Diese Studie beschreibt Methoden für die T7-vermittelte Co-Expression von mehreren Genen aus einem einzigen Plasmid in Escherichia coli unter Verwendung des pMGX-Plasmidsystems.
Methodenartikel
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Diese Studie beschreibt Methoden für die T7-vermittelte Co-Expression von mehreren Genen aus einem einzigen Plasmid in Escherichia coli unter Verwendung des pMGX-Plasmidsystems.
Die Co-Expression mehrerer Proteine ist für die synthetische Biologie immer wichtiger, studiert Protein-Protein-Komplexe und charakterisiert und nutzt Biosynthesewege. In diesem Manuskript wird die Verwendung eines hochwirksamen Systems für die Konstruktion von multigenen synthetischen Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase beschrieben. Dieses System erlaubt es, dass viele Gene gleichzeitig aus einem Plasmid exprimiert werden. Hier ist ein Satz von vier verwandten Vektoren, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K und pMGX-hisK, entweder mit dem Ampicillin- oder Kanamycin-resistente Marker (A und K) und entweder mit einem N-terminalen Hexahistidin oder einem N-terminalen Hexahistidin Tag (seine) werden offenbart. Detaillierte Protokolle für die Konstruktion von synthetischen Operen, die dieses Vektorsystem verwenden, werden zusammen mit den entsprechenden Daten bereitgestellt, was zeigt, dass ein pMGX-basiertes System, das fünf Gene enthält, leicht konstruiert und verwendet werden kann, um alle fünf codierten Proteine in Escherichia coli zu produzieren . Dieses systEm und Protokoll ermöglicht es Forschern, routinemäßig komplexe Mehrkomponentenmodule und Wege in E. coli auszudrücken.
Die Koexpression mehrerer Proteine ist zunehmend von wesentlicher Bedeutung, vor allem in synthetischen Biologieanwendungen, bei denen mehrere Funktionsmodule ausgedrückt werden müssen 1 ; Bei der Untersuchung von Protein-Protein-Komplexen, wo Expression und Funktion oft Co-Expression 2 , 3 erfordern; Und bei der Charakterisierung und Nutzung von Biosynthesewegen, wo jedes Gen im Weg ausgedrückt werden muss 4 , 5 , 6 , 7 , 8
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1. Erhalten von Genen von Interesse
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In dieser Studie war es das Ziel, fünf Proteine aus einem einzigen Plasmid zu exprimieren. Die Fünf-Codon-optimierten synthetischen Genfragmente, die entweder N- oder C-terminale Hexahistidin-Markierungen codieren, wurden kommerziell gekauft. Die synthetischen Gene wurden durch PCR amplifiziert und einzeln in einen PCR-stumpfen Vektor kloniert und sequenziert. Um das polycistronische Plasmid zu erzeugen, wurden die fünf interessierenden Gene zuerst in ein geeignetes pMGX-Plasmid pMGX-A.......
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Die Koexpression mehrerer Gene ist immer wichtiger, insbesondere bei der Charakterisierung und Rekonstitution komplexer, multigener Stoffwechselwege 3 , 4 , 5 . Das pMGX-System macht die Multigene-Koexpression in der E. coli- Routine 6 , 7 , 8 und ist für verschiedene Forscher zugänglich. In dieser Studie wurden fünf Proteine .......
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Diese Arbeit wurde vom Naturwissenschaften und Ingenieurforschungsrat von Kanada unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Enzymes | |||
| Alkalische Phosphatase, Kälberdarm (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | Neu England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA-Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Unternehmen | <>Katalognummer< | strong>Kommentare |
| Reagenzien1 kb DNA-Leiter | |||
| New England Biolabs | N3232L | ||
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemisch komeptente Zellen | Comeptente Zelle, die im eigenen Haus hergestellt | ||
| wurde B-PER Extraktionsreagenz für bakterielle Proteine | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP-Mix | Agilent Technologies | Lieferung mit Polymerase-Gel-Extraktionskit | |
| Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gelextraktion, geliefert von VWR Cat 3: CA101318-972 | |
| Glycin | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antikörper [HRP], mAb, Maus | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemilumineszierend HRP Substrat | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurisiertes Instant-Magermilchpulver | Lokales Lebensmittelgeschäft | No-Name-Milch aus dem Lebensmittelgeschäft ist ausreichend | |
| Nitrozellulosemembran | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membran PT 0,45 &; Mikro; m 200 mm x 4 m, geliefert von VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, geliefert von VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Anfrage vom Boddy Lab Kontakt cboddy@uottawa.ca | |
| Primer | Integrierte DNA-Technologien | Entwerfen Sie Primer nach Bedarf für das gewünschte Gen | |
| Synthetische Gene | Life Technologies | Design und Optimierung nach Bedarf | |
| : Thick-Blot-Filterpapier | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris-Basis | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemisch kompetente Zellen Kompetente Zelle | die im Haus hergestellt | ||
| Name | Firma | Katalognummer | <>Kommentare |
| Ausrüstung | |||
| BioSpektrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gelbox - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophorese |
| Cell Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Inkubator-Backofen | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Inkubator-Schüttler | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Rasierer | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR Deutschland | M-10E,6W | |
| Thermocycler | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, geliefert von Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Wasserbad | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatur | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Zelle |
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