Hier beschreiben wir die Reinigung von Legionella pneumophila (L. pneumophila) , äußere Membranvesikel (OMVs) aus Flüssigkulturen. Diese gereinigten Vesikel werden dann für die Behandlung von Makrophagen verwendet, ihre pro-inflammatorischen Potentials zu analysieren.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
Bakterien können sich 1 Virulenzfaktoren über verschiedene Mechanismen absondern. Neben den bekannten sekretorischen Systemen, Gram-negative Bakterien können Informationen austauschen und Virulenzfaktoren über äußere Membranvesikel (OMVs) liefern, die klein sind, Sphäroid Vesikel 10-300 nm im Durchmesser und mit einer doppelschichtigen Membranstruktur. Sie sind in einer Vielzahl von Wachstumsumgebungen (Flüssigkultur, Festkultur und Biofilme) und in allen Wachstumsphasen 2, 3 sezerniert. OMVs ein wichtiges Beförderungsmittel (beispielsweise für Proteine, Adhäsine, Toxine und Enzyme sowie für LPS, die auf der Oberfläche gefunden wird OMV) 4. Der intraluminale Ladung wird vor proteolytischem Abbau geschützt ist , so ist es möglich , über große Entfernungen zu wirken, und die Vesikel können 5, 6 in Körperflüssigkeiten und entfernten Organen gefunden werden,"xref"> 7, 8. Sie können nicht nur von eukaryotischen Zellen 9, 10 erkannt und aufgenommen werden, sondern darüber hinaus, sie sind in der Lage , die Bindung von Bakterien und deren Invasion in Wirtszellen 4 zu erleichtern. Legionella pneumophila (L. pneumophila) ist ein Gram-negatives Bakterium , das OMVs freigeben kann. In der menschlichen Lunge, die er infiziert , in erster Linie Alveolarmakrophagen, obwohl seine natürliche Wirt sind Süßwasser Amöben 11. Eine Infektion L. pneumophila kann Legionärskrankheit, eine schwere Form der Lungenentzündung 12 verursachen. Es blockiert phagosome-Lysosomen-Fusion in der Wirtszelle. Sie akquiriert auch Host – Organellen, wodurch eine Replikation Nische, die Legionellen -haltigen Vakuole (LCV), 13, 14 gebildet. Lysosomalen Abbau gehemmt wird nicht nur durch die Effektor-Protein translocation über das Sekretionssystem vom Typ IV, aber auch durch die Freisetzung von OMVs 15.
Die Reinigung von OMVs aus Bakterienkulturen erforderlich ist ihre Wirkung auf Empfängerzellen zu analysieren. Frühere Studien über den Proteingehalt von OMVs L. pneumophila fokussiert und auf den Einfluss der Vesikel auf Alveolarepithelzellen 16, aber spätere Studien mit menschlichen Lungengewebetransplantate zeigten , daß L. pneumophila OMVs durch Alveolarmakrophagen 17 aufgenommen.
Als OMVs vorhanden pathogen-associated molecular Muster (PAMPs) und andere bakterielle Antigene, sie könnten einen Einfluss auf die Infektion eukaryontischer Zellen sind und die Immunantwort des Wirts 18 modulieren. L. pneumophila OMVs verschmelzen schnell mit Wirtszellmembranen und sie darüber hinaus aktivieren die membranöse TLR2 19. Wie es , dass L. pneumoph bekanntila OMVs 16 Makrophagen und Epithelzellen in einer pro-inflammatorischen Weise stimulieren, 17, analysierten wir die Auswirkungen von OMVs auf den Infektionsprozess in humanen und murinen Makrophagen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Kultivierung von L. pneumophila in flüssiger Kultur das sekretierte OMVs durch differentielle Ultrazentrifugation zu isolieren und um die Auswirkungen der Vesikel auf eukaryotischen Wirtszellen zu bewerten, die entweder direkt oder einer Infektion nach.
Die OMVs von bakteriellen Krankheitserregern und die Auswirkungen dieser Membranbläschen auf ihre Zielzellen derzeit intensiv untersucht. Zum Beispiel perfringens Clostridium abgeleitetes OMVs Zytokinsekretion in Makrophagen induzieren, können B – Lymphozyten durch OMVs von Borrelia burgdorferi aktiviert werden, und Helicobacter pylori -released Membranvesikel auf Magenepithelzellen 21 wirken kann, 22, 23. L. pneumophila, ein intrazellulärer Erreger , die eine schwere Form der atypischen Lungenentzündung auslösen kann, gibt auch OMVs die in der Lage sind zu Lungenepithelzellen und Makrophagen 16, 19 aktivieren. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Klein Isolierung von L. pneumophila OMVs aus Flüssigkultur , die potentielle Rolle von OMVs bei Pneumonie zu studieren. Es ist wichtig, unter sterilen condit arbeitenIonen und Verunreinigungen von anderen Bakterien , um auszuschließen , ein reines L. pneumophila – abgeleitetes OMV – Zubereitung zu erhalten. Die Isolierung von OMVs umfaßt einen Filtrationsschritt durch 0,22 & mgr; m-Poren, um die Verunreinigung des erhaltenen OMV Pellet mit L. pneumophila zu verhindern, obwohl dies die OMV Ausbeute reduziert, da die größten OMVs von diesem Filtrationsschritt verloren gehen.
Weiterhin testeten wir die Reaktion von humanen und murinen Makrophagen zu diesen isoliert Vesikeln und infizierten Zellen mit L. pneumophila zu enger die Situation in Legionellen Pneumonie approximieren, wobei OMVs durch extrazelluläre Bakterien innerhalb des LCV 15 freigesetzt werden. Die verwendeten OMV Dosen wurden in einer in vitro – Infektion von humanen Makrophagen nach 24 h Inkubation (beschrieben in Referenz 20) nach dem freien OMV Menge geschätzt. Zur Stimulation der anderen Empfängerzellen oder in vivo Experimenten,andere OMV Dosen erforderlich sein und müssen festgelegt werden. Die Analyse der Wirkung von L. pneumophila OMVs stellt eine Weiterentwicklung des Protokolls durch Jager und Steinert 24 beschrieben.
Hier PMA-differenzierten THP-1-Zellen als Modell für die Alveolarmakrophagen aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von primären humanen Material dienen. Die Zugabe von PMA unterscheidet die monozytische THP-1 – Zellen in Makrophagen-ähnliche Zellen 25. Darüber hinaus sind sie ein bekanntes Modell – Zelllinie für L. pneumophila 26 Studien. Neben dieser humanen monozytären Zelllinie werden mBMDM Zellen verwendet. mBMDM sind weit verbreitet für die Untersuchung der Wirkungen von L. pneumophila 27, 28, 29 angenommen. Die Möglichkeit der Verwendung von genetischen Vorprägungen für verschiedene TLRs oder andere Proteine machen sie ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der OMV-Effekte. in order die Menge von Mäusen pro Experiment zu senken, mBMDM anstelle von Alveolarmakrophagen aufgrund der Einschränkungen der Makrophagen verwendet. Schlüsselexperimente könnten Alveolarmakrophagen zur Validierung erfordern.
Neben dem hier beschriebenen Protokoll Ultrazentrifugation OMVs zu reinigen, ist es möglich , eine Dichtegradientenzentrifugation durchzuführen, die in dem Protokoll , das von Chutkan et al enthalten ist. 30. Dies könnte auch die Reinheit des erhaltenen OMV Herstellung zu verbessern und die Menge an co-gereinigten Proteinaggregate, Flagellin und LPS reduzieren. Die Reinheit des erhaltenen OMV Zubereitung kann durch Transmissionselektronenmikroskopie oder durch Nanopartikel Verfolgungsanalyse als Ergänzungsschritt in der Qualitätskontrolle ausgewertet werden. Dies kann ein zusätzliches Mittel zur Quantifizierung liefern, über die Proteinmessverfahren vorgestellt. Gegebenenfalls können die LPS-Konzentration von einem Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test analysiert. Wenn die OMV Ausbeute gering ist, einzusätzliche Konzentrationsschritt über zentrifugale Filter könnten durchgeführt werden, die hier nicht geschehen ist. Wenn die Ausbeute war niedriger als erwartet, wurden die OMVs verworfen.
Im Rahmen der laufenden Bemühungen um die biologischen Mechanismen und Funktionen hinter OMVs, der Einfluss verschiedener Stressbedingungen auf OMV Produktion getestet werden konnte aufzuklären. Nährstoffmangel, Veränderungen der Inkubationstemperatur oder Exposition gegenüber schädlichen Substanzen könnten einen Einfluss auf OMV Sekretion 31 haben. Mögliche Stressbedingungen sind im Protokoll von Klimentova und Stulik 32 diskutiert. Außerdem könnte Hyper- oder hypovesiculating L. pneumophila – Mutanten erzeugt werden. Die verschiedenen Präparationen OMV könnte dann mit Makrophagen, humanen Lungengewebe – Explantaten (beschrieben in Referenz 17) oder auch in in vivo – Modellen in Infektionsexperimenten untersucht werden. Neben der Rolle von OMVs in angeborenen Immun-Signalisierung, ihren Einfluss in der bakteriellen Kommunikationkann experimentell adressiert werden. Weiterhin ist die Wirkung der verschiedenen angeborenen Immunsignalkaskaden könnte durch die Verwendung von Maus-Knockout-Zellen oder die Erzeugung von CRISPR / Cas9 Vorprägungen in menschlichen Zelllinien analysiert werden. Diese Grundlagenforschung in OMVs wird in die Entwicklung neuer Impfstrategien zu unterstützen, die 33 von Neisseria meningitidis übertragen für Meningitis B bereits vorhanden sind .
Ausgehend von dem Protokoll über die OMV Isolierung und Charakterisierung kann man dies auf andere gramnegative Bakterien anzuwenden und zu anderen Wirtszellen; es braucht nur auf das Wachstum der Bakterien in Flüssigkultur angepasst werden. Das Protokoll von Chutkan et al. detaillierte Informationen auf der Erzeugung von OMVs aus Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa 30. Die Kultur sollte nicht die späten stationären Phase erreichen, um Erhöhungen der lysierten Bakterien und verunreinigende Proteine und mem zu vermeidenbranes. Darüber hinaus muss die OMV Dosis zur Stimulation der Wirtszellen nach der Menge der OMVs vorhanden während der in vivo – Infektionen bestimmt werden, während immer noch eine niedrige Cytotoxizität zu gewährleisten. Auf diese Weise wird die pathologische Rolle von OMVs, deren Auswirkungen auf die Interspezies-Kommunikation und Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht werden konnte.
Um die Rolle von L. pneumophila OMVs bei Pneumonie, standardisierte OMV Präparate mit ausreichenden Ausbeuten und vergleichbare Infektionsversuchen untersuchen benötigt. Dieses Protokoll hilft Isolierungsverfahren zu standardisieren und OMV Studien auf andere Gram-negative Bakterien und anderen Wirtszellen zu verlängern. Darüber hinaus wird die Forschung in vitro Wissen aus der detaillierten profitieren, die verwendet werden können Experimente in vivo – Einstellungen zu verlängern. In Zukunft könnte dieses Protokoll zur Isolierung von OMVs aus primären biologischen Material, wie etwa Serum oder bronchoalveoläre lav verlängert werdenAlter Flüssigkeit, Einblick in die Zusammensetzung von OMVs unter physiologischen Bedingungen freigesetzt zu gewinnen. Dies wird helfen , Schlüsselparameter der OMV – Zusammensetzung zu bestimmen , und die Eigenschaften des in vitro -generated OMVs zu verstehen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Prof. Dr. Markus Schnare für uns mit TLR2 Bereitstellung – / – und TLR2 / 4 – / – Mäuse und Prof. Dr. Carsten Kirschning für TRIF / MyD88 – / – Mäusen. (: – FKZ 0316175B, e bio miRSys: e Med CAPSYS – FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/) Teile dieser Arbeit von Bundesministerium für Bildung und Forschung gefördert wurde, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) und Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics – FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), alle BS.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |