Summary
Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.
Abstract
De menselijke navelstreng (UC) en placenta zijn niet-invasieve, primitief en overvloedige bronnen van mesenchymale stromale cellen (MSC's), die in toenemende mate aandacht gekregen, omdat ze geen ethische of morele bezwaren opleveren. Huidige werkwijzen om MSC te isoleren van UC op lage hoeveelheden cellen met variabele proliferatie potentieel. Aangezien UC is een anatomisch-complex orgaan kunnen verschillen in MSC eigenschappen als gevolg van de verschillen in de anatomische gebieden van de isolatie. In deze studie hebben we eerst ontleed het snoer / placenta monsters in drie afzonderlijke anatomische gebieden: UC, cord-junctie placenta (CPJ) en foetale placenta (FP). Ten tweede, twee afzonderlijke zones, koord bekleding (CL) en Wharton's gelei (WJ), werden gescheiden. De explantaatkweek techniek werd vervolgens gebruikt om cellen van de vier bronnen te isoleren. De tijd vereist voor de primaire kweek van cellen van de explantaten gevarieerd afhankelijk van de bron van het weefsel. Uitgroei van de cellen zich binnen 3-4 days van de CPJ explantaten, terwijl groei werd waargenomen na 7 - 14 dagen respectievelijk CL / WJ en FP explantaten, - 10 dagen en 11. De geïsoleerde cellen werden hechtende kunststof en weergegeven fibroblastoïde morfologie en oppervlaktemerkers, zoals CD29, CD44, CD73, CD90 en CD105, vergelijkbaar met beenmerg (BM) afgeleide MSCs. Echter, de kolonievormende efficiëntie van de cellen varieerde met CPJ-MSC's en WJ-MSC's die hogere efficiëntie dan BM-MSC's. MSC's uit alle vier bronnen onderscheiden in adipogenic, chondrogene en osteogene geslachten, wat aangeeft dat ze multipotente. CPJ-MSC's gedifferentieerde efficiënter in vergelijking met andere MSC bronnen. Deze resultaten suggereren dat de CPJ de meest potente anatomische gebied en een hoger aantal cellen, met een grotere proliferatie en zelfvernieuwing vermogen in vitro oplevert. Concluderend, de vergelijkende analyse van de MSC's uit de vier bronnen aangegeven dat CPJ is een veelbelovende bron van MSC voor celtherapie, regenerative geneeskunde en tissue engineering.
Introduction
Stamcellen zijn aanwezig in verschillende organen en weefsels van het lichaam. Ze bezitten regeneratieve potentieel en spelen een belangrijke rol bij het herstel van beschadigde weefsels in het lichaam gedurende de overspanning van het menselijk leven 1, 2. Dit heeft vooral omdat gegenereerd veel belangstelling voor volwassen stamcellen (ASC), in tegenstelling tot embryonale stamcellen (SER), heeft het gebruik van ASC niet morele en ethische dilemma's opleveren. Verschillende studies hebben de isolatie van ASC, zoals mesenchymale stromale cellen (MSC's) gemeld; hematopoietische stamcellen (HSCs); en andere voorlopers, waaronder diverse volwassen bronnen variërend van beenmerg (BM) naar vetweefsel (AT) en pulpa 3, 4, 5. Echter, het aantal ASC aanwezig in de meeste van de volwassen niches is beperkt, en hun isolement gaat over het algemeen een invasieve en pijnlijke procedure met mogelijke donorplaats morbiditeit. Daarnaast zouden donor leeftijd en de belasting van het milieu ook een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de kwaliteit en de biologische activiteit van de geïsoleerde cellen 6, 7, 8. ASC ook beperkte proliferatie en differentiatie mogelijk weer te geven tijdens de cultuur in vitro.
Om deze nadelen van de huidige ASC overwinnen zijn nieuwe bronnen nagestreefd om stamcellen te isoleren. Deze pogingen hebben geleid tot de isolatie van stamcellen uit perinatale bronnen, waaronder navelstrengbloed, navelstrengweefsel, placenta en vruchtwater 9. Deze bronnen hebben opgedaan aandacht vanwege hun gemakkelijke en overvloedige beschikbaarheid van 10, 11, 12, 13. Bovendien kan perinatale weefsels worden verkregen niet-invasief en stamcellen afkomstig van henprimitiever dan ASC geïsoleerd uit volwassen bronnen 14, 15. Zij worden geïsoleerd uit de weefsels verkregen bij de geboorte en worden geacht minimale wijzigingen te hebben ondergaan in het genoom door veroudering milieuverontreinigingen 16.
Echter, de gerapporteerde eigenschappen van stamcellen van perinatale bronnen en hun potentieel om te hernieuwen en om onderscheid te lopen sterk uiteen 11, 17. Dit kan gedeeltelijk te wijten aan het feit dat de menselijke navelstreng (UC) is een complex orgaan. Onze hypothese is dat de discrete gebieden van perinatale weefsel creëren specifieke niches verantwoordelijk voor variaties en meer primitieve aard van deze stamcellen in vergelijking met ASC afgeleid van niet-perinatale bronnen. Deze studie beschrijft de ontleding van streng / placenta monsters in drie afzonderlijke anatomische gebieden: UC, cord-junctie placenta (CPJ), eend foetale placenta (FP). De UC verder ontleed in twee zones: koord lining (CL) en Wharton's gelei (WJ). Analyse van de geïsoleerde cellen uit CL, WJ, CPJ, en FP aangetoond dat ze allemaal tentoongesteld fibroblastoïde morfologie en uitgedrukt MSC markers, maar ze verschilden in hun zelf-vernieuwing en differentiatie potentieel. CPJ-afgeleide cellen vertoonden een hoger percentage van proliferatie en zelfvernieuwing potentie in vergelijking met UC-en FP-afgeleide cellen, waardoor ze een veelbelovende bron voor celtherapie, regeneratieve geneeskunde en tissue engineering.
Protocol
Monsters (n = 3) werden verkregen van het toestemmen, gezonde donoren door de Beaumont Hospital BioBank, Royal Oak, MI en de Providence Hospital, Southfield, MI onder HIC- (HIC # 2012-101) en IRB- (IRB # 820662- 3) respectievelijk goedgekeurde protocollen en verwerkt zoals goedgekeurd door de IBC (# 2858) van Oakland University, Rochester, MI.
1. Processing menselijke navelstreng, placenta-Koord Junction en foetale placenta en isoleren Cellen
- Aseptisch verzamelen monsters van UC ongeveer 10 cm lang, zoals 5-6 cm met het CPJ en 3-4 cm van FP. Onmiddellijk plaatsen elk monster in een opvangbeker bevattend medium (DMEM met 4500 mg / ml glucose en antibiotische oplossing (0,1% gentamycine, 0,2% streptomycine en 0,12% penicilline)) en bewaar bij 4 ° C totdat het wordt getransporteerd naar het lab van te plaatsen op ijs in een piepschuim doos. Verwerk het monster bij 4 ° C binnen 2-4 uur verzameld.
- Plaats het monster in een 150 mm petrischaal bleefijs in een bioveiligheid kast. Behulp van een naald en spuit, spoel het meerdere keren met ijskoude PBS om bloedstolsels te verwijderen. Zorg ervoor dat het monster wordt nat met PBS tijdens de verwerking gehouden en niet laten drogen. Om de steriliteit te behouden, hanteren het monster aseptisch met behulp van een autoclaaf PBS en chirurgische instrumenten in heel monster verwerking.
- Zorgvuldig onderzoek van het monster op verschillende anatomische gebieden te identificeren: UC, CPJ, en FP. ontleden Eerst de UC. Houd het foetale einde van de UC met een tang en zorgvuldig maken de eerste snede net aan de bovenkant van de CPJ met behulp van een schaar. Maak de tweede snede onder de CPJ de CPJ scheiden (1,5-2,0 cm) vanaf de FP. Plaats de gescheiden UC, CPJ, en FP in afzonderlijke Petrischalen voor verdere verwerking.
- Snijd de UC lengterichting met behulp van schaar en pincet, volledig blootstellen van de bloedvaten en de omliggende WJ zonder het epitheel te storen.
- Schraap de WJ uit de buurt van de bloedvaten en innerlijke epitheel van de subamnionmet behulp van een scalpel en verwijder de bloedvaten. Zorg ervoor dat alle resterende perivasculaire WJ verzamelen onder en rond de bloedvaten, en leg de verzamelde WJ in een aparte petrischaal.
- Verzamel de resterende weefsel, koord bekleding (CL), in een afzonderlijke petrischaal.
- Na scheiding van de weefsels die CL, WJ, CPJ en FP, vervangen PBS met 3-5 ml trypsine oplossing en commerciële knippen afzonderlijk elk van de weefsels in 1 tot 2 mm gesneden met een schaar.
- Incubeer de stukjes weefsel commerciële trypsine-oplossing bij 37 ° C gedurende 30 min in een 5% CO2 incubator partiële digestie van de monsters. Observeert de partiële digestie door visualiseren afgifte van cellen met behulp van een fasecontrastmicroscoop.
- Het gedeeltelijk gedigereerde monsters, voeg een gelijk volume cultuurmedium (CM; DMEM met 4500 mg / ml glucose en 2 mM L-glutamine, aangevuld met 10% humaan serum / FBS en antibiotica-oplossing (0,1% gentamycine, 0,2% streptomycine en 0,12% penicillin)) aan de commerciële trypsine-oplossing te neutraliseren. Breng de inhoud in 50-ml centrifugebuizen en laat het gedeeltelijk gedigereerde weefselstukjes genoegen 3 min.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans, waaronder enkele cellen (en niet efficiënt uitbreiden), en de plaat 15-20 partieel gedigereerd weefsel stukken op een 75 cm2 weefselkweekfles en voeg 9 ml CM. Incubeer bij 37 ° C en niet storen de cultuur kolven gedurende 2-3 dagen mogelijk te maken voor de hechting van stukken weefsel.
Opmerking: Het resterende gedeelte van het gedeeltelijk gedigereerde weefselmonsters kan gecryopreserveerd voor de toekomst isoleren van cellen. - Na 3 dagen incubatie, wijzigt u de CM en kijk voor de verschijning van uitgroei van cellen uit het explantaat op een dagelijkse basis; celgroei moeten blijken uit de hechtende explantaten na 3-4 dagen, 7-10 dagen en 11-14 dagen incubatie CPJ, CL / WJ en FP resp. Vanaf dit punt, wijzigt u de CM na elke 3 dagen of zonodig.
LET OP: De celgroei bereikt 70% samenvloeiing 7-10 dagen na de eerste cel uitgroei van het explantaat. Merk op dat niet-aanhangende weefsels stukken geen aanleiding geven tot cel uitgroei zal geven, totdat zij zich aan het plastic. Wees voorzichtig dat de fles niet wordt verstoord om het losmaken van de hechtende stukken weefsel te vermijden. Als er sprake is van drijvende stukken na de eerste 3 dagen van kweken, kunnen zij worden gered door ze over te zetten naar een nieuwe fles voor bevestiging.
OPMERKING: Wanneer de celgroei uit het weefsel explantaten 70% samenvloeiing bereikt, moeten ze worden in subcultuur. Zoals hierboven vermeld, MSC CL / WJ, FP, CPJ en confluentie bereiken 10-14 dagen 14-20 dagen, en 17-24 dagen, respectievelijk. - Om ontgroeid cellen subcultuur van de explantaten, dissociëren de cellen met 1-2 ml trypsine oplossing commerciële / 75 cm2 kweekfles en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min. Neutraliseren met 1-2 ml CM en centrifugeer 1500 xg gedurende 3 min. Makendat aan de kolf roteren terwijl het toevoegen van trypsine nog heel verspreiden.
- OPMERKING: De gepelleteerde cellen worden beschouwd passage 0 (P0) en in CM geschorst, geteld, en doorgekweekt op een seeding dichtheid van 1 x 10 4 / cm2 gedurende amplificatie, karakterisering en cryopreservatie. Overmaat cellen kan worden gecryopreserveerd bij P0.
2. Karakterisering van de geïsoleerde cellen
- Kolonievormende efficiëntie (CFE) test
- Coat de 100 mm petrischalen (oppervlak 60 cm2) met 0,1% gelatine gedurende 30 minuten en plaats ze in de CO2 incubator bij 37 ° C.
OPMERKING: Hoewel het niet noodzakelijk, gelatine-coating verbetert de cel therapietrouw. - Het overtollige gelatine en zaden de beklede plaat met P0 cellen bij een concentratie van 1.63 cellen / cm2. Voeg 3 ml CM en incubeer in de CO2 incubator bij 37 ° C.
- Bewaken van de gezaaide platen voor klonale groeidoor het licht microscopie (LM) en verander het medium om de 3 dagen.
- Na 10-14 dagen van celgroei, was de petrischalen tweemaal met PBS en vast de cellen in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
OPMERKING: Paraformaldehyde is giftig. Oefen voorzichtig door het dragen van handschoenen en een bril tijdens het gebruik. - Vlekken op de gefixeerde cellen met 0,1% kristalviolet gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel de plaat met kraanwater tot de ongebonden blauwe vlek verdwenen.
- Tel het aantal kolonies bestaat uit ten minste 50 cellen met behulp LM.
- Coat de 100 mm petrischalen (oppervlak 60 cm2) met 0,1% gelatine gedurende 30 minuten en plaats ze in de CO2 incubator bij 37 ° C.
- Expressie van celoppervlak markers
- Cultuur van de geïsoleerde cellen tot 70% confluentie, dissociëren de handel trypsine oplossing en wassen en pellet door centrifugering bij 1500 g gedurende 3 minuten. Suspendeer de cellen in FACS-buffer (1x PBS met 2% FBS en 0,1% natriumazide).
NB: Natriumazide is giftig. Oefen voorzichtig door het dragen van handschoenen en een bril tijdens het gebruik.
- Cultuur van de geïsoleerde cellen tot 70% confluentie, dissociëren de handel trypsine oplossing en wassen en pellet door centrifugering bij 1500 g gedurende 3 minuten. Suspendeer de cellen in FACS-buffer (1x PBS met 2% FBS en 0,1% natriumazide).
- Centrifugeer de gekleurde cellen bij 670 g gedurende 5 minuten, zuig de supernatant en resuspendeer de cellen in 500 ui FACS-buffer.
- Analyseer de antilichaam gekleurde cellen middels FACS volgens het protocol van de fabrikant.
3. Differentiatie Potentiële
- adipogene differentiatie
- Cultuur van de geïsoleerde cellen tot 70% confluentie, dissociëren de handel trypsine oplossing en wassen en pellet door centrifugering bij 1500 g gedurende 3 minuten.
- In een CO2 incubator bij 37 ° C, de cellen te kweken bij een concentratie van 100.000 cellen / putje van een 6-wells plaat die 2 ml CM.
- Na 24 uur werd vervangen door CM adipogENIC differentiatie medium (0,5 uM isobutyl-methylxanthine, 1 uM dexamethason, insuline 10 uM en 200 uM indomethacine) en incubeer. Verander de differentiatie medium om de 3 dagen of zo vaak als nodig is.
- Na 3 weken incubatie vast de cellen met 2 ml 4% paraformaldehyde per putje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en kleuring met Oil Red O voor de productie van vetdruppels te detecteren om te analyseren voor adipogene differentiatie.
OPMERKING: Paraformaldehyde is giftig. Oefen voorzichtig door het dragen van handschoenen en een bril tijdens het gebruik. - Behandel de cellen gefixeerd met 60% isopropanol (2 ml / putje van 6-putjes plaat) gedurende 5 minuten.
- Vervang isopropanol met 2 ml Oil Red O kleurstof (filter 3 delen Oil Red O vlek en 2 delen gedestilleerd water), incubeer gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur en was 3-4 maal met leidingwater om alle ongebonden wegdoen .
- Visualiseren rood gekleurde lipidedruppels, indicatief voor adipogene cellijn, uzingen LM.
- chondrogene differentiatie
- geïsoleerd kweekcellen tot 70% confluentie, dissociëren de handel trypsine oplossing en was met PBS.
- Cellen chondrogene inductie centrifuge 250.000 cellen in een 15 ml centrifugebuis met 2 ml CM pellet bij 11.000 xg gedurende 8 minuten. Incubeer de pellets overnacht bij 37 ° C.
- Na 24 uur voorzichtig vervangen door CM chondrogene differentiatie medium (20 ng TGFB1, 10 ng insuline, 100 nM dexamethason en 100 uM ascorbinezuur) zonder de pellet te verstoren en voortzetting van de incubatie. Verander de differentiatie medium om de 3 dagen of zo vaak als nodig is.
- Na 3 weken incubatie vast de cellen met 2 ml 4% paraformaldehyde per putje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Cryosectie en kleuring met 1% toluidine blauw aan de aanwezigheid of de productie van extracellulaire matrix om chondrogene differentiatie bepalen onderzocht.
LET OP: Paraformaldehyde is giftig. Oefen voorzichtig door het dragen van handschoenen en een bril tijdens het gebruik. - Voor cryosectioning, voorzichtig te wassen de geoogste celpellets tweemaal met PBS en bevestig met 1 ml 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
OPMERKING: Paraformaldehyde is giftig. Oefen voorzichtig door het dragen van handschoenen en oogbescherming tijdens het gebruik. - Was de pellets tweemaal met PBS om verwijdering van het paraformaldehyde en over in een sucrose / oktober-oplossing (1: 2, 20% sucrose: oktober). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 24 uur om de oplossing volledig te sijpelen in de celpellets; dit zal glad coupes mogelijk te maken.
- Breng de pellets in de oktober vormen. Bevries de schimmels bij -20 ° C gedurende 4-6 uur en cryosection ongeveer 10-12 micron dikke secties van de celpellets met behulp van een cryostaat voor toluidine blauwkleuring.
- Was de cryosecties voorzichtig met PBS; voeg enkele druppels 1% toluidine blauwkleuring, die de pellet secties in de slede volledig; en meerderUbate gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de dia's met PBS meerdere keren Destain. Overtollige kleuring door dompelen in de slede HCl-gebaseerde alcoholoplossing (95% alcohol + 0,5 ml HCl) meerdere keren totdat het ongebonden blauwe kleur is verdwenen. Monteer de gekleurde coupes met behulp van 100 ul van montage oplossing voor de lange termijn bewaring van de dia's.
OPMERKING: De blauwe kleuren van de secties duidt op de aanwezigheid van glycosaminoglycanen en glycoproteïnen en zal waarneembaar zijn met behulp van LM.
- osteogene differentiatie
- Opnieuw kweek de geïsoleerde cellen tot 70% confluentie, dissociëren de handel trypsine oplossing en wassen en pellet door centrifugering bij 1500 g gedurende 3 minuten.
- Subcultuur de cellen bij een concentratie van 100.000 cellen / putje van 6-putjes platen bevattende 2 ml CM in een CO2 incubator bij 37 ° C.
- Na 24 uur werd vervangen door CM osteogene differentiatie medium (0,1 μ, M dexamethason, 10 uM β-glycerofosfaat en 50 uM fosfaat ascorbaat) en zet de incubatie. Verander de differentiatie medium om de 3 dagen of zo vaak als nodig is.
- Na 3 weken incubatie vast de cellen met 2 ml 4% paraformaldehyde per putje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en vlek met alizarinerood de aanwezigheid van een calcium afzetting om osteogene differentiatie vast te detecteren.
OPMERKING: Paraformaldehyde is giftig. Oefen voorzichtig door het dragen van handschoenen en een bril tijdens het gebruik. - Voorzichtig te wassen de gefixeerde cellen tweemaal met gedestilleerd water en behandel met 2% alizarinerood kleurstof (2 ml / putje in een 6-wells plaat) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Overtollige kleuring door voorzichtig wassen met leidingwater zodat de kalkaanslag niet los.
- Visualiseer de rood-gekleurde kalkafzettingen met behulp van LM.
4. Kwantitatieve Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reactie (qRT-PCR) Analyse
- Cultuur van de geïsoleerde cellen tot 70% confluentie, dissociëren de handel trypsine-oplossing, wassen en pellet door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 3 min van het totale cellulaire RNA te isoleren.
- Spoel de cellen met PBS om sporen FBS te verwijderen, en vervolgens overgaan tot de RNA isolatie met behulp van een commerciële RNA zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.
- Zuiver het geïsoleerde totale RNA door behandeling met DNase bij 37 ° C gedurende 30 min met een thermocycler. CDNA te synthetiseren met behulp van commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid triplo 10 ul PCR-reacties in een plaat met 96 putjes, waarbij elk reactiemengsel dat 5 pl van SYBR-groene PCR Supermix; 3 ui dubbel gedestilleerd water; 0,5 pl van elke primer, vooruit en achteruit; en 1 pi van de verdunde (1:10) cDNA.
- Uitvoeren van PCR onder de volgende parameters: 10 min bij 98 ° C, gevolgd door 44 cycli van elk 30 seconden bij 98 &# 176: C, 20 seconden bij 60 ° C en 30 seconden bij 72 ° C.
- Normaliseren van de amplificatie van de doelwitgenen op de controlegenen, GAPDH en β-actine; de primer sequenties worden in Tabel 1.
5. Statistische analyse
- Voer alle analyses met behulp van statistische software. Presenteer de gegevens als het gemiddelde ± SEM. Resultaten met een p-waarde (** p ≤ 0,01 en * p ≤ 0,05) werden als statistisch significant.
Representative Results
Dissectie en isolatie van cellen uit menselijke navelstreng, placenta-Koord Junction en foetale placenta
Perinatale weefsel bestaat uit drie afzonderlijke anatomische gebieden. De eerste is de UC, die twee slagaders en een ader, en twee afzonderlijke zones: CL (de buitenste bekleding van het koord) en WJ (het geleiachtig materiaal rond de bloedvaten in het snoer). De tweede is CPJ (de verbinding tussen de kabel en de placenta), en de derde is FP, die direct na de CPJ (de kabel ingevoegd in de placenta, om de baarmoederwand van de moeder is verbonden). Het schema van de isolatieprotocol van cellen van perinatale weefsel weergegeven in figuur 1. De vier bronnen-CL, WJ, CPJ en FP-duidelijk herkenbaar en gescheiden om cellen te isoleren van de explantaten, zie figuur 2. Thij uiterlijk van cel uitgroei van explantkweken werd routinematig gecontroleerd en geregistreerd door LM. Hechtende fibroblastoïde cellen werden waargenomen na 3-4 dagen van het kweken van de CPJ explantaten. Cellen met vergelijkbare morfologie verscheen 7-8, 9-10 en 11-14 dagen na het kweken van de WJ, CL, en FP explantaten, respectievelijk. De uitgroei van cellen van de explantaten die de verschillende bronnen (CL, WJ, CPJ en FP) wordt weergegeven in figuur 3A. Deze cellen werden beschouwd als P0. Toen P0 cellen werden in subcultuur gebracht, bleken ze klonaal groeien, het weergeven van een fibroblastoïde morfologie vergelijkbaar met die van BM-MSC's. Echter, vertoonden zij variatie in de populatie verdubbelingstijd, variërend van 32 uur tot 94 uur voor cellen van CPJ en FP, zoals getoond in figuur 3B en C. Cellen van WJ en CL had soortgelijke verdubbeling tijden mediaal van CPJ en FP. Verdere analyse van de P0 cellen aangegeven dat zij ook gevarieerd in het CFE, variërend 16-92 kolonies.Cellen van de CPJ de hoogste (92), terwijl FP cellen had de laagste (16) CFE. Cellen van CL en WJ had CFE waarden van 59 en 80 kolonies (Figuur 4A-C). De cellen van CL had CFE waarden vergelijkbaar met de BM-MSC's. Deze resultaten suggereren dat CPJ afgeleide cellen hebben een hogere proliferatie en zelfvernieuwing mogelijkheden.
Immunoprofile van de geïsoleerde cellen
Cellen geïsoleerd van de CL, WJ, CPJ en FP werden onderzocht op de expressie van celspecifieke markers. P3-5 cellen vertoonden positieve uitdrukking van MSCs merkers zoals CD29, CD44, CD73, CD90 en CD105 (Figuur 5A en B). Deze cellen zijn ook bekend om de grote histocompatibiliteit klasse uit te drukken ik marker, HLA-ABC, en spreken zich niet uit klasse II marker, HLA-DR 3. De percentages van positieve cellen voor these gekozen markers uit alle bronnen waren vergelijkbaar met die welke standaard BM-MSC's tot expressie. De MFI's aan dat WJ- en CPJ-afgeleide cellen nagenoeg identieke en zelfs hoger dan de CL- en FP-afgeleide cellen (Figuur 5C). Interessant is dat in weerwil van uiteenlopende CFE waarden alle cellen van verschillende bronnen brachten vergelijkbare niveaus van MSC markers. Op basis van de resultaten van celoppervlak markers, werden de geïsoleerde cellen uit alle bronnen beschouwd als MSCs. Verdere analyse van deze cellen bleek dat ook tot expressie pluripotentie genen OCT4, NANOG, KLF4 en SOX2, zoals getoond in Figuur 5D. De CPJ-MSC's hadden de hoogste expressie van pluripotentie markers, gevolgd door WJ-, CL- en FP-MSC's.
Differentiatie Potentiële van geïsoleerde MSC's
De gouden standaard voor het karakteriseren van MSC's is hun vermogen om verscrentiate in meerdere lijnen. Onze resultaten toonden aan dat geïsoleerde MSC's uit alle van de perinatale bronnen gemakkelijk gedifferentieerd in adipogenic, chondrogene en osteogene celtypen. Adipogene afgeleide producten vetdruppels die positief werden gekleurd met Oil Red O, zie figuur 6A. Kleuring met toluïdineblauw van de chondrogene derivaat van MSCs toonde de aanwezigheid van proteoglycanen en glycoproteïnes die hielp bij de productie van extracellulaire matrix (Figuur 6B). Osteogene derivaten van MSC's kleurden positief met alizarinerood de aanwezigheid van de kalkafzettingen betrokken bij botmineralisatie, zoals getoond in figuur 6C.
Zoals verwacht, de transcriptionele analyse van geïsoleerde MSC's uit alle bronnen vertoonden trilineage differentiatie (Figuur 6D -F). Echter, de potpreferentiële differentiatie gevarieerd afhankelijk van de bron van MSC. Adipogene derivaten van WJ-MSC's, hadden 2 keer hogere expressieniveaus van het geselecteerde adipogene genen (CEBPβ, FABP4 en PPARy) vergeleken met CPJ-MSC's. CL- en FP-MSC had de laagste expressie van deze genen. Bij chondrogene differentiatie, uitgedrukt CPJ-MSC derivaten chondrogene geselecteerde genen (SOX9 en COL2) 50-voudig hoger dan de WJ- en FP-MSC derivaten. Vergelijkbaar met de armen adipogene differentiatie van CL-MSC's, ze hadden lagere chondrogenisch vermogen, zoals blijkt uit de laagste expressie van chondrogene genen. CPJ-MSC's vertoonden ook de hoogste osteogene differentiatie potentieel, zoals aangegeven door de 2-voudige hogere niveaus van transcriptie geselecteerde osteogene genen (COL1, OPN en OCN). De expressie van voorlopercellen merker RUNX2 het hoogst in osteogene derivaten van WJ-MSC's, hetgeen aangeeft dat deze cellen traag te reageren op differentiatieomstandigheden. Nogmaals, CL-MSC's vertoonden slechtedifferentiatie tot osteogene lijn. Deze resultaten suggereren dat CPJ-MSC's en WJ-MSC's weergegeven grotere differentiatie potentieel dan CL- en FP-MSC's. De CL-MSC het laagste potentieel om te differentiëren tot trilineage derivaten.
Figuur 1: Schema van de isolatie van cellen uit menselijke navelstreng, placenta-Koord Junction en foetale placenta. Inspecteer het verzamelde monster en de procedure voor dissectie. Stap 1. handmatig ontleden en scheiden de streng / placenta monster in drie afzonderlijke gebieden: navelstreng (UC), cord-junctie placenta (CPJ) en foetale placenta (FP). Scheid de twee verschillende zones van de UC in koord bekleding (CL) en Wharton's gelei (WJ) met een schaar en forceps. Stap 2. Snijd elke ontleed weefsels afzonderlijk in 1-to 2 mm gesneden met een schaar en gedeeltelijk stukken verteren. Stap 3. cultuur de stukken weefsel. Stap 4. Isoleer de cellen van de explantaten d.m.v. trypsine-behandeling. Subcultuur en karakteriseren van de geïsoleerde cellen. Stap 5. Geïsoleerd en gekenmerkt cellen kan worden geamplificeerd en gebruikt voor verscheidene toepassingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Dissectie en cultuur explantaten van menselijke navelstreng, placenta-Koord Junction en foetale placenta. Getoond zijn drie verschillende anatomische gebieden van de streng / placenta sample: UC (opgesplitst in de CL en WJ), CPJ en FP, alsmede de bijbehorende slagaders en aders. CL, WJ, CPJ,en FP werden gescheiden door handmatige dissectie om cellen te isoleren van de explantaten. Elk van de gebieden ontleed werd afzonderlijk in kleine fragmenten en gekweekt in 75-cm platen 2 via 9 ml CM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Morfologie van geïsoleerde cellen uit menselijke navelstreng, placenta-Koord Junction en foetale placenta. (A) Cell uitgroei van explantaten van CL, WJ, CPJ en FP, zoals gevisualiseerd door LM. (B) Subkweek van de geïsoleerde cellen van CL, WJ, CPJ en FP explantaten vertoonden fibroblastoïde morfologie. De schaalbalk vertegenwoordigt 100 urn (vergroting 4x). (C) populatie verdubbelingstijd van tHij isoleerde cellen uit CL, WJ, CPJ, en FP. BM-MSC's werden gebruikt als een standaard. De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde van drievoudige metingen (** p ≤ 0,01 en * p ≤ 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: kolonievormende efficiëntie van cellen uit menselijke navelstreng, placenta-Koord Junction en foetale placenta. (A) De groei van de cellen (P0) geïsoleerd uit CL, WJ, CPJ en FP, uitgeplaat bij een klonale dichtheid van 1,63 cellen / cm2, werden zichtbaar gemaakt door LM. (B) Microfoto cellen gekleurd met kristalviolet tonen kolonievormende vermogen. (C) Single kolonie van cellen gekleurd with kristalviolet. De schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn (vergroting 4x). (D) Grafische weergave van het aantal kolonies gevormd uit de cellen afkomstig van CL, WJ, CPJ en FP. BM-MSC's werden gebruikt als een standaard. De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde van drievoudige metingen (** p ≤ 0,01 en * p ≤ 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Analyse van MSC Markers expressie door de cellen geïsoleerd uit humane navelstreng, placenta-Koord Junction en foetale placenta. (A) Expressie van mesenchymale oppervlakte merkers (CD29, CD44, CD73, CD90 en CD105) Door de cellen van CL, WJ, CPJ en FP, zoals afschrikkenbepaald door flowcytometrie. (B en C) Grafische weergave van het percentage positieve cellen en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) ratio's voor de geselecteerde mesenchymale oppervlaktemerkers. MFI verhoudingen werden berekend met de MFI van de markering (gegenereerd door de software op basis van de fluorescentie-intensiteit van celpopulaties gated) te delen door de MFI van het isotype. De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde van drievoudige metingen. (D) Expressie van pluripotentie genen (OCT4, NANOG, KLF4 en SOX2) Door de cellen van CL, WJ, CPJ en FP, zoals bepaald met qRT-PCR. (** p ≤ 0,01 en * p ≤ 0,05). Genexpressie werd genormaliseerd voor GAPDH en β-actine en de foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde van drievoudige metingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: multilijn nageslacht differentiatie van MSC's geïsoleerd uit menselijke navelstreng, placenta-Koord Junction en foetale placenta. (A) Cellen werden in adipogene differentiatie medium gedurende 3 weken en gekleurd met Oil Red O, waaruit de aanwezigheid van vetdruppels. (B) De celpellets werden in chondrogene differentiatie medium gedurende 3 weken. Histologische vriescoupes van pellet kweken werden gekleurd met toluïdineblauw, het weergeven van de aanwezigheid van glycosaminoglycanen. (C) Cellen werden in osteogene differentiatie medium gedurende 3 weken en gekleurd met alizarine rood, tonen de productie van kalkaanslag suggereren botmineralisatie. Alle beelden werden verkregen door LM. De schaalbalk vertegenwoordigt 100 urn (vergroting 4x). BM-MSC's weopnieuw gebruikt als standaard. (DF) expressie van geselecteerde genen (CEBPβ, FABP4 en PPARy, SOX9, ACAN en COL2 en COL1, RUNX2, OPN en OCN die de differentiatie van MSCs in adipogene, chondrogene en osteogene geslachten, respectievelijk), zoals bepaald door qRT-PCR analyse (** p ≤ 0,01 en * p ≤ 0,05). Genexpressie werd genormaliseerd voor GAPDH en β-actine en foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde van drievoudige metingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Gen | primer sequenties | Lengte product |
| OCT4 | Forward-CCCCTGGTGCCGTGAA | 97 |
| Reverse-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG | </ Td> | |
| NANOG | forward AAAGAATCTTCACCTATGCC | 110 |
| reverse GAAGGAAGAGGAGAGACAGT | ||
| KLF4 | forward CGAACCCACACAGGTGAGAA | 94 |
| reverse TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC | ||
| SOX2 | forward TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA | 75 |
| reverse CTGGGGCTCAAACTTCTCTC | ||
| SOX9 | forward AGCGAACGCACATCAAGAC | 85 |
| reverse CTGTAGGCGATCTGTTGGGG | ||
| COL2 | forward CTCGTGGCAGAGATGGAGAA | 252 |
| reverse CACCAGGTTCACCAGGATTG | ||
| EEN BLIKJE | forward AGCCTGCGCTCCAATGACT | 103 |
| COL1 | forward AAGGTCATGCTGGTCTTGCT | 114 |
| reverse GACCCTGTTCACCTTTTCCA | ||
| RUNX2 | forward TGCTTCATTCGCCTCACAAA | 111 |
| reverse AGTGACCTGCGGAGATTAAC | ||
| OPN | forward CATACAAGGCCATCCCCGTT | 112 |
| reverse TGGGTTTCAGCACTCTGGTC | ||
| OCN | forward TAAACAGTGCTGGAGGCTGG | 191 |
| reverse CTTGGACACAAAGGCTGCAC | ||
| CEBPβ | forward TATAGGCTGGGCTTCCCCTT | 94 |
| reverse AGCTTTCTGGTGTGACTCGG | ||
| FABP4 | forward TTAGATGGGGGTGTCCTGGT | 158 |
| reverse GGTCAACGTCCCTTGGCTTA | ||
| PPARy | forward GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC | 74 |
| reverse ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG | ||
| GAPDH | forward ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | 101 |
| reverse GCCATCACGCCACAGTTTC | ||
| ACTIN | forward AATCTGGCACCACACCTTCTAC | 170 |
| reverse ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC |
Tabel 1: Lijst van Human primersequenties gebruikt in deze studie.
Discussion
Recente ontwikkelingen in het onderzoek naar stamcellen niet alleen een verbetering van de basiskennis van de ontwikkeling processen, maar ook voorzien veelbelovende mogelijkheden voor het gebruik van stamcellen in de biotechnologische, farmaceutische, celtherapie, regeneratieve geneeskunde en tissue engineering-toepassingen 18, 19, 20. Terwijl pluripotente SER geïsoleerd van de vroege embryo's zijn de meest veelbelovende, waarmee zij worden geconfronteerd technische uitdagingen en ethische dilemma's 21, 22, 23. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) afkomstig van volwassen cellen bieden een alternatief, maar ook zij geconfronteerd met vergelijkbare technische en veiligheidsproblemen 23. Bovendien kan iPSCs niet genetisch stabiel zijn of kunnen ondergaan genetische veranderingen, waardoor hun therapeutische toepassing te beperken. Stamcellen zijn ook gemeld in een verscheidenheid van postnatale tisklaagt en organen. De meest voorkomende bronnen van deze ASC's zijn het beenmerg, vet- en spierweefsel. Echter, ASC uit postnatale bronnen hebben een beperkte groei en differentiatie potentieel 24, 25. Ze hebben ook te lijden als gevolg van veroudering en blootstelling aan milieu-invloeden en zijn dus niet altijd effectief voor therapeutische toepassingen 26, 27, 28. Dit heeft ons en anderen heeft geleid tot het zoeken naar nieuwe bronnen van stamcellen die meer naïef dan ASC's zijn.
We hebben perinatale bronnen voor primitieve stamcellen onderzocht als alternatief voor ASC. In dit rapport, zorgen wij voor een betrouwbaar, robuust en simpele methode om de menselijke MSC's uit navelstrengbloed / placenta monsters te isoleren. In vergelijking met andere bronnen en methoden voor het isoleren van ASC, deze werkwijze verschaft een efficiënte en niet-invasieve werkwijze voor het isoleren van grote hoeveelheden high-kwaliteit MSC's. Accentueert verdere hogere groei en differentiatie potentieel van perinatale MSCs vergeleken met MSC's van volwassen bronnen zoals BM.
De UC bevestigen van de foetus de placenta is een groot orgel met verschillende anatomische gebieden, waaronder twee slagaders, een ader, CL en WJ (weefsel rond de bloedvaten). Verschillende studies hebben de isolatie van MSC's uit de hele koord, de WJ, of de placenta, met een variabele groei gemeld en differentiatie potentialen 25, 29. Niettemin tot op heden geen onderzoek daadwerkelijk onderzocht en vergeleken de cellen van verschillende anatomische gebieden van de streng / placenta monster. Wij bieden hier een systematische en eenvoudige methode voor de dissectie van de UC, CPJ, en is verbonden FP voor de isolatie van MSC's. We tonen ook een uitgebreide en eenvoudig protocol te karakteriseren en de kwaliteit van de geïsoleerde cellen te evalueren door het bepalen van hun proliferatie capabilteiten, evenals hun zelf-vernieuwing en differentiatie mogelijkheden. Deze werkwijze is reproduceerbaar en levert een grote hoeveelheid van superieure kwaliteit MSC's.
We vonden dat de gedeeltelijke digestie van stukken weefsel 1-2 mm groot behulp van een commerciële trypsineoplossing reproduceerbaar leverde cellen uit de explantaten, terwijl de volledige digestie van weefsel in afzonderlijke cellen hadden slechte opbrengsten van geïsoleerde cellen. Echter, een studie rapporteerde dat grotere weefselexplantaten van UC ongeveer 10 mm groot waren optimaal voor celisolatie 30. Omgekeerd ander onderzoek suggereerde dat de weefselexplant werkwijze resulteerde in een langere kweek cyclus lagere opbrengst aan cellen in vergelijking met het enzym digestiemethode 31. In vorige rapporten, de behandeling van weefsels koord met collagenase II en hyaluronidase, afzonderlijk of na trypsine, uitgevoerd om koord cellen 32, 33 isoleren
Terwijl het protocol voor de dissectie en isolatie van cellen uit de explantaten eenvoudig is, kan een deel van de stappen blijken uitdagend. Controleer eerst explantaat hechting doordat hun hechting aan het oppervlak van de kweekfles. Dit kan worden vergemakkelijkt door toepassing van een kleine hoeveelheid medium alleen voor de weefselstukjes voor de eerste 2 uur kweek, en vervolgens zorgvuldig toevoegen van de overblijvende medium. Second beperken het aantal explantaten tot minder dan 15 per T75 fles. Te weinig ruimte tussen de stukken of te veel stuks per fles zijn remmend voor mobiele uitgroei. Ten derde, stukken weefsel die niet houden aan het oppervlak van de kweekfles na 3 dagen incubatie moeten worden overgedragen aan een nieuwe fles voor de naleving en het kweken. Ten vierde, stukken weefsel worden gekweekt vrij van celresten, hetgeen hechting remt moet zijn. Ten vijfde, het kweken van grote stukken vereist meer medium en geen cel uitgroei efficiëntie te verbeteren. Tenslotte volgen de explantkweken voet, met name na het verschijnen van cel uitgroei, als de cellen confluent snel kan worden en differentiëren afhankelijk van de weefselbron. Enkele beperkingen van de techniek zijn het gebrek aan kennis in het ontleden van de monsters aan de CL, WJ, CPJ en FP scheiden; kleine monsterhoeveelheden, wat resulteert in lage opbrengst WJ; en vertraagde verwerking the monsters nodig binnen 2-4 uur van verzameling te worden verwerkt tot AVOid een verlies in cel herstel.
De gouden standaard voor de karakterisering van MSC is het vermogen te hechten aan kunststof, vormen de fibroblastische fenotype en differentiëren in meerdere lijnen. Dit zijn ook gangbare criteria voor het definiëren van MSCs zoals beschreven door de ISCT 35. In deze studie, cellen geïsoleerd uit alle bronnen waren hechtende kunststof en positieve expressie MSC merkers (CD29, CD44, CD73, CD90 en CD105) maar negatief voor expressie hematopoietische marker CD45. Daarnaast drukten ze human leukocyte antigen (HLA) klasse I, maar waren negatief voor HLA klasse II. Vergeleken met de BM-MSC's, WJ- en CPJ-afgeleide cellen waren hoger. Deze resultaten zijn consistent met eerdere verslagen van UC-afgeleide MSCs 33, 36, 37, 38. Bovendien, onze resultaten toonden aan dat CL-, WJ-, CPJ-, FP-MSC's uitgedrukt pluripotentie genen zoals OCT4, NANOG en SOX2; echter was de expressie ervan lager dan die van SER, zoals eerder 39 beschreven. Deze resultaten zijn ook in overeenstemming met een eerdere studie die de expressie van pluripotentie markers in perinatale-afgeleide cellen 40 gemeld. Interessant, werd waargenomen dat de expressie van pluripotente marker was hoger in CPJ-MSC's dan in cellen die zijn geïsoleerd uit andere bronnen. Er werd ook opgemerkt dat de UC-MSC's vertoonden grotere zelf-verlenging potentieel dan BM-MSC 41. Interessant is, ondanks de overeenkomst in fenotypische kenmerken, de cellen geïsoleerd uit de vier bronnen had CFE variabele waarden. Echter, met uitzondering van de FP-MSC, ze hadden allemaal beter CFE waarden dan BM-MSC's. CPJ-MSC's hadden de hoogste CFE waarde en de snelheid van proliferatie in vergelijking met alle andere MSC's. Bovendien WJ- en CPJ-MSC weergegeven differentiatie potentieel hoger dan BM-MSC's. CL-MSC's toonde de minst differentiatiepotentieel in drie lijnen (dwz adipogene, chondrogene en osteogene), terwijl CPJ-MSC's de hoogste trilineage differentiatiepotentiaal en FP-MSC getoonde minste adipogene differentiatie potentieel.
Tot slot, onze resultaten toonden aan dat de kwaliteit en kwantiteit van geïsoleerde MSC's verschilde tussen de vier bronnen in het snoer / placenta monster. CPJ-MSC's hadden meer proliferatie capaciteit en grotere zelf-verlenging potentieel. Ze waren ook krachtig in hun differentiatie in de types trilineage cel. Door hun lage verdubbelingstijd kon CPJ-MSC's snel worden uitgebreid 1000-voudig en gebruikt voor high-throughput screening van geneesmiddelen of biomateriaal. Deze cellen kan een veelbelovende bron voor celtherapie en regeneratieve geneeskunde toepassingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd ondersteund door OU-WB ISCRM, Oakland University en Michigan Head en Spine Institute. N. Beeravolu en C. McKee ontvangen Provost Graduate Research Award van Oakland University. Wij waarderen S. Bakshi voor de herziening van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM with 4,500 mg/mL glucose | Invitrogen | 11995065 | |
| FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
| Insulin | Prospec | CYT-270 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
| Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
| TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
| GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| DNase | Promega | M6101 | |
| iScript kit | Biorad | 1708891 | |
| Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
| Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
| Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
| Crystal violet | Sigma | C3886 | |
| Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
| APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
| APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
| FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
| FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
| APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
| FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
| APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
| Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
| Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
| Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
References
- Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1 (2015).
- English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
- Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029 (2014).
- Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).
- Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10 (2013).
- Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24 (2012).
- Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
- Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425 (2013).
- Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
- Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215 (2015).
- Kim, D. W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
- Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
- Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
- Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134 (2013).
- Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).
- Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
- Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
- Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
- Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
- Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
- Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
- Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
- Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
- Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
- Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).
- Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
- Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
- Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
- Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
- Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
- Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).
