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Ökotoxikologische Methode mit Meeresbakterien

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DOI:

10.3791/55211

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26. Mai 2017

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1Institute for Environmental Protection and Research (ISPRA), Rome (Italy), 2Department of Biology, Tor Vergata University, Rome (Italy), 3Department of Biology and Evolution of Marine Organisms, Stazione Zoologica, Anton Dohrn, Naples (Italy)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein neues Protokoll zur Bewertung der Ökotoxizität von Schadstoffen, einschließlich auftauchender Verunreinigungen wie Nanomaterialien, unter Verwendung des marinen Bakteriums Vibrio anguillarum . Diese Methode ermöglicht die Bestimmung der LC 50 oder der Mortalität, die Konzentration, die eine 50% ige Abnahme der Bakterien-Kulturfähigkeit verursacht, nach einer 6-stündigen Exposition.

Zusammenfassung

Bakterien sind ein wichtiger Bestandteil des Ökosystems, und mikrobielle Gemeinschaftsveränderungen können einen signifikanten Einfluss auf biogeochemische Rad- und Nahrungsmittelbahnen haben. Toxizitäts-Tests auf der Grundlage von Mikroorganismen sind weit verbreitet, weil sie relativ schnell, reproduzierbar, billig und sind nicht mit ethischen Fragen verbunden. Hier beschreiben wir eine ökotoxikologische Methode zur Bewertung der biologischen Reaktion des marinen Bakteriums Vibrio anguillarum. Diese Methode beurteilt die akute Toxizität von chemischen Verbindungen, einschließlich neuer Verunreinigungen wie Nanopartikel, sowie Umweltproben. Der Endpunkt ist die Verringerung der bakteriellen Kultivierbarkeit ( dh die Fähigkeit zur Replikation und Bildung von Kolonien) aufgrund der Exposition gegenüber einem Giftstoff. Diese Reduktion kann allgemein als Mortalität bezeichnet werden. Der Test ermöglicht die Bestimmung der LC 50 , die Konzentration, die eine 50% ige Abnahme der Bakterien, die aktiv replizieren und bilden Kolonien, nachEine 6 h Belichtung. Die kultivierbaren Bakterien werden in koloniebildenden Einheiten (CFU) gezählt, und die "Mortalität" wird ausgewertet und mit der Kontrolle verglichen. In dieser Arbeit wurde die Toxizität von Kupfersulfat (CuSO 4 ) ausgewertet. Eine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung wurde mit einem mittleren LC 50 von 1,13 mg / l nach drei unabhängigen Tests beobachtet. Dieses Protokoll, verglichen mit bestehenden Methoden mit Mikroorganismen, ist in einem breiteren Spektrum von Salzgehalt anwendbar und hat keine Beschränkungen für farbige / trübe Proben. Es verwendet Kochsalzlösung als Belichtungsmedium, wodurch mögliche Interferenzen von Wachstumsmedium mit den untersuchten Verunreinigungen vermieden werden. Die LC 50- Berechnung erleichtert Vergleiche mit anderen Bioassays, die üblicherweise auf ökotoxikologische Untersuchungen der Meeresumwelt angewendet werden.

Einleitung

Ökotoxikologische Bioassays bewerten die Toxizität von Chemikalien oder Umweltproben mit biologischen Standardmodellen und integrieren die Auswirkungen von physikalischen, chemischen und biologischen Stressoren auf Ökosysteme. Aufgrund der Komplexität der Ökosysteme müssen ökotoxikologische Risikobewertungen eine Batterie von Bioassays betrachten, die Organismen aus verschiedenen trophischen Ebenen einbeziehen. Toxizitäts-Assays an Labortieren können teuer, zeitaufwendig und ethisch fragwürdig sein. Der Antrieb zur Begrenzung der Tierversuche und zur Entwicklung alternativer Ansätze ( z. B. bei Bakterien und Nicht-Wirbeltieren) ist heute ein zentrales Thema, wie im Rahmen der aktuellen europäischen Gesetzgebung, einschließlich der EU-Tierschutzrichtlinie, die 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie und REACH.

Krebstiere, Fische und Algen werden weitgehend für Toxizitätsmessungen in der Meeresumwelt verwendet 1 . Bakterien sind eine wichtige KomponenteT des Ökosystems, und Veränderungen an mikrobiellen Gemeinschaften können erhebliche Auswirkungen auf biogeochemische Radfahren und andere kritische Ökosystemleistungen haben. Toxizitätstests, die auf Mikroorganismen basieren, gewinnen an Popularität, weil sie relativ schnell, reproduzierbar und billig sind und keine ethischen Fragen aufwerfen 2 . Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein ökotoxikologisches Protokoll zu beschreiben, um die Reaktion des marinen Bakteriums Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) zu bewerten, wenn es Umweltverschmutzungen ausgesetzt ist.

V. anguillarum ist ein Gram- negatives , kurzes, kurvenförmiges Stabbakterium (0,5 x 1,5 μm) mit einem polaren Flagellum. Typisch in Brack- oder Salzwasser gefunden, ist es halotolerant, mit einem optimalen Salzgehalt von etwa 20 und einer optimalen Temperatur zwischen 25 und 30 ° C 3 . Es wurde als Organismus-Modell aufgrund seiner Allgegenwart und seiner wichtigen ökologischen Rollen in oce gewähltAns weltweit 4 . Einige Serotypen von V. anguillarum sind bekannt, um Vibriose in einer Vielzahl von marinen oder brackigen Fischarten 5 , 6 zu verursachen. Dazu benötigen einige Schritte des Experiments Standard-mikrobiologische Praktiken, aber es sind keine besonderen Sicherheitsausrüstungen oder Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Das vorgeschlagene Toxizitätstestprotokoll verwendet die bakterielle Kultivierbarkeit ( dh die Fähigkeit zur Replikation und Bildung von Kolonien) als Endpunkt und ermöglicht die Bestimmung des LC 50 , die Konzentration, die eine 50% ige Reduktion von Bakterien, die aktiv replizieren und Kolonien bilden, nachher verursacht Eine 6-h-Belichtung. In Vibrio , wie bei anderen Mikroben, kann diese Reduktion, die wir allgemein als Mortalität bezeichnen, teilweise auf Personen in der lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren (VBNC) Phase 7 zurückzuführen sein. In dieser Studie haben wir diese Methode zur Messung der toxischen Effekte von Kupfersulfat (CuSO 4), Ein Referenz-toxikant.

Diese Methode wurde entwickelt, um einen geeigneten, auf Mikroorganismen basierenden Test für die ökotoxische Beurteilung von Schadstoffen / chemischen Verbindungen, einschließlich aufkommender Verunreinigungen wie Nanomaterialien, bereitzustellen. Die Neuheit dieses Protokolls im Vergleich zu bestehenden Methoden, die für Mikroorganismen verwendet werden, bezieht sich hauptsächlich auf das Expositionsmedium und den Endpunkt. Tatsächlich wird die Belichtung in Kochsalzlösung durchgeführt, wobei jegliche mögliche Interferenz des Wachstumsmediums mit den untersuchten Verunreinigungen vermieden wird, die die biologische Antwort beeinflussen können 8 . Der Endpunkt ist die Verringerung der bakteriellen Kultivierbarkeit, die leicht mit anderen akuten Endpunkten verglichen werden kann, die für das ökotoxikologische Screening in marinen / brackigen Umgebungen verwendet werden, basierend auf Überleben / Mortalität. Darüber hinaus verwendet das Protokoll die Technik der Flüssig-zu-Platte-Mikrozählungen, die bereits auf E. coli 9 verwendet wurden, wodurch die Volumina und damit die experimentellen Effekte reduziert werdenOrt (siehe Schritte 3.3 und 3.4 des Protokolls für Details).

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien / Materialien

  1. Vorbereiten (ca. 300) sterile 1,5 mL Röhrchen für die serielle Verdünnung von Bakteriensuspensionen sowie 15 mL Sterilröhrchen als Testbehälter, die mit den Testkonzentrationen markiert sind.
  2. 2% NaCl-Lösung als Belichtungsmedium zubereiten und sterilisieren. Alternativ verwenden Sie sterilisiertes synthetisches oder natürliches Meerwasser mit einem Salzgehalt von 5 bis 40.
  3. Bereiten Sie das Tryptic-Soja-Agar (TSA) -Wachstumsmedium mit 2% NaCl gemäß den Marker-Richtungen und unter Berücksichtigung der bereits vorhandenen NaCl-Menge vor.
  4. Gießen Sie die TSA (kühl, aber immer noch flüssig) in die 90-mm-Petrischalen, die zuvor mit der Testkonzentration und der Expositionszeit, der Replikatzahl und dem Verdünnungsfaktor markiert wurden. 19 mL ist ein passendes Volumen.
  5. Bereiten Sie Tryptic Soy Brühe (TSB) Wachstumsmedium gemäß den Etikettenrichtlinien vor. Fügen Sie die geeignete Menge an NaCl hinzu, um den gleichen Salzgehalt wie das Expositionsmedium zu erhalten.
  6. BereitenEine CuSO 4 -Stammlösung mit doppelt destilliertem Wasser und sterilisieren das (notwendige) Aliquot mit einem 0,22 μm Spritzenfilter. Im Falle von Umgebungsproben ein geeignetes Intervall von Verdünnungen der Probe vorbereiten und mit einem 0,22 μm Spritzenfilter sterilisieren.
  7. Bereiten Sie die Testlösungen in den 15-ml-Röhrchen vor, die mit den Testkonzentrationen markiert sind. Füllen Sie die Negativkontrolle mit 5 ml des Expositionsmediums (2% NaCl). Füllen Sie die anderen Röhrchen mit der entsprechenden Menge an Belichtungsmedium und CuSO 4 Stammlösung, um die Testkonzentrationen in einem 5 mL Endvolumen zu erhalten.

2. Bakterien-Inokulum-Präparation

  1. 12-18 h vor dem Test, bereiten eine flüssige frische Kultur von Vibrio anguillarum vor . Mit einer sterilen Schleife wählen Sie eine einzelne, gut isolierte Kolonie aus einer Übernachtkultur auf einem festen Medium (TSA). Inokulieren Sie ein Röhrchen, das mit 10 ml TSB gefüllt ist, und inkubieren Sie die Bakterienkultur bei 25 ° C für 12-18 h. Nach 12-18 h schätzen Sie die Bakterienkonzentration des Inokulums spektrophotometrisch ab. Vortex der Inokulum und Messung der optischen Dichte bei 600-nm-Wellenlänge, mit TSB als Blindwert.
  2. Um eine bekannte Bakterienkonzentration zu erhalten, verdünnen Sie 2 ml des verwirbelten Inokulums durch Zugabe der nach dieser Formel berechneten TSB-Menge:
    TSB mL = [(OD / 0,14) * 2] - 2.
  3. Vergewissern Sie sich, dass die optische Dichte des verdünnten Inokulums 0,140 (± 0,005) beträgt, was dem 0,5-Punkt des McFarland-nephelometrischen Standards entspricht.
  4. Das verdünnte Inokulum 10 min bei 3000 g zentrifugieren Den Überstand beseitigen und das mikrobielle Pellet in 1 ml 2% iger NaCl-Lösung (Belichtungsmedium) wieder suspendieren.

3. Prüfung der Exposition

  1. Füge 150 μl des wieder suspendierten Bakterien-Inokulums zu jedem Röhrchen hinzu, einschließlich der Kontrolle. Inkubieren Sie die V. anguillarum Suspensionen für 6 h bei 25 ° C unter Dunkelheit und in kontinuierlichSchütteln, um Sedimentation zu vermeiden.
  2. Am Anfang (T 0 ) und dem Ende (T 6 ) der Belichtungszeit die Bakterienzählung in allen exponierten Bakteriensuspensionen unter Verwendung von Koloniebildungseinheit (CFU) -Zählverfahren durchführen.
  3. Bereiten Sie serielle Verdünnungen jeder exponierten Bakteriensuspension in dreifacher Ausfertigung vor, wobei ein zehnfacher Verdünnungsfaktor (bis zu 10 -5 ) angewendet wird. Fügen Sie 100 μl jeder Bakteriensuspension dem entsprechenden Röhrchen hinzu, das bereits mit 900 μl Expositionsmedium (2% NaCl) gefüllt ist. Mit der Serienverdünnung fortschreiten, bei jedem Schritt vortexen, um die Bakterien wieder zu suspendieren.
  4. Plättchen 10 μl der 10 -4 und 10 -5 Verdünnungen auf TSA Petrischalen im entsprechenden Segment. Lassen Sie die Tropfen schnell in einem kleinen Kreis gleiten, indem Sie die Platte drehen. Inkubieren Sie die Platten bei 25 ° C für 48 h.

4. CFU Zählen

  1. Nach 48 h zählen die auf den Petrischalen angebauten Kolonien; Platten mit bZwischen 5 und 50 Kolonien sind optimal für eine genaue Zählung.
  2. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien pro ml jeder exponierten Bakteriensuspension durch Anwendung der folgenden Formeln:
    10 -4 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 10.000
    10 -5 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 100.000
  3. Verwenden Sie den Durchschnitt der Zählungen, die in parallelen Replikaten erhalten wurden, um die Mortalität im Vergleich zur Kontrolle zu bewerten. Berechnen Sie die Sterblichkeit als Prozentsatz mit der folgenden Formel:
    M% = 100 - [(N / C) * 100]
    HINWEIS: Wenn N = Anzahl der nach der Exposition gegenüber dem Giftstoff gezüchteten CFU / ml ist; C = Anzahl der im Kontrollmedium gewachsenen CFU
  4. Berechnen Sie die LC 50 ( dh die Konzentration des Toxizans, die die Anzahl der aktiv replizierenden Bakterien um 50% pro ml, CFU / ml) mit nichtlinearer Regressionsanalyse unter Verwendung einer geeigneten statistischen Software reduziert (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie eine Einweganalyse der Varianz (ANOVA) FollGeschuldet durch post-hoc paarweise testen Tests, um signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen zu bewerten.

Ergebnisse

Die Ergebnisse von drei unabhängigen Versuchen , V. anguillarum auf vier Konzentrationen von CuSO 4 zu zeigen, zeigen eine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung und eine signifikante Abnahme der Bakterien, die aktiv Kolonien mit einer zunehmenden Konzentration des Referenz-Toxizers replizieren und bilden, ( Fig. 1 , ANOVA, F. = 20,28, p & lt; 0,001). Die Anzahl der CFU / mL wird bei 1,25 mg / l (post-hoc Tukey-Test, p <0,05) gegenüber der Kontrolle (CNTR) deutlich reduziert. Alle kultivierbaren Bakterien wurden bei der höchsten getesteten Konzentration nachgewiesen. Es wurden keine Unterschiede in der CuSO & sub4 ; -Toxizität entlang des breiten Salzgehaltsbereichs des Belichtungsmediums ( dh 5, 20 oder 35 g / l NaCl, Daten nicht gezeigt) gefunden. Eine repräsentative Ausgabe der statistischen Analyse, die die nichtlineare Regression zeigt, wird in der ergänzenden Abbildung 1 angegeben . Die für die drei unabhängigen Versuche berechneten LC 50- Werte ( Tabelle 1) markieren die Machbarkeit und Reproduzierbarkeit dieser Methode.

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Abbildung 1: Vibrio anguillarum , das CuSO 4 ausgesetzt ist . Die mittlere Anzahl an CFU / ml (CFU = Kolonie bildende Einheit), die einer spezifischen Konzentration von CuSO 4 für 6 h ausgesetzt war. Die Werte repräsentieren den Mittelwert (± SD) von drei unabhängigen Versuchen. Die Reduktionen von Bakterien, die die Korrekturen (CNTR) aktiv replizieren und bilden, werden in den gelben Kästchen (in Prozent) angegeben. Signifikante Unterschiede mit der Kontrolle, basierend auf einem post-hoc Tukey-Test, sind mit Sternchen (* = p <0,05; ** = p <0,01) angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Tabelle 1: Letal-Konzentration (LC 50 ) -Werte für Vibrio anguillarum , die CuSO 4 ausgesetzt sind. Ergebnisse von drei unabhängigen Studien und Mitteln (± SD) werden berichtet.


Ergänzend Abbildung 1: Nichtlineare Regressionsanalyse Repräsentative Ausgabe einer nichtlinearen Regressionsanalyse (Logit-Hill-Modell), die an den Ergebnissen des Tests durchgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.

Diskussion

Diese Arbeit beschreibt einen neuen Bioassay mit dem marinen Bakterium V. anguillarum , das erfolgreich angewendet wurde, um die toxischen Effekte von CuSO 4 , einem Referenz-Toxicant, zu beurteilen, was eine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung zeigt. Das marine Bakterium V. anguillarum wurde als Modellorganismus gewählt, weil es halotolerant, allgegenwärtig und repräsentativ für marine Ökosysteme ist.

Der Test kann in einem breiten Spektrum von Salzgehalt (5-40) durchgeführt werden und kann Kochsalzlösungen und synthetische oder natürliche Seewasser als Belichtungsmedium verwenden, solange Mikroorganismen für die Dauer des gesamten Tests leicht überleben können. Dies ermöglicht die Analyse von verschiedenen Arten von Proben, einschließlich Brack-und Marine-Umgebungen.

Während der Expositionsphase ist kein Wachstumsmedium erforderlich, wodurch die Beeinträchtigung der Verunreinigungen 8 und deren Einfluss auf die biologische Reaktion vermieden wird. ThE-Protokoll ist zuverlässig, schnell, kostengünstig und relativ einfach. Das Verfahren der Flüssig-zu-Platten-Mikrozählungen 9 bietet den Vorteil, kleine (Proben-) Volumina zu verwenden, obwohl dies eine hohe Genauigkeit und Robustheit impliziert. Die Ergebnisse der drei unabhängigen Versuche und Replikate für jede Behandlung zeigen die hohe Wiederholbarkeit dieser Methode. Die Verwendung von Bakterien als biologisches Modell sowie die Anpassungsfähigkeit der Technik begünstigen die ökologische und ökologische Relevanz dieses Verfahrens. Andere kritische technische Fragen sind die Genauigkeit bei der Herstellung des Bakterien-Inokulums und die Sterilität, die in einigen Schritten des Verfahrens erforderlich ist.

Der vorgeschlagene Test ist schneller (6 h) als andere marine ökotoxikologische Assays (24-96 h) und erhöht nicht die ethischen Probleme, die sich aus der Verwendung höherer Organismen ergeben. Darüber hinaus zeigen die Daten über die Referenz-Toxizität LC 50- Werte vergleichbar mit denen, die mit akuten t erhalten werden Auf anderen marinen Arten 10 , 11 , was eine gute Sensibilität zeigt. Unter den bakteriellen Bioassays ist der V. fischeri- Lumineszenz-Inhibitionstest der häufigste und gut standardisierte 12 . Dieser Bioassay ist sehr schnell (15-30 min) und gilt für die Prüfung von Festphasenproben, kann aber durch farbige und trübe Proben beeinflusst werden, die die Lumineszenzmessungen beeinträchtigen. Salinität ist ein limitierender Faktor bei der Verwendung des oben genannten Tests mit 2% NaCl erforderlich 13 . Im Gegenteil , der hier mit V. anguillarum vorgeschlagene Test liefert bei einer breiten Palette von Salzgehaltswerten erschwingliche Ergebnisse, hat keine Einschränkungen hinsichtlich trüben oder farbigen Proben und erfordert im Vergleich zu den Lumineszenzanalysatoren weniger teure Geräte. Ein Vergleich zwischen den Ergebnissen unserer Studie und den in der Literatur für V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 zeigt vergleichbare EC 50 -Werte, die die Wirksamkeit dieses Bioassays weiter unterstützen.

Dieser Bioassay beurteilt die Verringerung der bakteriellen Kultivierbarkeit, die im Allgemeinen als Mortalität bezeichnet wird, anstelle der Populationswachstumsrate oder der enzymatischen Aktivitätshemmung, die in den derzeit für Mikroorganismen verfügbaren Tests verwendet werden. Die LC 50 -Kalkulation ermöglicht den Vergleich mit anderen Bioassays, die üblicherweise auf die ökotoxikologische Bewertung von marinen Umgebungen angewendet werden, die oft überleben oder die Sterblichkeit als Endpunkt haben. Eine Interkalibrierungsübung ist dringend notwendig, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit dieses Tests zu bewerten / zu bestätigen und seine Standardisierung und Anwendung in regulatorischen Protokollen zu unterstützen.

Der zunehmende Einsatz von Nanomaterialien und deren potenzielle Freisetzung in der Umwelt implizieren die Notwendigkeit einer Risikobewertung 17 . Jedoch, clasSikuläre (öko) toxikologische Ansätze für diese aufkommenden Verunreinigungen scheinen keine erschwinglichen Ergebnisse zu geben und können einige Anpassungen erfordern. Die Eigenschaften dieses neuen Bioassays erlauben seine einfache und nützliche Anwendung auf die Toxizitätsbewertung von Nanopartikeln. Tatsächlich wird die Möglichkeit, den Assay bei verschiedenen Salinitäten durchzuführen, Konten des Nanopartikelverhaltens unter verschiedenen Ionenstärken liefern, eine Umgebungsparametervariable, die die Toxizität signifikant beeinflussen kann 19 . Darüber hinaus wird bei der Ökotoxizität von Nanopartikeln kein Einsatz von Wachstumsmedium und Nährstoffen empfohlen, da organische Substanzen ihre Absorption durch Erhöhung der toxischen Effekte 20 erleichtern oder Aggregation verursachen können, wodurch die bioverfügbare Fraktion und damit ihre Toxizität reduziert werden.

Abschließend ist der Bioassay auf Vibrio anguillarum apRoming-Tool für die Risikobewertung von klassischen und aufkommenden Schadstoffen sowie für die Beurteilung des Status von marinen und brackigen Umgebungen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Forschungsprojekt finanziert: "NanoBioTech ambiente e salute" Progetto 2: Ambiente. "Nano-BioTechnologie: Umwelt und Gesundheit Projekt 2: Umwelt, Werkzeuge und Methoden für ökotoxikologische Überwachung von Nanopartikeln " ), die der LM aus der Region Lazio-Consorzio Hypatia gewährt wurden. AR wurde von einem Postdoktorandenstipendium der Universität von Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia im Rahmen des zuvor zitierten Projekts finanziert. Eine Vereinbarung mit der ISPRA-Tor Vergata Universität (N. 2015/52857) erlaubte die gegenseitige Nutzung von Einrichtungen und den Austausch von Forschern.

Die Autoren sind an Prof. Maria Cristina Thaller, unserem Schutzengel für alle mikrobiellen Aktivitäten, für das Interesse an der mikrobiellen Welt und für die Unterstützung unserer Forschung zu diesem Thema verpflichtet. Die Autoren bestätigen Andrea Tornambè und Eri dankbarKa Magaletti für die kostbare Zusammenarbeit mit dem ISPRA Lab der Phytoplankton Ökologie und Ökotoxikologie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vibrio anguillarum (Stamm AL 102, Serotyp O1)Gewonnen aus der Laborsammlung von NOIFMA (Norwegen)
Tryptischer Soja-Agar Liofilchem610052dehydrierte Nährmedien
Tryptische Sojabrühe WachstumsmediumLiofilchem610053dehydrierte Nährmedien
CuSO4· 5H2OSigma-Aldrich209198
NaCl Sigma-AldrichS-3014
Name des Geräts<>Unternehmen<strong>KatalognummerKommentare/Beschreibung
Biosicherheits-Laminar-Flow-Haube ESCO
Inkubator 2100
Name der SoftwareUnternehmenKatalognummerKommentare/Beschreibung
Benchmark Dose Software US EPABenchmark Dosis 2.4.0 2012

Referenzen

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