Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Выделение и характеристика мезенхимальных стромальных клеток из пуповинной и фетальной плаценты

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55224
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 2,4, 1,2
1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

Summary

Здесь мы приводим протокол для рассечения пуповины человека (UC) и фетальной образца плаценты в мозге накладки (CL), желе Уортон (WJ), шнур-плацента узел (КЗЖ) и плодной плаценты (ФП) для изоляции и характеристика мезенхимальных стромальных клеток (МСК) с использованием метода эксплантов культуры.

Abstract

Пуповины человека (UC) и плацента неинвазивные, примитивные и обильные источники мезенхимальных стромальных клеток (МСК), которые все больше и больше привлекли к себе внимание, потому что они не создают какие-либо этические или моральные проблем. Современные методы, чтобы изолировать от MSCs UC дают низкое количества клеток с переменными потенциалами пролиферации. Так как UC является анатомический сложным органом, различие в свойствах MSC может быть из-за различия в анатомических регионах их изоляции. В этом исследовании мы сначала рассекали образцы шнура / плаценту в трех дискретных анатомических областях: UC, шнур-плацента плоскостных (КЗЖ) и плодной плаценты (ФП). Во-вторых, две различные зоны, шнур накладки (CL) и желе Уортон (WJ), были разделены. Техника эксплант затем использовали для выделения клеток из четырех источников. Время, требуемое для первичной культуры клеток из эксплантов варьироваться в зависимости от источника ткани. Разрастание клеток происходит в пределах 3 - 4 даYS из эксплантов КЗЖ, в то время как рост наблюдался после 7 - 10 дней и 11 - 14 дней с CL / WJ и FP эксплантов, соответственно. Выделенные клетки были прилипает к пластмассе и отображаются фибробластоидными морфологии и поверхностных маркеров, таких как CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и, подобно костного мозга (ВМ) -derived ЦКМ. Тем не менее, колониеобразующая эффективность клеток варьировали с КЗЖ-ЦОЙ и WJ-MSCs показывает более высокую эффективность, чем BM-MSC. MSCs из всех четырех источников дифференцированы в Adipogenic, хондрогенные и остеогенные родословные, указывая, что они были мультипотентны. CPJ-MSCs дифференцированы более эффективны по сравнению с другими источниками MSC. Эти результаты свидетельствуют о том, что КПЯ является самым мощным анатомической области и дает более высокое число клеток с большей пролиферации и самообновления потенциала в пробирке. В заключении, сравнительный анализ MSCs из четырех источников показал, что КЗЖ является более перспективным источником ЦОГО для клеточной терапии, regenerativе медицины и тканевой инженерии.

Introduction

Стволовые клетки присутствуют в различных органах и тканях организма. Они обладают регенеративным потенциалом и играют важную роль в восстановлении поврежденных тканей в организме на протяжении всех человеческой жизни 1, 2. Это вызвало большой интерес у взрослых стволовых клеток (ИСС), в частности, так как, в отличие от эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), использование ИСС не представляет моральных и этических дилемм. Несколько исследований сообщили о выделении ИСС, таких как мезенхимальных стромальных клеток (МСК); кроветворные стволовые клетки (ГСК); а также различные клетки - предшественники, в том числе различных взрослых источников , начиная от костного мозга (BM) в жировую ткань (AT) и пульпу зуба 3, 4, 5. Тем не менее, количество ИСС, присутствующих в большинстве взрослых ниш ограничено, и их выделение обычно включает инвазивные и болезненную процедуру с возможным доноромсайт заболеваемости. Кроме того, возраст донора и экологический стресс может также играть значительную роль в определении качества и биологическую активность изолированных клеток 6, 7, 8. ИСС также показывает ограниченную пролиферацию и дифференцировку потенциал в процессе культивирования в лабораторных условиях .

Чтобы преодолеть эти недостатки современной ИСС, новые источники были преследовали изолировать стволовые клетки. Эти усилия привели к выделению стволовых клеток из перинатальных источников, в том числе пуповинной крови, пуповинной ткани, плаценты и амниотической жидкость 9. Эти источники привлекли к себе внимание из - за их легкой и обильным наличием 10, 11, 12, 13. Кроме того, перинатальная ткань может быть получена неинвазивной, и стволовые клетки, полученные из нихболее примитивный , чем ИССЫ , выделенных из взрослых источников 14, 15. Они выделены из тканей , полученных при рождении и считаются претерпели минимальные изменения в геноме вследствие старения и стрессов окружающей среды 16.

Однако, сообщаемые характеристики стволовых клеток из перинатальных источников и их потенциал к самообновлению, а также дифференцировать варьироваться в широких пределах 11, 17. Это может быть отчасти связано с тем, что пуповина человек (UC) является сложным органом. Мы предполагаем, что дискретные области перинатальной ткани создают особые ниши, ответственные за вариации и более примитивной природу этих стволовых клеток по сравнению с ИССАМИ, полученных из не-перинатальных источников. Это исследование описывает рассечение образцов пуповинной / плацентарных на три дискретных анатомических областей: UC, шнур-плацента плоскостных (КЗЖ), ANд плода плацента (ФП). UC дополнительно разбит на две зоны: шнур накладки (CL) и желе Уортон (WJ). Анализ выделенных клеток CL, WJ, CPJ и FP показал, что все они проявляли фибробластоидную морфологию и экспрессировали маркеры MSC, но они отличались по самообновлению и дифференцировки. CPJ-клетки, полученные демонстрировали более высокую скорость пролиферации и самообновления потенциала по сравнению с Uc- и FP-клетки, полученными, что делает их более перспективным источником для клеточной терапии, регенеративной медицины и тканевой инженерии.

Protocol

Образцы (п = 3) были получены из попустительства здоровых доноров через Beaumont Hospital биобанк, Royal Oak, MI и больницу Провиденса, Southfield, MI под HIC- (HIC # 2012-101) и IRB- (IRB # 820662- 3), соответственно, одобрены протоколы и обрабатывали, как утверждается IBC (# 2858) из Oakland University, Рочестер, штат Мичиган.

1. Обработка пуповинной, шнур-плацента Распределительная и фетальный Плацента и выделения клеток

  1. Консерванта собирают образцы UC примерно 10 см в длину, в том числе 5 - 6 см, соединенных с КПЯ и 3 - 4 см FP. Сразу же место каждый образец в коллекции чашки, содержащей среду Игла (DMEM с 4,500 мг / мл глюкозы и раствором антибиотика (0,1% гентамицина, 0,2% стрептомицина и 0,12% пенициллина)) и хранят при температуре 4 ° С до тех пор, пока не будет транспортируется в лабораторию по размещение его на льду в коробке из пенопласта. Процесс образца при температуре 4 ° С в течение 2 - 4 ч сбора.
  2. Поместите образец в 150 Мм Петри Петри продолжалилед в шкафу биологической безопасности. С помощью иглы и шприца, промойте его несколько раз охлажденного льдом PBS для удаления сгустков крови. Убедитесь, что образец увлажнять с PBS в процессе обработки и не дайте ему высохнуть. Для сохранения стерильности обработки образца асептический использования автоклавного PBS и хирургических инструментов в течение обработки образцов.
  3. Тщательно изучить образец для идентификации различных анатомических областей: UC, CPJ и FP. Во-первых рассекают UC. Держа плод конца UC с пинцетом и аккуратно сделать первый разрез только в верхней части КЗЖА с помощью пару ножниц. Сделать второй разрез ниже CPJ отделить КЗЖ (1,5 - 2,0 см) от FP. Поместите отделенный UC, CPJ и FP в отдельных чашках Петри для дальнейшей обработки.
  4. Вырезать UC в продольном направлении с помощью ножниц и пинцетов, полностью обнажая кровеносные сосуды и окружающие WJ, не нарушая эпителий.
  5. Выскоблите WJ вдали от кровеносных сосудов и внутреннего эпителия subamnionиспользуя скальпель, а затем удалить кровеносные сосуды. Обязательно, чтобы собрать все оставшиеся периваскулярный WJ под и вокруг кровеносных сосудов, и поместить собранный WJ в отдельной чашке Петри.
  6. Собрать оставшуюся ткань, шнур подкладку (CL), в отдельной чашке Петри.
  7. После разделения тканей, представляющих CL, WJ, CPJ и FP, заменить PBS с 3 - 5 мл коммерческого раствора трипсина и по отдельности вырезать каждый из тканей в 1- до 2-мм кусочки с помощью ножниц.
  8. Инкубируйте кусочки ткани в коммерческом растворе трипсина при 37 ° С в течение 30 мин в 5% CO 2 инкубатора в течение частичного расщепления образцов. Обратите внимание на частичное переваривание визуализации высвобождения клеток с использованием фазово-контрастный микроскопа.
  9. К частично переваренных образцов, добавляют равный объем культуральной среды (см; DMEM с 4,500 мг / мл глюкозы и 2 мМ L-глутамина, с добавлением 10% сыворотки человека / FBS и раствор антибиотика (0,1% гентамицина, 0,2% стрептомицина и 0,12% рenicillin)) для нейтрализации коммерческого раствора трипсина. Передача содержимого в центрифужные пробирки на 50 мл, и пусть частично переваренные кусочки ткани оседать в течение 3 мин.
  10. Тщательно аспирата супернатант, в том числе отдельные клетки (они не расширяются эффективно), а пластина 15 - 20 частично переваренные куски ткани на 75-см 2 культуре ткани колбу и добавляют 9 мл CM. Инкубирую при 37 ° С и не беспокоить колбы культуры в течение 2 - 3 дней, чтобы обеспечить адгезию кусочков ткани.
    Примечание: Оставшаяся часть частично переваренные образцы ткани может быть криоконсервированной для будущего выделения клеток.
  11. После 3 дней инкубации изменить CM и посмотрите на появление выростов клеток из эксплантов на ежедневной основе; рост клеток, должен быть очевиден из адгезивных эксплантов через 3 - 4 дней, 7 - 10 дней, и 11 - 14 дней инкубации в течение CPJ, CL / WJ, и FP, соответственно. С этого момента, измените КМ через каждые 3 дня илинеобходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост клеток достигает 70% сплошность 7 - 10 дней после первоначального выроста клеток из эксплантов. Обратите внимание, что не прилипшие кусочки ткани не вызывают какие-либо клетки выроста, пока они не прилипают к пластмассе. Необходимо соблюдать осторожность, так, чтобы колба не нарушается во избежание отрыва кусочков адгезивных ткани. Если есть какие-либо плавающие куски после первых 3 дней культивирования, они могли быть спасены, переводя их в новую колбу для крепления.
    Примечание: Когда рост клеток из эксплантов ткани достигает 70% слияния, они должны получить субкультуры. Как было указано выше, из МСК CL / WJ, FP, CPJ и достигнет слияния в 10 - 14 дней, 14 - 20 дней, и 17 - 24 дней, соответственно.
  12. Для того, чтобы субкультивировании переросли клетку из эксплантов, диссоциируют клетки с использованием 1 - 2 мл раствора трипсина коммерческого / 75 см 2 культуральной колбы и инкубируют при 37 ° С в течение 3 мин. Нейтрализовать 1 - 2 мл СМ и центрифуге 1 500 мкг в течение 3 мин. Делатьобязательно вращать колбу при добавлении трипсина для равномерного распределения по всему.
  13. Примечание: Осажденные клетки считаются проходом 0 (Р0) и будут приостановлены в СМ, подсчитывали и пересевают при плотности посева от 1 × 10 4 / см 2 для амплификации, характеризации и криоконсервации. Избыточные клетки могут быть криоконсервации в точке Р0.

2. Характеризуя изолированные клетки

  1. Колонии эффективность формирования (CFE) Анализ
    1. Покрывают блюда 100-Мм Петри (площадь поверхности 60 см 2) с 0,1% желатина в течение 30 мин и поместить их в СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
      Примечание: Хотя нет необходимости, желатин покрытие улучшает адгезию клеток.
    2. Удалить избыток желатин и семена чашек , покрытые клетки P0 при концентрации 1,63 клеток / см 2. Добавьте 3 мл CM и инкубировать в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
    3. Монитор сеяных пластины для клонального ростас помощью световой микроскопии (LM) и изменения среды каждые 3 дня.
    4. Через 10 - 14 дней роста клеток, мыть чашки Петри дважды PBS и зафиксировать клетки в 4% параформальдегиде в течение 30 мин при комнатной температуре.
      Примечание: параформальдегид является токсичным. Пожалуйста практика осторожности, надев перчатки и очки во время использования.
    5. Пятно фиксированных клеток с 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 1 ч при комнатной температуре и промыть пластины с водопроводной водой до тех пор, несвязанное синее пятно не исчезнет.
    6. Подсчитайте число колоний, состоящих из, по меньшей мере 50 клеток с использованием LM.
  2. Экспрессия маркеров клеточной поверхности
    1. Культуры изолированные клетки до 70% слияний, диссоциируют с коммерческим раствором трипсина, и мыть и осадок центрифугирования при 1500 х г в течение 3 мин. Приостановка клетки в буфере FACS (1X PBS с 2% FBS и 0,1% азида натрия).
      Примечание: Азид натрия токсичен. Пожалуйста практика осторожности, надев перчатки и очки во время использования.
      2. 6) с FITC - или АРС-меченых MSC-специфических антител (FITC-конъюгированных антител против: CD44 и CD90 или АРС-конъюгированных антител против: CD29, CD73, CD105 и) в буфере FACS в течение 30 мин при 4 ° С в темный.
    2. Центрифуга окрашенных клеток при 670 мкг в течение 5 мин, аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 500 мкл буфера FACS.
    3. Анализ клеток антитело-окрашивали с помощью FACS в соответствии с протоколом производителя.

3. Дифференциация потенциал

  1. Adipogenic дифференциация
    1. Культуры изолированные клетки до 70% слияний, диссоциируют с коммерческим раствором трипсина, и мыть и осадок центрифугирования при 1500 х г в течение 3 мин.
    2. В инкубаторе СО 2 при 37 ° С, культивирования клеток в концентрации 100000 клеток / лунку 6-луночного планшета , содержащую 2 мл CM.
    3. Через 24 часа, замените КМ с adipogЕНИК дифференциации среды (0,5 мкМ изобутил-метилксантина, 1 мкМ дексаметазон, 10 мкМ инсулина, и 200 мкМ индометацин) и инкубировать. Изменение дифференциации среды каждые 3 дня или по мере необходимости.
    4. После 3-х недель инкубации клетки фиксируют с 2 мл 4% параформальдегида на лунку в течение 30 мин при комнатной температуре и пятна с масляным красным O, чтобы обнаружить образование липидных капель с целью анализа для адипогенной дифференциации.
      Примечание: параформальдегид является токсичным. Пожалуйста практика осторожности, надев перчатки и очки во время использования.
    5. Treat фиксированные клетки с 60% изопропанола (2 мл / лунку 6-луночного планшета) в течение 5 мин.
    6. Заменить изопропиловый спирт с 2 мл масла Красный O пятно (фильтр 3 части масла красный O пятна и 2-х частей дистиллированной воды), инкубируют в течение 15-30 мин при комнатной температуре и промывают 3 - 4 раза с водопроводной водой, чтобы удалить любой несвязанный пятно ,
    7. Визуализация красных окрашенных липидных капель, что указывает на адипогенной клеточной линии, Uпеть LM.
  2. хондрогенная дифференциация
    1. Культура изолированных клетки до 70% слияний, диссоциируют с коммерческим раствором трипсина и промывали PBS.
    2. Для того, чтобы осадить клетки для индукции хондрогенной, центрифужных 250000 клеток в центрифужной пробирке 15 мл с 2 мл СМ при 11000 х г в течение 8 мин. Инкубируйте гранулы в течение ночи при 37 ° С.
    3. Через 24 ч, осторожно заменить СМ с хондрогенной дифференциации среды (20 нг TGF 1, 10 нг инсулина, 100 нМ дексаметазона, и 100 мкМ аскорбиновой кислоты), не нарушая гранул и продолжают инкубацию. Изменение дифференциации среды каждые 3 дня или по мере необходимости.
    4. После 3-х недель инкубации клетки фиксируют с 2 мл 4% параформальдегида на лунку в течение 30 мин при комнатной температуре. Cryosection и пятна с 1% толуидиновым синимом, чтобы исследовать наличие или производство внеклеточной матрицы с целью определения хондрогенных дифференциаций.
      Примечание: Паraformaldehyde является токсичным. Пожалуйста практика осторожности, надев перчатки и очки во время использования.
    5. Для cryosectioning, аккуратно мыть собранные клеточные гранулы дважды PBS и зафиксировать с 1 мл 4% параформальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре.
      Примечание: параформальдегид является токсичным. Пожалуйста практика осторожности перчаток и износ глаз во время использования.
    6. Промыть гранулы дважды PBS, чтобы удалить параформальдегид и передач в раствор сахарозы / OCT (1: 2, 20% Сахароза: ОКТ). Инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч, чтобы позволить раствору полностью проникать в клеточные гранулы; это позволит плавному секционированию.
    7. Перенесите гранулы в форму ОКТА. Замораживание пресс-формы при температуре -20 ° С в течение 4 - 6 ч и cryosection около 10 - 12 мкм толщиной секций клеточных гранул с использованием криостата для окрашивания толуидиновым синим.
    8. Вымойте криосрезы осторожно PBS; добавить несколько капель 1% толуидиновый синий краситель, охватывающим секции гранул на слайде полностью; и вклУбате в течение 1 ч при комнатной температуре.
    9. Вымойте слайды с PBS несколько раз в destain. Удалите излишки пятна путем погружения слайда в растворе HCl, на основе спирта (95% спирта + 0,5 мл HCl) несколько раз до тех пор, несвязанный синий цвет не исчезнет. Установить окрашенные участки с помощью 100 мкл-монтажного раствора для долгосрочного сохранения слайдов.
      Примечание: Синий окрашивание участков указывает на наличие гликозаминогликанов и гликопротеидов и можно будет наблюдать с помощью LM.
  3. остеогенной дифференцировки
    1. Опять же, культура изолированные клеток до 70% слияний, диссоциирует с коммерческим раствором трипсина, и мыть и осадок центрифугирования при 1500 х г в течение 3 мин.
    2. Пересевают клетки в концентрации 100000 клеток / лунку 6-луночных планшетах , содержащих 2 мл СМ в СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
    3. Через 24 ч, заменить КМ с остеогенной дифференцировки среды (0,1 мкм; М дексаметазона, 10 мкМ β-глицерофосфат, и 50 мкМ аскорбата фосфат) и продолжают инкубацию. Изменение дифференциации среды каждые 3 дня или по мере необходимости.
    4. После 3-х недель инкубации клетки фиксируют с 2 мл 4% параформальдегида на лунку в течение 30 мин при комнатной температуре и пятна с ализарин красный цвет, чтобы обнаружить присутствие осаждения кальция с целью определения остеогенной дифференцировки.
      Примечание: параформальдегид является токсичным. Пожалуйста практика осторожности, надев перчатки и очки во время использования.
    5. Осторожно промыть фиксированные клетки дважды дистиллированной водой и обрабатывают 2% ализарин красным красителем (2 мл / лунку в 6-луночный планшет) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    6. Удалите излишки пятна, осторожно промывают водопроводной водой, так что отложения кальция не выбивать.
    7. Визуализация красных пятнах отложения кальция с использованием LM.

4. Количественный обратной транскриптазы полимеразной Чав реакции (QRT-ПЦР) Анализ

  1. Культуры изолированные клетки до 70% слияний, диссоциируют с коммерческим раствором трипсина, промыть, а осадок центрифугирования при 1500 мкг в течение 3 мин, чтобы изолировать общий клеточный РНК.
  2. Промывают клетки с PBS для удаления следов FBS, а затем перейти к выделению РНК с использованием коммерческого набора для очистки РНК, следуя инструкциям производителя.
  3. Очищает выделенный полный РНК путем обработки ДНКазы при 37 ° С в течение 30 мин с использованием термоциклера. Синтезировать кДНК с использованием коммерческого набора в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Подготовьте трех экземплярах реакции 10 мкл ПЦР в 96-луночный планшет, с каждой реакционной смеси, содержащей 5 мкл SYBR-зеленый PCR Supermix; 3 мкл дважды дистиллированной воды; 0,5 мкл каждого праймера, прямой и обратный; и 1 мкл разведенного (1:10) кДНК.
  5. Выполните ПЦР при следующих параметрах: 10 мин при 98 ° С, а затем 44 циклов 30 с каждый на 98 &# 176; С, 20 с при 60 ° С и 30 с при 72 ° С.
  6. Нормализация амплификации генов-мишеней к опорным генам, GAPDH и -актину; Последовательности праймеров приведены в таблице 1.

5. Статистический анализ

  1. Выполните все анализы с использованием статистического программного обеспечения. Представить данные в виде среднего значения ± SEM. Результаты с р-значением (** р ≤ 0,01 и * р ≤ 0,05) считались статистически значимыми.

Representative Results

Препарирование и выделение клеток из пуповинной, шнур-плацента Junction, и фетальной плаценты

Перинатальная ткань состоит из трех дискретных анатомических областей. Первым из них является UC, содержащий две артерии и одна вена, а также две отдельные зоны: CL (наружный облицовочный шнура) и WJ (желеобразное материал, окружающий кровеносные сосуды внутри мозга). Второй КЗЖ (соединение между шнуром и плацентой), а третий, FP, который сразу же после КПЯ (корд вставляет в плаценту, который прикреплен к стенке матки матери). Схема протокола изоляции клеток из ткани перинатальной изображена на рисунке 1. Эти четыре источника-CL, WJ, CPJ и FP-четко идентифицировать и были отделены , чтобы изолировать клетки от эксплантов, как показано на рисунке 2. Tон появление клеток нароста из эксплантов культур регулярно контролируется и регистрируется LM. Прикрепленные фибробластоидные клетки наблюдались через 3-4 дней культивирования эксплантов CPJ. Клетки с подобной морфологией появилась 7-8, 9-10 и 11-14 дней после культивирования эксплантов WJ, CL и FP, соответственно. Вырост клеток из эксплантов , представляющих различные источники (CL, WJ, CPJ и FP) изображен на фигуре 3А. Эти клетки были расценены как P0. Когда клетку P0 пересевало, они появились расти клонированного, показывая фибробластоидную морфологию, аналогичной ОГО-ПКЦ. Однако они демонстрировали изменение во времени удвоения популяции, в пределах от 32 ч до 94 ч для клеток из CPJ и FP, как показано на фигуре 3В и С. Клетки от WJ и CL имели подобные времена удвоения медиальнее CPJ и FP. Дальнейший анализ P0 клеток показал, что они также варьировались в CFE, в пределах от 16 до 92 колоний.Клетки из CPJ имели самый высокий (92), в то время как FP клетки имели самую низкую (16) CFE. Клетки из CL и WJ были ДОВСЕ значения 59 и 80 колоний, соответственно (фиг 4A - C). Клетки из CL имели значения ДОВСЕ похожих на ОМ-ПКЦ. Эти результаты свидетельствуют о том, что КЗЖ клетка, полученные имеет более высокую пролиферативную и самообновление возможности.

Immunoprofile из изолированных клеток

Клетки, выделенные из CL, WJ, CPJ и FP были исследованы на экспрессию клеточных маркеров специфическим. P3-5 клетка отображается положительным выражением для ЦКМСА маркеров , таких как CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и (рис 5А и B). Эти клетки также известны выразить основной класс гистосовместимости I маркер, HLA-ABC, и не выражает класса II маркера HLA-DR 3. Процент положительных клеток для яEse выбранные маркера из всех четырех источников были аналогичны, что выражается стандартным BM-MSC. Тем не менее, соотношение MFI показывает , что и WJ - КЗЖ-клетка , полученная почти одинаковы , и даже выше , чем CL- и FP-клетки , полученные (фиг.5С). Интересно отметить, что, несмотря на изменения ДОВСЕ значения, все клетки из разных источников выражены сходные уровни маркеров MSC. На основании результатов маркеров клеточной поверхности, выделенные клетки из всех четырех источников были расценены как ЦКЕ. Дальнейший анализ этих клеток показало , что они также экспрессируют гены плюрипотентности, Oct4, NANOG, Klf4 и Sox2, как показано на рисунке 5D. КЗЖ-МСК имела самую высокую экспрессию маркеров плюрипотентности, а затем WJ-, Cl- и FP-ЦКЙ.

Дифференциация потенциал изолированных ПКЦ

Золотым стандартом для определения характеристик MSCs является их способность сиситемахrentiate в несколько линий. Наши результаты показали, что изолированные MSCs от всех перинатальных источников легко дифференцируются в адипогенные, хондрогенные и остеогенные тип клеток. Adipogenic производные получают липидные капли , которые были положительно окрашенных масляным красным O, как показано на фиг.6А. Толуидин синим окрашивание хондрогенного производного MSCs показало наличие протеогликанов и гликопротеинов , которые помогают в производстве внеклеточного матрикса (рис 6В). Остеогенные производные MSCs положительно окрашенных ализарин красный цвет указывает на наличие отложений кальция , участвующих в минерализации костей, как показано на фиг.6С.

Как и следовало ожидать, транскрипционный анализ изолированных MSCs из всех источников показал trilineage дифференциации (рис 6D -F). Тем не менее, банкренциальная дифференциация варьировалась в зависимости от источника ЦОГО. Adipogenic производные WJ-ЦКМ были в 2 раза более высокие уровни экспрессии выбранных генов адипогенных (CEBPβ, FABP4, и PPAR & gamma) по сравнению с КЗЖ-ЦКМ. CL- и FP-МСК имели самую низкую экспрессию этих генов. В случае хондрогенной дифференциации, производные КЗЖ-MSCs выраженных выбраны хондрогенные генов (Sox9 и Col2) в 50 раз выше, чем производные и WJ-ФП-МСК. Подобно бедному адипогенной дифференциации CL-ПКЦ, они имели более низкий хондрогенный потенциал, как видно по самой низкой экспрессии генов хондрогенных. КЗЖ-MSCs также показал самый высокий потенциал остеогенной дифференцировки, как показано в 2 раза более высокие уровни транскриптов выбранных генов остеогенных (col1, OPN и OCN). Однако, экспрессия маркеров предшественников Runx2 была самой высокой в ​​остеогенных производных WJ-MSCs, указывая, что эти клетки были медленными в ответ на условия дифференциации. Опять же, CL-MSCs показал бедныхдифференциация в остеогенную линию. Эти результаты свидетельствуют о том, что CPJ-MSCs и WJ-MSCs отображается больший потенциал дифференциации, чем CL- и FP-ПКЦ. CL-MSCs имела самый низкий потенциал дифференцироваться в производные trilineage.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схема Выделение клеток из пуповинной, шнур-плацента Junction, и фетальный плаценте. Проверьте собранную пробу и приступить к диссекции. Шаг 1. Вручную рассекает и отделить образец шнура / плаценту на три дискретные области: пуповины (UC), шнур-плацента узел (КЗЖ) и плодная плацента (ФП). Разделяют две отдельных зоны ЯКОВ в пуповинной подкладку (CL) и Уортон желе (WJ) с помощью ножниц и щипцов. Шаг 2. Вырезать каждый из рассеченных тканей по отдельности в 1- тO 2-мм кусочки с помощью ножниц и частично переварить куски. Шаг 3. Культура кусочки ткани. Шаг 4. Изолируйте клетки из эксплантов путем обработки трипсина. Субкультура и охарактеризовать выделенные клетки. Шаг 5. Выделено и охарактеризовано клетки могут быть усилены и использоваться для различных применений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Препарирование и культура эксплантов из человеческой пуповины, шнур-плацента Junction, и фетальной плаценты. Показаны три различных анатомических областях образца пуповинной / плацентарной: UC (разделить на CL и WJ), CPJ и FP, а также связанный с ним артерии и вены. CL, WJ, CPJ,и FP были разделены вручную рассечения для выделения клеток из эксплантов. Каждый из вскрытых областей был отдельно нарезают на мелкие фрагменты и культивировали в 75-см 2 пластины , используя 9 мл CM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Морфология изолированных клеток из человеческой пуповины, шнур-плацента Junction, и фетальной плаценты. (А) Сотовый отросток из эксплантатов CL, WJ, CPJ и FP, а визуализировали LM. (Б) Субкультура изолированных клеток из CL, WJ, CPJ и FP эксплантов показала фибробластоидную морфологию. Шкала бар составляет 100 мкм (увеличение: 4x). (С) Популяция время удвоения тон изолировал клетки от CL, WJ, CPJ и FP. БМ-МСК были использованы в качестве стандарта. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего значения трех параллельных измерений (** р ≤ 0,01 и * р ≤ 0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: колониеобразующих эффективности клеток из пуповинной, шнур-плацента Junction, и фетальный плаценте. (А) Рост клеток (p0) , выделенных из CL, WJ, CPJ и FP, высевают при плотности клонального 1,63 клеток / см 2, были визуализированы с помощью LM. (Б) Микрофотография клеток , окрашенных кристаллические фиолетовое отображение мощности колониеобразующей. (С) одной колонии клеток , окрашенных остроумиеч кристаллический фиолетовый. Масштабные столбцы представляют 100 мкм (увеличение: 4x). (D) Графическое представление количества колоний , образованных из клеток , полученных из CL, WJ, CPJ и FP. БМ-МСК были использованы в качестве стандарта. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего значения трех параллельных измерений (** р ≤ 0,01 и * р ≤ 0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Анализ MSC маркеров , выраженные клетки , выделенные из пуповинной, шнур-плацента Junction, и фетальный плаценте. (А) Экспрессия поверхностных маркеров мезенхимальных (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и) с помощью клеток из CL, WJ, CPJ и FP, а сдерживатьдобывали с помощью проточной цитометрии. (В и С) Графическое представление процентного содержания положительных клеток и средний показатель соотношения интенсивность флуоресценции (MFI) для выбранных поверхностных маркеров мезенхимальных. Коэффициенты MFI были рассчитаны путем деления значения MFI маркера (сгенерированный с помощью программного обеспечения на основе интенсивности флуоресценции клеточных популяций закрытого типа) на значение MFI изотипа. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего значения трех параллельных измерений. (D) экспрессии генов плюрипотентности (Oct4, NANOG, Klf4 и Sox2) с помощью клеток из CL, WJ, CPJ и FP, как определено QRT-PCR. (** р ≤ 0,01 и * р ≤ 0,05). экспрессии генов были нормированы на GAPDH и бета-актин, а Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего значения трех параллельных измерений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 6: мультилинейное Дифференцирование ЦКХ , выделенные из пуповинных, шнура-плацента Junction, и фетальной плаценты. (А) Клетки инкубируют в среде для дифференцировки адипогенной в течение 3 недель и окрашивают Oil Red O, что указывает на наличие липидных капель. (B) Осадок клеток инкубировали в среде для дифференцировки хондрогенной в течение 3 недель. Гистологические криосрезы из гранул культур окрашивали толуидиновый синим, показывая наличие гликозаминогликанов. (С) Клетки инкубируют в остеогенной дифференцировки среде в течение 3 -х недель и окрашивали ализарин красным, показывая производство отложений кальция предлагая минерализацию костей. Все изображения были получены с помощью LM. Шкала бар составляет 100 мкм (увеличение: 4x). BM-MSCs мыповторно использовали в качестве стандарта. (DF) Экспрессия выбранных генов (CEBPβ, FABP4, и PPAR & gamma; SOX9, ACAN и COL2 и COL1, RUNX2, OPN и OCN , представляющий дифференциацию ЦКМ в Adipogenic, хондрогенный и остеогенных родах, соответственно), как определено с помощью анализа QRT-PCR (** р ≤ 0,01 и * р ≤ 0,05). экспрессии генов были нормированы на GAPDH и бета-актин и Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего значения трех параллельных измерений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Ген Последовательности праймеров Длина изделия
OCT4 Прогнозные CCCCTGGTGCCGTGAA 97
Реверс-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </ TD>
NANOG Форвард AAAGAATCTTCACCTATGCC 110
реверс-GAAGGAAGAGGAGAGACAGT
KLF4 Форвард CGAACCCACACAGGTGAGAA 94
реверс-TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC
SOX2 Форвард TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA 75
реверс-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC
SOX9 Форвард AGCGAACGCACATCAAGAC 85
реверс-CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
COL2 Форвард CTCGTGGCAGAGATGGAGAA 252
реверс-CACCAGGTTCACCAGGATTG
БАНКА Форвард AGCCTGCGCTCCAATGACT 103
COL1 Форвард AAGGTCATGCTGGTCTTGCT 114
реверс-GACCCTGTTCACCTTTTCCA
RUNX2 Форвард TGCTTCATTCGCCTCACAAA 111
реверс-AGTGACCTGCGGAGATTAAC
OPN Форвард CATACAAGGCCATCCCCGTT 112
реверс-TGGGTTTCAGCACTCTGGTC
OCN Форвард TAAACAGTGCTGGAGGCTGG 191
реверс-CTTGGACACAAAGGCTGCAC
CEBPβ Форвард TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94
реверс-AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
FABP4 Форвард TTAGATGGGGGTGTCCTGGT 158
реверс-GGTCAACGTCCCTTGGCTTA
PPAR & gamma Форвард GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74
реверс-ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG
GAPDH Форвард ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG 101
реверс-GCCATCACGCCACAGTTTC
ACTIN Форвард AATCTGGCACCACACCTTCTAC 170
реверс-ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

Таблица 1: Список праймеров человек , используемый в данном исследовании.

Discussion

Последние достижения в области исследования стволовых клеток не только улучшить понимание основных процессов развития , но и при условии , многообещающие возможности для использования стволовых клеток в биотехнологической, фармацевтической, клеточной терапии, регенеративной медицины и тканевой инженерии 18, 19, 20. В то время как плюрипотентных ЭСК , выделенные из ранних эмбрионов являются наиболее перспективными, они сталкиваются с техническими проблемами и этическими дилеммами 21, 22, 23. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) , полученные от взрослых клеток обеспечивают альтернативу, но они также сталкиваются с аналогичными техническими проблемами безопасности и 23. Кроме того, иПСК может не быть генетически стабильным или может иметь претерпели генетические изменения, что ограничивает их терапевтическое применение. Стволовые клетки также были представлены в различных послеродовых тисподает в суд и органы. Наиболее распространенными источниками этих ИСС являются костный мозг, жировая и мышечная ткань. Однако, ИСС из послеродовых источников имеют ограниченный рост и дифференцировку потенциала 24, 25. Они также страдают из - за старения и воздействия окружающей среды , стрессы и , таким образом , не всегда являются эффективными для терапевтического применения 26, 27, 28. Это привело нас и другие искать новые источники стволовых клеток, которые являются более наивными, чем ИССЫ.

Мы исследовали перинатальных источники примитивных стволовых клеток в качестве альтернативы ИСС. В этом докладе мы обеспечиваем надежный, надежный и простой метод, чтобы изолировать человек MSCs из образцов пуповинной / плаценты. По сравнению с другими источниками и методами, используемыми для выделения ИСС, этот метод обеспечивает эффективный и неинвазивный метод для выделения больших количеств HIGч качества MSCs. Кроме того, она подчеркивает более высокий рост и дифференцировку потенциала перинатальной MSCs по сравнению с ЦКМ из взрослых источников, таких как BM.

UC прикрепления плода к плаценте является большим органом с различными анатомическими областями, в том числе двух артерий, вен, CL и WJ (ткани, окружающие кровеносные сосуды). Несколько исследований сообщили о выделении ЦКМ от всего мозга, в WJ, или плаценты, с переменным роста и дифференциации потенциалов 25, 29. Тем не менее, на сегодняшний день ни одно исследование не эффективно расследованы и сравнили клетки из разных анатомических областей образца пуповинной / плацентарной. Мы предлагаем здесь систематический и простой метод рассечения UC, CPJ и соединяли FP для изоляции ЦКМ. Мы также покажем, всеобъемлющий и простой протокол для характеристики и оценки качества выделенных клеток путем определения их capabil пролиферацииностей,, а также их самообновления и дифференцировки потенциалов. Этот метод является воспроизводимым и дает большое количество превосходного качества ЦКМ.

Мы обнаружили, что частичное расщепление кусочки ткани 1-2 мм по размеру с использованием коммерческого раствора трипсина воспроизводимо давала клетки из эксплантов, в то время как полное переваривание ткани на отдельные клетки были плохие урожаи изолированных клеток. Тем не менее, в одном из исследований сообщалось , что более крупные эксплантов тканевые UC приблизительно 10 мм по размеру были оптимальными для изоляции 30 клеток. С другой стороны , другое исследование показало, что метод ткани эксплантов приводит к более длительному циклу культуры и снижение выхода клеток по сравнению с методом переваривания фермента 31. В предыдущих докладах, лечение тканей мозга с коллагеназы II и гиалуронидазы, отдельно или после трипсин, были выполнены , чтобы изолировать клетки пуповинной 32, 33 34. Мало того, что есть много различий в методах переваривания ткани мозга до культивирования, но и отдельные клетки оказались неоднородными. Использование жестких ферментов в течение более длительных периодов времени может привести к снижению клеточной мембраны, влияя на адгезию клеток и пролиферацию. Результаты этого метода показали, что частично переваренные эксплантов перинатальной ткани при условии, разрастание клеток, не вызывая обширное повреждение клеток, сохранить жизнеспособность, и получают более высокие количества однородных популяций ЦКМ.

Хотя протокол для рассечения и выделения клеток из эксплантов является прямым, некоторые из шагов, может оказаться сложной задачей. Во-первых, обеспечить соблюдение эксплантов, позволяя их прикрепление к поверхности культуральной колбы. Это может быть облегчено с помощью небольшого количества среды, охватывают только кусочки ткани в течение первых 2 ч культуры, а затем осторожно добавляя оставшуюся среду. Second, ограничить число эксплантов до менее чем 15 процентов T75 колбу. Слишком мало места между частями или слишком много частей в колбы тормозное для клеток отростка. В-третьи, тканевые части, которые не прилипают к поверхности колбы культуры после 3 дней инкубации должны быть переведены в новую колбу для присоединения и культивируют. В-четвертых, кусочки ткани, чтобы культивировать должны быть свободны от остатков клеток, который ингибирует вложение. В-пятых, культивирование больших кусков требует больше среды и не улучшает эффективность нароста клеток. И, наконец, контролировать экспланты культуру тесно, особенно после появления клеток выроста, так как клетки могут быстро стать сливными и дифференцировать в зависимости от источника ткани. Несколько ограничений техников включают в себя отсутствие опыта в рассечении образцов для отделения CL, WJ, CPJ и FP; небольшой размер выборки, что приводит к низкому выходу WJ; и замедленные обработки-образцы должны быть обработаны в течение 2-4 ч сбора до AVOИдентификатор потери в процессе восстановления клеток.

Золотой стандарт для характеристики ЦОГО является способностью прилипать к пластике, образует фибробластический фенотип, и дифференцироваться в нескольких линий. Они также обычно используемые критерии определения MSCs , как описано в ISCT 35. В данном исследовании клетка, выделенная из всех четырех источников были прилипает к пластмассе и имела положительное выражение для маркеров MSC (CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105), но отрицательное выражения для кроветворных маркеров CD45. Кроме того, они выражены антиген лейкоцитов человека (HLA) класса I, но были отрицательны по HLA класса II. По сравнению с BM-ЦКМ, и WJ-КЗЖ-клетки, полученные были выше. Эти результаты согласуются с результатами предыдущих докладов UC полученных МСК 33, 36, 37, 38. Кроме того, наши результаты показали, что Cl-, WJ-, CPJ-, FP-МСК выражается многокультурнойгены потенции, такие как Oct4, NANOG и SOX2; однако, их выражение было ниже , чем у ЭСК, как сообщалось ранее 39. Эти результаты также согласуются с предыдущим исследованием , которое сообщило о экспрессии маркеров плюрипотентности в перинатальных-клетках , полученные 40. Интересно, было отмечено, что экспрессия маркеров плюрипотентных была в CPJ-MSCs выше, чем в клетках, выделенных из других источников. Было также отмечено , что UC-MSCs показал больший потенциал самообновления , чем БМ-ПКЦ 41. Интересно отметить, что, несмотря на сходство в фенотипических характеристиках, клетка, выделенная из четырех источников имели значения переменного ДОВСЕ. Тем не менее, для FP-MSC, за исключением, все они были лучше, чем значения ДОВСЕ БМ-ПКЦ. CPJ-MSCs имели самый высокий CFE значение и скорость пролиферации по сравнению со всеми другими ЦКМ. Кроме того, WJ-и-КЗЖ МСК отображаются более высокие потенциалы дифференциации, чем BM-MSC. CL-MSCs показал наименьшую дифференциациюпотенциал во всех трех линий (т.е. липогенный, хондрогенный и остеогенных), тогда как CPJ-MSCs имели самый высокий потенциал дифференциации trilineage и FP-МСК отображается наименьшее Adipogenic дифференциации потенциал.

В заключение, наши результаты показали, что качество и количество изолированных ЦКМ различались между четырьмя источниками в образце пуповинной / плацентарной. CPJ-MSCs имели больше возможностей распространения и более самообновлению потенциал. Они также были мощными в их дифференциации в типы trilineage клеток. Из-за их низкой время удвоения КЗЖ-МСК может быть быстро расширяется в 1000 раз и используется для высокой пропускной способности лекарственного средства или биоматериала скрининга. Эти клетки могут быть более перспективным источником для клеточной терапии и применения регенеративной медицины.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Исследование было поддержано НУ-WB ISCRM, Университет Oakland и Мичиган головы и позвоночника института. N Биравола и C Мак-Ки получили премию исследований проректора Graduate из Oakland University. Мы ценим S Бакши за просмотр рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM with 4,500 mg/mL glucose Invitrogen 11995065
FBS Aleken Biologicals FBSS500
Isobutyl-methylxanthine Sigma I5879-250mg
Dexamethasone Sigma D4902-100mg
Insulin Prospec CYT-270
Indomethacin Sigma I7378-5G
TGFβ1 Prospec CYT-716
Ascorbic acid Sigma A-7631
Ascorbate 2-phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate Sigma G-6251
TrypLE Invitrogen 50591419
GeneJET RNA purification kit Thermo Scientific K0732
DNase Promega M6101
iScript kit Biorad 1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit Biorad 1725274
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943
OCT Thermo Scientific SH75-125D
Oil Red O  American MasterTech Scientific STORO100
Toluidine blue Thermo Scientific S71363
Crystal violet Sigma C3886
Alizarin red stain Thermo Scientific S25131
APC Mouse anti-Human CD29 BD Biosciences  559883
APC Mouse anti-Human CD34 BD Biosciences  555824
FITC Mouse anti-Human CD44 BD Biosciences  555478
FITC Mouse anti-Human CD45 BD Biosciences  555482
APC Mouse anti-Human CD73 BD Biosciences  560847
FITC Mouse anti-Human CD90 BD Biosciences  561969
APC Mouse anti-Human CD105 BD Biosciences  562408
Centrifuge IEC 93522M-2
CO2 incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i
Light microscope (LM) Nikon Instruments Inc. Olympus
Hemacytometer Thermo Scientific 0267151B
Cryostat Leica CM3050 S
FACS Canto II and Diva Software BD Biosciences  Canto II 
Thermocycler MJ Research Inc. PTC-100
Real-Time PCR System  Bio-Rad CFX96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1 (2015).
  2. English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
  3. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029 (2014).
  4. Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).
  5. Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10 (2013).
  6. Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24 (2012).
  7. Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
  8. Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425 (2013).
  9. Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
  10. Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215 (2015).
  11. Kim, D. W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  12. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
  13. Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
  14. Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
  15. Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134 (2013).
  16. Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).
  17. Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  18. Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
  19. Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
  20. Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
  21. Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
  22. Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
  23. Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
  24. Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
  25. Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
  26. Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
  27. Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).
  28. Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
  29. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  30. Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
  31. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
  32. Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).
  33. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
  34. Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
  35. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  36. Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
  37. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  38. Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487 (2011).
  39. Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
  40. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
  41. Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).

Tags

Онтогенез выпуск 122 перинатальные пуповины шнур-плацента ответвительный плацента мезенхимальные стромальные клетки маркеры MSC клетки Мультипотентных плюрипотентные маркеры
Выделение и характеристика мезенхимальных стромальных клеток из пуповинной и фетальной плаценты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri,… More

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri, A., Mikhael, S., Brown, C., Perez-Cruet, M., Chaudhry, G. R. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. J. Vis. Exp. (122), e55224, doi:10.3791/55224 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter