhängigen Anstieg von IL-8 und IL-6-Sekretion. Zusätzlich kann der Einfluss verschiedener TLR auf L. pneumophila OMV Erkennung durch Verwendung mBMDM aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen untersucht werden, wie 3 durch die CXCL1 ELISA in Abbildung dargestellt. mBMDM von WT - Mäusen sezerniert CXCL1 nach OMV Stimulation, während mBMDM TLR2 / 4 ^{- / -} abgesondert deutlich weniger. Um die Auswirkungen von L. pneumophila OMVs auf die bakterielle Replikation in THP-1 Makrophagen zu untersuchen, wurden Zellen mit OMVs vorinkubiert und dann zusätzlich infiziertmit L. pneumophila (Figur 4 A). Die Vorstimulation von THP-1-abgeleiteten Makrophagen verringert zuerst den bakteriellen Replikations nach 24 h Infektion, aber es führt zu einer Verdoppelung in CFU zu dem späteren Zeitpunkt zählen (48 h pi). Die Auswirkungen der Toll-like Rezeptor (TLR) Signalisierung auf OMV Anerkennung nach der Infektion der Makrophagen durch mBMDM beurteilt werden, wie in Abbildung 4 B dargestellt. Bakterielle Replikation erhöht sich um das Zehnfache in mBMDM von WT - Tieren nach OMV Vorinkubation, während TLR2 ^{- / -} und TRIF / MyD88 ^{- / -} Zellen nicht über diese Erhöhung der L. pneumophila - Replikation zeigen.

Abbildung 1: Versuchsdurchführung. (A) L. pneumophila Corby WT von 10 cm BCYE Agarplatten verwendet , um eine kleine Flüssigkeitskultur (10 ml) zu beimpfen, die in 90 ml frischem YEB übertragen wirdMedium nach 6 h. Ein kleines Volumen wird auch auf einem Blut-Agarplatte für Reinheit zu prüfen. Bakterien werden bei 37 ° C bis zur frühen stationären Phase (OD ₆₀₀ = 3,0-3,5) inkubiert. (B) Die Flüssigkultur wird zentrifugiert und steril filtriert , um die Bakterien zu entfernen. Die Legionellen -freie Überstand wird dann ultrazentrifugiert eine OMV - Pellet zu erhalten, die in PBS resuspendiert und wieder ultrazentrifugiert. Die isolierten Vesikel werden resuspendiert, auf Reinheit überprüft und für die Proteinmenge quantifiziert. Der Maßstab entspricht 2,5 cm. (C) humane oder murine Makrophagen werden mit den quantifizierten OMVs stimuliert. Der Zellkulturüberstand für ELISA verwendet werden, oder Makrophagen mit L. pneumophila infizierten werden bakterielle Replikation durch CFU - Assay auf 10-cm BCYE Agarplatten zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Pro-inflammatorischen Aktivierung von THP-1 - Zellen von L. pneumophila OMVs. (A) Hierbei ist der monozytären THP-1 - Zelllinie wird als Modell für Alveolarmakrophagen verwendet. PMA-differenzierten THP-1 - Zellen wurden mit steigenden Dosen von L. pneumophila OMVs (0,01-25 ug / ml) für 24 und 48 h behandelt, respectively. Der zellfreie Überstand wurde auf IL-8 ELISA verwendet. Die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten ± SEM gezeigt. THP-1 - Zellen reagierten auf so wenig wie 0,01 ug / ml L. pneumophila OMVs mit signifikanten IL-8 - Sekretion, die zeit- und dosisabhängig war. (B) L. pneumophila OMVs (0,1-10 ug / ml) wurden verwendet , PMA-differenzierten THP-1 - Zellen zu stimulieren. Der Überstand wurde nach 24 und 48 Stunden Inkubation gesammelt, und das freigesetzte IL-6 wurde im Überstand mittels ELISA gemessen. Die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten ± SEM gezeigt. THP-1-Zellen sezerniert signifikante Mengen an IL-6, auch bei der niedrigsten Dosis von OMVs (0,1 ug / ml). Die Sekretion von IL-6 erhöhte sich mit zunehmender OMV Dosen und mit längerer Inkubationszeiten. Statistik: Mann-Whitney-Test; * P <0,05 und ** p <0,01 im Vergleich zu der entsprechenden 0 & mgr; g / mL OMV. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz 20. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Das proinflammatorische Aktivierung von Makrophagen hängt von TLR2 / 4. mBMDM von WT und TLR2 / 4 ^{- / -} Mäuse wurden mit L. pneumophila OMVs inkubiert (0,1 oder 1 & mgr; g / ml). CXCL1 Sekretion wurde nach 24 und 48 h durch ELISA analysiert, respectively. DasMittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt. mBMDM von WT - Mäusen reagierten mit einer dosisabhängigen CXCL1 Sekretion nach L. pneumophila OMV Inkubation. TLR2 / 4 ^{- / -} mBMDM deutlich weniger CXCL1 abgesondert im Vergleich zu WT mBMDM, und das Sekret nicht erhöhen dosisabhängig. Statistik: Mann-Whitney-Test; * P <0,05 im Vergleich zu der entsprechenden 0 & mgr; g / mL OMV; #P <0,05 im Vergleich zu einer gleich WT Probe behandelt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz 20. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: L. pneumophila OMV Vorinkubation erhöht bakterielle Replikation in Makrophagen. (A) Differentiated THP-1 - Zellen wurden mit OMVs vorinkubiert (0,1, 1 oder 10 μ; G / ml) oder LPS / IFN-γ (200 ng / ml für die Kontrolle each) oder wurden unbehandelt gelassen. Nach der Vorinkubation (20 h) wurden THP-1 - Zellen mit L. pneumophila Corby wt (MOI 0,5) für 2, 24 und 48 h infiziert sind. THP-1-Zellen wurden durch die Zugabe von Saponin lysiert und die Bakterien wurden auf BCYE Agarplatten plattiert. KBE wurden nach jedem Zeitpunkt, bezogen auf 0 ug / ml OMV berechnet. Die Balken stellen die Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten, die jeweils in technischen Duplikaten durchgeführt. Es gab keine Unterschiede in Bakterienaufnahme (2 h nach der Infektion (pi)) im Vergleich zu nicht vorbehandelten Zellen. Veränderungen in bakteriellen Replikations wurden nach 24 und 48 h bestimmt, respectively. LPS / IFN-γ vorbehandelten THP-1 - Zellen zeigten eine Reduktion in pi bakterielle Belastung 24 h auch dosisabhängig von L. pneumophila OMV vorbehandelten Zellen beobachtet Dies wurde. Zu dem späteren Zeitpunkt (48 h pi), OMV vorbehandelten THP-1 - Zellen zeigte eine Verdoppelung in L. pneumophila redung, während LPS / IFN-γ vorbehandelten Makrophagen zeigte eine weitere Verringerung der Bakterienlast. Statistik: Mann-Whitney-Test; * P <0,05 und ** p <0,01 im Vergleich zu der entsprechenden 0 & mgr; g / mL OMV. (B) mBMDM von Mäusen mit verschiedenen genetischen Hintergründen (WT, TLR2 ^{- / -} und das TRIF / MyD88 ^{- / -)} wurden mit 0,1 & mgr; g / mL L. pneumophila OMVs für 20 h vorinkubiert und wurden dann mit einem flagellin- infiziert defiziente Mutante von L. pneumophila Corby (MOI 0,5) für 48 h. mBMDM wurden durch die Zugabe von Saponin lysiert und die Legionellen wurden auf BCYE Agarplatten plattiert. Die CFU wurden relativ berechnet auf 0 & mgr; g / mL OMV, durch die durchgezogene Linie angedeutet. Die Balken stellen die Mittelwerte ±± SEM von drei unabhängigen Experimenten, die jeweils in Duplikaten durchgeführt. mBMDM von WT - Mäusen zeigten einen Anstieg der L. pneumophila Replikation nach OMV Vorbehandlung. TLR2 ^{- / -} Makrophagen zeigten signifikant reduziert - / - mBMDM. Statistik: Mann-Whitney-Test; p <0,05 im Vergleich zur wt-Probe. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz 20. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Die OMVs von bakteriellen Krankheitserregern und die Auswirkungen dieser Membranbläschen auf ihre Zielzellen derzeit intensiv untersucht. Zum Beispiel perfringens Clostridium abgeleitetes OMVs Zytokinsekretion in Makrophagen induzieren, können B - Lymphozyten durch OMVs von Borrelia burgdorferi aktiviert werden, und Helicobacter pylori -released Membranvesikel auf Magenepithelzellen ²¹ wirken ^{kann, 22, 23.} L. pneumophila, ein intrazellulärer Erreger , die eine schwere Form der atypischen Lungenentzündung auslösen kann, gibt auch OMVs die in der Lage sind zu Lungenepithelzellen und Makrophagen ^{16, 19} aktivieren. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Klein Isolierung von L. pneumophila OMVs aus Flüssigkultur , die potentielle Rolle von OMVs bei Pneumonie zu studieren. Es ist wichtig, unter sterilen condit arbeitenIonen und Verunreinigungen von anderen Bakterien , um auszuschließen , ein reines L. pneumophila - abgeleitetes OMV - Zubereitung zu erhalten. Die Isolierung von OMVs umfaßt einen Filtrationsschritt durch 0,22 & mgr; m-Poren, um die Verunreinigung des erhaltenen OMV Pellet mit L. pneumophila zu verhindern, obwohl dies die OMV Ausbeute reduziert, da die größten OMVs von diesem Filtrationsschritt verloren gehen.

Weiterhin testeten wir die Reaktion von humanen und murinen Makrophagen zu diesen isoliert Vesikeln und infizierten Zellen mit L. pneumophila zu enger die Situation in Legionellen Pneumonie approximieren, wobei OMVs durch extrazelluläre Bakterien innerhalb des LCV ¹⁵ freigesetzt werden. Die verwendeten OMV Dosen wurden in einer in vitro - Infektion von humanen Makrophagen nach 24 h Inkubation (beschrieben in Referenz 20) nach dem freien OMV Menge geschätzt. Zur Stimulation der anderen Empfängerzellen oder in vivo Experimenten,andere OMV Dosen erforderlich sein und müssen festgelegt werden. Die Analyse der Wirkung von L. pneumophila OMVs stellt eine Weiterentwicklung des Protokolls durch Jager und Steinert ²⁴ beschrieben.

Hier PMA-differenzierten THP-1-Zellen als Modell für die Alveolarmakrophagen aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von primären humanen Material dienen. Die Zugabe von PMA unterscheidet die monozytische THP-1 - Zellen in Makrophagen-ähnliche Zellen ^25. Darüber hinaus sind sie ein bekanntes Modell - Zelllinie für L. pneumophila ²⁶ Studien. Neben dieser humanen monozytären Zelllinie werden mBMDM Zellen verwendet. mBMDM sind weit verbreitet für die Untersuchung der Wirkungen von L. pneumophila ^{27, 28, 29} angenommen. Die Möglichkeit der Verwendung von genetischen Vorprägungen für verschiedene TLRs oder andere Proteine ​​machen sie ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der OMV-Effekte. in order die Menge von Mäusen pro Experiment zu senken, mBMDM anstelle von Alveolarmakrophagen aufgrund der Einschränkungen der Makrophagen verwendet. Schlüsselexperimente könnten Alveolarmakrophagen zur Validierung erfordern.

Neben dem hier beschriebenen Protokoll Ultrazentrifugation OMVs zu reinigen, ist es möglich , eine Dichtegradientenzentrifugation durchzuführen, die in dem Protokoll , das von Chutkan et al enthalten ist. ^30. Dies könnte auch die Reinheit des erhaltenen OMV Herstellung zu verbessern und die Menge an co-gereinigten Proteinaggregate, Flagellin und LPS reduzieren. Die Reinheit des erhaltenen OMV Zubereitung kann durch Transmissionselektronenmikroskopie oder durch Nanopartikel Verfolgungsanalyse als Ergänzungsschritt in der Qualitätskontrolle ausgewertet werden. Dies kann ein zusätzliches Mittel zur Quantifizierung liefern, über die Proteinmessverfahren vorgestellt. Gegebenenfalls können die LPS-Konzentration von einem Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test analysiert. Wenn die OMV Ausbeute gering ist, einzusätzliche Konzentrationsschritt über zentrifugale Filter könnten durchgeführt werden, die hier nicht geschehen ist. Wenn die Ausbeute war niedriger als erwartet, wurden die OMVs verworfen.

Im Rahmen der laufenden Bemühungen um die biologischen Mechanismen und Funktionen hinter OMVs, der Einfluss verschiedener Stressbedingungen auf OMV Produktion getestet werden konnte aufzuklären. Nährstoffmangel, Veränderungen der Inkubationstemperatur oder Exposition gegenüber schädlichen Substanzen könnten einen Einfluss auf OMV Sekretion ³¹ haben. Mögliche Stressbedingungen sind im Protokoll von Klimentova und Stulik ³² diskutiert. Außerdem könnte Hyper- oder hypovesiculating L. pneumophila - Mutanten erzeugt werden. Die verschiedenen Präparationen OMV könnte dann mit Makrophagen, humanen Lungengewebe - Explantaten (beschrieben in Referenz 17) oder auch in in vivo - Modellen in Infektionsexperimenten untersucht werden. Neben der Rolle von OMVs in angeborenen Immun-Signalisierung, ihren Einfluss in der bakteriellen Kommunikationkann experimentell adressiert werden. Weiterhin ist die Wirkung der verschiedenen angeborenen Immunsignalkaskaden könnte durch die Verwendung von Maus-Knockout-Zellen oder die Erzeugung von CRISPR / Cas9 Vorprägungen in menschlichen Zelllinien analysiert werden. Diese Grundlagenforschung in OMVs wird in die Entwicklung neuer Impfstrategien zu unterstützen, die ³³ von Neisseria meningitidis übertragen für Meningitis B bereits vorhanden sind .

Ausgehend von dem Protokoll über die OMV Isolierung und Charakterisierung kann man dies auf andere gramnegative Bakterien anzuwenden und zu anderen Wirtszellen; es braucht nur auf das Wachstum der Bakterien in Flüssigkultur angepasst werden. Das Protokoll von Chutkan et al. detaillierte Informationen auf der Erzeugung von OMVs aus Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa ^30. Die Kultur sollte nicht die späten stationären Phase erreichen, um Erhöhungen der lysierten Bakterien und verunreinigende Proteine ​​und mem zu vermeidenbranes. Darüber hinaus muss die OMV Dosis zur Stimulation der Wirtszellen nach der Menge der OMVs vorhanden während der in vivo - Infektionen bestimmt werden, während immer noch eine niedrige Cytotoxizität zu gewährleisten. Auf diese Weise wird die pathologische Rolle von OMVs, deren Auswirkungen auf die Interspezies-Kommunikation und Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht werden konnte.

Um die Rolle von L. pneumophila OMVs bei Pneumonie, standardisierte OMV Präparate mit ausreichenden Ausbeuten und vergleichbare Infektionsversuchen untersuchen benötigt. Dieses Protokoll hilft Isolierungsverfahren zu standardisieren und OMV Studien auf andere Gram-negative Bakterien und anderen Wirtszellen zu verlängern. Darüber hinaus wird die Forschung in vitro Wissen aus der detaillierten profitieren, die verwendet werden können Experimente in vivo - Einstellungen zu verlängern. In Zukunft könnte dieses Protokoll zur Isolierung von OMVs aus primären biologischen Material, wie etwa Serum oder bronchoalveoläre lav verlängert werdenAlter Flüssigkeit, Einblick in die Zusammensetzung von OMVs unter physiologischen Bedingungen freigesetzt zu gewinnen. Dies wird helfen , Schlüsselparameter der OMV - Zusammensetzung zu bestimmen , und die Eigenschaften des in vitro -generated OMVs zu verstehen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm	Petrischale Sarstedt AG & Co KG (Nümbrecht, Deutschland)	82.1473
70 Ti Rotor	Beckman Coulter Incorporation (Kalifornien, USA)	337922
ACES	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	9138.2
Aktivkohle	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	X865.2
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	5210.2
Columbia-Agar mit 5 % Schafsblut	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Deutschland	)254005
Küvetten	Sarstedt AG & Co KG (Nümbrecht, Deutschland)	67.742
ELISA (Mensch)	BD OptEIA&Handel;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Deutschland)	IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murin)	DuoSet, R& D (Minneapolis, USA)	CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	5632.1
Fötales Kälberserum (FCS)	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Deutschland)	10270-106
Heracell 240i CO2 Inkubator	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)	75004515
Impfschlaufe	Sarstedt AG & Co KG (Nümbrecht, Deutschland)	86.1567.010
KOH	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	6751.1
L. pneumophila Corby	---	---	freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Antje Flieger (RKI, Berlin, Deutschland)
L. pneumophila Corby & Delta; flaA	---	---	mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlin, Deutschland)
L-cystein	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)
mBMDM		---	freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland) und Prof. Dr. Carsten Kirschning (Universität Duisburg Essen, Essen, Deutschland)
PBS	Biochrom GmbH (Berlin, Deutschland)	L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland)	P8139-1MG
rotierender Schüttler (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)	SHKE6000
RPMI 1640 high glucose	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Deutschland)	11875-093
saponin	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, England)	80-2116-30
Sterilfilter (Porengröße: 0,22 µ m)	Corning Incorporated (New York, USA)	431096
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)
Hefeextrakt	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	2363.2
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Deutschland BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)	23225