Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la dissezione di cordone umano ombelicale (UC) e il campione placenta fetale in cavo rivestimento (CL), gelatina di Wharton (WJ), cavo-placenta giunzione (CPJ), e placenta fetale (FP) per l'isolamento e caratterizzazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) utilizzando la tecnica di espianto.
Abstract
Il cordone ombelicale umano (UC) e la placenta sono fonti non invasivi, primitive e abbondanti di cellule stromali mesenchimali (MSC) che hanno sempre guadagnato l'attenzione perché non si pongono alcun problema etico o morale. attuali metodi per isolare MSC da UC producono basse quantità di cellule con potenziali proliferazione variabili. Poiché UC è un organo anatomicamente complessa, differenze nelle proprietà MSC possono essere causa delle differenze nelle regioni anatomiche del loro isolamento. In questo studio, abbiamo prima sezionato campioni cavo / placenta in tre distinte regioni anatomiche: UC, cordonato placenta giunzione (CPJ), e placenta fetale (FP). In secondo luogo, due zone distinte, rivestimento cavo (CL) e gelatina di Wharton (WJ), sono stati separati. La tecnica di espianto è stato poi utilizzato per isolare le cellule dai quattro fonti. Il tempo necessario per la coltura primaria di cellule da espianti varia a seconda della fonte del tessuto. Conseguenza delle cellule si è verificato entro 3 - 4 days degli espianti CPJ, mentre la crescita è stata osservata dopo 7 - 10 giorni e 11 - 14 giorni dalla CL / WJ e FP espianti, rispettivamente. Le cellule isolate sono aderenti alla plastica e visualizzati morfologia e superficie marcatori fibroblastoide, come CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105, in modo simile a midollo osseo (BM) MSC -derived. Tuttavia, l'efficienza di formazione di colonie delle cellule varia, con CPJ-MSC e WJ-MSC mostra un'efficienza più elevata BM-MSC. MSC da tutte le quattro sorgenti differenziare in adipogenico, condrogenica, e linee osteogenico, risultava che erano stati multipotenti. CPJ-MSC differenziata più efficiente rispetto ad altre fonti MSC. Questi risultati suggeriscono che il CPJ è la regione anatomica più potente e produce un numero elevato di celle, con maggiore capacità di proliferazione e di auto-rinnovamento in vitro. In conclusione, l'analisi comparativa delle MSC dalle quattro fonti indicato che CPJ è una fonte più promettente di MSC per terapia cellulare, regenerative la medicina e l'ingegneria dei tessuti.
Introduction
Le cellule staminali sono presenti in vari organi e tessuti del corpo. Possiedono potenziale rigenerativo e svolgono un ruolo importante nella riparazione dei tessuti danneggiati nel corpo per tutta la durata della vita umana 1, 2. Questo ha generato un grande interesse in cellule staminali adulte (CSA), tanto più che, a differenza delle cellule staminali embrionali (ESC), l'uso di ASC non pongono dilemmi morali ed etici. Diversi studi hanno riportato l'isolamento di ASC, come le cellule mesenchimali stromali (MSC); cellule staminali ematopoietiche (CSE); e diversi progenitori, tra cui varie fonti adulti che vanno dal midollo osseo (BM) per il tessuto adiposo (AT) e polpa dentale 3, 4, 5. Tuttavia, il numero di ASC presenti nella maggior parte delle nicchie adulti è limitato, e il loro isolamento comporta generalmente una procedura invasiva e dolorosa con eventuale donatoremorbilità del sito. Inoltre, l'età del donatore e lo stress ambientale potrebbe anche svolgere un ruolo significativo nel determinare la qualità e l'attività biologica delle cellule isolate 6, 7, 8. ASC visualizzare anche proliferazione limitata e potenziale di differenziazione durante la coltura in vitro.
Per ovviare a questi svantaggi di ASC attuale, nuove fonti sono stati perseguiti per isolare le cellule staminali. Questi sforzi hanno portato all'isolamento di cellule staminali da fonti perinatali, compreso sangue del cordone, tessuto del cordone, placenta e liquido amniotico 9. Queste fonti hanno guadagnato l'attenzione a causa della loro facile ed abbondante disponibilità di 10, 11, 12, 13. Inoltre cellule, tessuti perinatali possono essere ottenuti in modo non invasivo, e derivano da essi derivati sonopiù primitivo di ASC isolate da fonti adulti 14, 15. Essi sono isolati dai tessuti ottenuti alla nascita e sono considerati hanno subito alterazioni minime nel genoma causa dell'invecchiamento e ambientali sollecitazioni 16.
Tuttavia, le caratteristiche riportate di cellule staminali da fonti perinatali e il loro potenziale di auto-rinnovano nonché di differenziare variano ampiamente 11, 17. Questo potrebbe essere in parte dovuto al fatto che il cordone ombelicale umano (UC) è un organo complesso. Ipotizziamo che le regioni discrete di tessuto perinatale creano nicchie specifiche responsabili delle variazioni e natura più primitiva di queste cellule staminali rispetto a ASCs derivati da fonti non perinatali. Questo studio descrive la dissezione dei campioni cavo / placenta in tre distinte regioni anatomiche: UC, giunzione cavo-placenta (CPJ), und placenta fetale (FP). La UC è stato ulteriormente sezionato in due zone: rivestimento cavo (CL) e gelatina di Wharton (WJ). Analisi delle cellule isolate da CL, WJ, CPJ, e FP dimostrato che tutti mostravano morfologia fibroblastoide ed espressi marcatori MSC, ma differiva nella loro auto-rinnovamento e potenziale di differenziazione. cellule CPJ-derivati hanno mostrato un più alto tasso di proliferazione e di auto-rinnovamento potenziale rispetto alle UC-e cellule FP-derivati, che li rende una fonte più promettente per la terapia cellulare, la medicina rigenerativa e ingegneria dei tessuti.
Protocol
I campioni (n = 3) sono stati ottenuti dal consenziente, donatori sani attraverso il Beaumont Hospital BioBank, Royal Oak, MI e il Providence Hospital, Southfield, MI sotto HIC- (HIC # 2012-101) e IRB- (IRB # 820662- 3), rispettivamente, approvato protocolli e trattati come approvato dalla IBC (# 2858) di Oakland University, Rochester, MI.
Cord 1. Elaborazione ombelicale, Junction Cord-placenta, e fetale placenta e celle isolamento
- Asetticamente raccogliere campioni di UC circa 10 cm di lunghezza, con 5 - 6 centimetri collegati al CPJ e 3 - 4 cm di FP. Porre immediatamente ogni campione in un mezzo bicchiere di raccolta contenente (DMEM con 4.500 mg / glucosio mL e soluzione antibiotica (0,1% gentamicina, 0,2% streptomicina e 0,12% penicillina)) e conservare a 4 ° C fino a quando non viene trasportato al laboratorio da immissione sul ghiaccio in una scatola di polistirolo. Elaborare il campione a 4 ° C entro 2 - 4 ore di raccolta.
- Trasferire il campione in un 150 mm Petri conservata aghiaccio in un armadio biosicurezza. Utilizzando un ago e la siringa, sciacquare più volte con PBS ghiacciato per rimuovere i coaguli di sangue. Assicurarsi che il campione è mantenuto umido con PBS durante la lavorazione e non lasciare asciugare. Per mantenere la sterilità, gestire l'asetticamente campione utilizzando strumenti PBS e chirurgici in autoclave per tutta l'elaborazione del campione.
- esaminare attentamente il campione per identificare diverse regioni anatomiche: UC, CPJ e FP. In primo luogo sezionare il UC. Tenere l'estremità fetale della UC con una pinza e con attenzione fare il primo taglio proprio in cima della CPJ usando un paio di forbici. Rendere il secondo taglio al di sotto della CPJ per separare il CPJ (1,5 - 2,0 cm) dalla FP. Posizionare il separato UC, CPJ, e FP in piastre Petri separati per l'ulteriore elaborazione.
- Tagliare il UC longitudinalmente con l'aiuto di forbici e pinze, esponendo completamente i vasi sanguigni e circondante WJ senza disturbare l'epitelio.
- Raschiare la WJ lontano dai vasi sanguigni e epitelio interna del subamnionutilizzando un bisturi, e quindi rimuovere i vasi sanguigni. Assicurarsi di raccogliere eventuali residui perivascolare WJ sotto e intorno ai vasi sanguigni, e posizionare il WJ raccolto in una capsula di Petri separato.
- Raccogliere il tessuto rimanente, rivestimento cavo (CL), in una piastra di Petri separato.
- Dopo la separazione dei tessuti rappresentano CL, WJ, CPJ, e FP, sostituire il PBS con 3 - 5 mL di soluzione tripsina commerciale e separatamente tagliare singoli tessuti in 1- a pezzi 2 mm usando forbici.
- Incubare i pezzi di tessuto in soluzione tripsina commerciale a 37 ° C per 30 minuti in un incubatore CO 2 5% per la digestione parziale dei campioni. Osservare la digestione parziale visualizzando rilascio di cellule utilizzando un microscopio a contrasto di fase.
- Per i campioni parzialmente digeriti, aggiungere un uguale volume di coltura (CM; DMEM con 4.500 mg / glucosio ml e 2 mM L-glutammina, supplementato con 10% di siero umano / FBS e soluzione antibiotica (0,1% gentamicina, 0,2% streptomicina e 0,12% penicillin)) per neutralizzare la soluzione tripsina commerciale. Trasferire il contenuto in provette da centrifuga da 50 mL e lasciare che i pezzi di tessuto parzialmente digerito depositano per 3 min.
- Aspirare accuratamente il surnatante, comprese le cellule singole (che non si espandono in modo efficiente), e piastra 15 - 20 parti di tessuto parzialmente digerite su un 75-cm pallone di coltura tissutale 2 e aggiungere 9 ml di CM. Incubare a 37 ° C e non disturbare i palloni di coltura per 2 - 3 giorni per consentire l'adesione dei pezzi di tessuto.
NOTA: La parte rimanente dei campioni di tessuto parzialmente digerito può essere crioconservati per il futuro isolamento delle cellule. - Dopo 3 giorni di incubazione, cambiare la CM e cerca la comparsa di conseguenza di cellule dal espianto su base giornaliera; crescita cellulare dovrebbe essere chiaro da espianti aderenti dopo 3 - 4 giorni, 7 - 10 giorni, e 11 - 14 giorni di incubazione per CPJ, CL / WJ, e FP, rispettivamente. Da questo punto in poi, modificare la CM dopo ogni 3 giorni o comenecessario.
NOTA: la crescita delle cellule raggiunge il 70% di confluenza 7 - 10 giorni dopo la conseguenza cellula iniziale dalla espianto. Si noti che i pezzi di tessuto non aderenti non danno luogo ad alcuna conseguenza cella finché non aderiscono alla plastica. Bisogna fare attenzione affinché la muffola non è disturbato in modo da evitare il distacco dei pezzi di tessuto aderenti. Se ci sono parti galleggianti dopo i primi 3 giorni di coltura, possono essere recuperati trasferendoli in un pallone per il fissaggio.
NOTA: quando la crescita delle cellule da espianti di tessuto raggiunge il 70% di confluenza, dovrebbero essere subcolturati. Come detto sopra, MSC da CL / WJ, FP, CPJ e raggiungere la confluenza di 10 - 14 giorni, 14 - 20 giorni, e 17 - 24 giorni, rispettivamente. - Per eseguire sottocolture cellule superato di dagli espianti, dissociare le celle utilizzando 1 - 2 mL di soluzione di tripsina commerciali / 75-cm pallone da 2 cultura e incubare a 37 ° C per 3 min. Neutralizzare con 1 - 2 ml di CM e centrifugare 1.500 xg per 3 min. RendereAssicurarsi di ruotare il pallone, mentre l'aggiunta di tripsina per distribuzione uniforme in tutto.
- NOTA: Le cellule in pellet sono considerati passaggio 0 (P0) e saranno sospesi in CM, contate, e subcoltivate ad una densità di semina di 1 x 10 4 / cm 2 per l'amplificazione, la caratterizzazione e crioconservazione. Le cellule in eccesso possono essere crioconservati a P0.
2. che caratterizzano le cellule isolate
- Formanti colonia efficienza (CFE) assay
- Cappotto piatti da 100 mm Petri (superficie di 60 cm 2) con 0,1% di gelatina per 30 minuti e metterli in incubatore CO 2 a 37 ° C.
NOTA: Sebbene non necessario, gelatina rivestimento migliora aderenza cellulare. - Rimuovere l'eccesso di gelatina e inseminare la piastra rivestita con cellule P0 alla concentrazione di 1.63 cellule / cm 2. Aggiungere 3 ml di CM e incubare nell'incubatore di CO 2 a 37 ° C.
- Monitorare le piastre seminate di crescita clonaleal microscopio ottico (LM) e cambiare il mezzo di ogni 3 giorni.
- Dopo 10 - 14 giorni di crescita cellulare, lavare i piatti Petri due volte con PBS e fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Paraformaldeide è tossico. Si prega di praticare prudenza indossando guanti e occhiali durante l'uso. - Macchiare le cellule fissate con cristal violetto 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente e lavare la piastra con acqua di rubinetto fino alla colorazione blu non legato è andato.
- Contare il numero di colonie composte da almeno 50 cellule usando LM.
- Cappotto piatti da 100 mm Petri (superficie di 60 cm 2) con 0,1% di gelatina per 30 minuti e metterli in incubatore CO 2 a 37 ° C.
- Espressione di marcatori di superficie cellulare
- Coltura le cellule isolate al 70% di confluenza, dissociare con la soluzione di tripsina commerciale, e lavare e pellet per centrifugazione a 1.500 xg per 3 min. Sospensione le cellule in tampone FACS (PBS 1x con 2% FBS e 0,1% sodio azide).
NOTA: La sodio azide è tossica. Si prega di praticare prudenza indossando guanti e occhiali durante l'uso.
- Coltura le cellule isolate al 70% di confluenza, dissociare con la soluzione di tripsina commerciale, e lavare e pellet per centrifugazione a 1.500 xg per 3 min. Sospensione le cellule in tampone FACS (PBS 1x con 2% FBS e 0,1% sodio azide).
- Centrifugare le cellule colorate a 670 xg per 5 min, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone FACS.
- Analizzare le cellule colorate con anticorpo usando FACS secondo il protocollo del produttore.
3. Differenziazione Potenziale
- differenziazione adipogenico
- Coltura le cellule isolate al 70% di confluenza, dissociare con la soluzione di tripsina commerciale, e lavare e pellet per centrifugazione a 1.500 xg per 3 min.
- In un incubatore CO 2 a 37 ° C, coltivare le cellule ad una concentrazione di 100.000 cellule / pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenente 2 ml di CM.
- Dopo 24 ore, sostituire la CM con adipogterreno di differenziamento ENIC (0,5 uM isobutil-metilxantina, 1 pM desametasone, 10 pM di insulina, e 200 pM indometacina) ed incubare. Cambiare il mezzo di differenziazione ogni 3 giorni o più spesso necessario.
- Dopo 3 settimane di incubazione, fissare le cellule con 2 ml di paraformaldeide al 4% per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente e macchia con Oil Red O per rilevare la produzione di goccioline lipidiche al fine di analizzare per la differenziazione adipogenico.
NOTA: Paraformaldeide è tossico. Si prega di praticare prudenza indossando guanti e occhiali durante l'uso. - Trattare le cellule fissate con isopropanolo al 60% (2 ml / pozzetto della piastra da 6 pozzetti) per 5 min.
- Sostituire l'isopropanolo con 2 mL di olio rosso o macchia (filtro 3 parti olio rosso o macchia e 2 parti di acqua distillata), incubare per 15-30 minuti a temperatura ambiente, e lavare 3 - 4 volte con acqua di rubinetto per rimuovere eventuali macchie non legato .
- Visualizzare le goccioline lipidiche macchiate di rosso, indicativi della linea cellulare adipogenico, ucantare LM.
- differenziazione condrogenico
- cellule di coltura isolato al 70% di confluenza, dissociano con la soluzione di tripsina commerciale, e lavare con PBS.
- A pellet cellule per induzione condrogenica, centrifuga 250.000 cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml con 2 ml di CM a 11.000 xg per 8 min. Incubare le pastiglie notte a 37 ° C.
- Dopo 24 h, sostituire delicatamente il CM con mezzo condrogenica differenziazione (20 ng TGFβ1, 10 ng insulina, 100 nM desametasone, e 100 pM acido ascorbico) senza disturbare il pellet e continuare l'incubazione. Cambiare il mezzo di differenziazione ogni 3 giorni o più spesso necessario.
- Dopo 3 settimane di incubazione, fissare le cellule con 2 ml di paraformaldeide al 4% per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Cryosection e macchia con 1% blu di toluidina per esaminare la presenza o la produzione di matrice extracellulare per determinare differenziazione condrogenico.
NOTA: Paraformaldehyde è tossico. Si prega di praticare prudenza indossando guanti e occhiali durante l'uso. - Per criosezionamento, lavare delicatamente i pellet cellulari raccolti due volte con PBS e fissare con 1 mL di paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Paraformaldeide è tossico. Si prega di praticare prudenza indossando guanti e occhiali durante l'uso. - Lavare il pellet due volte con PBS per rimuovere la paraformaldeide e trasferire in una soluzione di saccarosio / OCT (1: 2, 20% Saccarosio: OCT). Incubare a temperatura ambiente per 24 h per permettere la soluzione di penetrare completamente nelle pellet cellulari; questo permetterà di sezionamento liscia.
- Trasferire il pellet negli stampi OCT. Congelare gli stampi a -20 ° C per 4 - 6 he cryosection circa 10 - 12 sezioni micron di spessore dei pellet cellulari utilizzando un criostato di blu di toluidina colorazione.
- Lavare le criosezioni delicatamente con PBS; aggiungere qualche goccia di 1% blu di toluidina macchia, coprono sezioni pellet sul vetrino completamente; e incUbate per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini con PBS più volte per Decolorare. Rimuovere l'eccesso di colorante immergendo il vetrino in soluzione alcolica a base di acido cloridrico (95% di alcol + 0,5 mL di HCl) più volte fino a quando il colore blu non legato è andato. Montare le sezioni colorate con 100 ml di soluzione per la conservazione a lungo termine delle diapositive di montaggio.
NOTA: La colorazione blu delle sezioni indica la presenza di glicosaminoglicani e glicoproteine e sarà osservabile utilizzando LM.
- differenziazione osteogenico
- Ancora una volta, coltura le cellule isolate al 70% di confluenza, dissociare con la soluzione di tripsina commerciale, e lavare e pellet per centrifugazione a 1.500 xg per 3 min.
- Sottocultura le cellule ad una concentrazione di 100.000 cellule / pozzetto di piastre da 6 pozzetti contenente 2 ml di CM in un incubatore CO 2 a 37 ° C.
- Dopo 24 ore, sostituire la CM con il mezzo di differenziazione osteogenico (0,1 μ, M desametasone, 10 uM β-glicerofosfato, e 50 uM ascorbato fosfato) e proseguire l'incubazione. Cambiare il mezzo di differenziazione ogni 3 giorni o più spesso necessario.
- Dopo 3 settimane di incubazione, fissare le cellule con 2 ml di paraformaldeide al 4% per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente e macchia con rosso alizarina per rilevare la presenza di una deposizione di calcio per determinare differenziazione osteogenico.
NOTA: Paraformaldeide è tossico. Si prega di praticare prudenza indossando guanti e occhiali durante l'uso. - lavare delicatamente le cellule fissate due volte con acqua distillata e trattare con 2% di alizarina macchia rossa (2 mL / pozzetto in una piastra da 6 pozzetti) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
- Rimuovere l'eccesso di colorante lavando delicatamente con acqua di rubinetto in modo che i depositi di calcio non sloggiare.
- Visualizza i depositi macchiate di rosso calcio utilizzando LM.
4. Quantitative trascrittasi inversa della polimerasi ChaReaction (qRT-PCR) Analisi
- Coltura le cellule isolate al 70% di confluenza, dissociano con la soluzione di tripsina commerciale, lavare, e pellet per centrifugazione a 1.500 xg per 3 min per isolare l'RNA cellulare totale.
- Lavare le cellule con PBS per rimuovere le tracce di FBS, e quindi procedere all'isolamento RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA commerciale, seguendo le istruzioni del produttore.
- Purificare il RNA totale isolato per trattamento con DNasi a 37 ° C per 30 minuti usando un termociclatore. Sintetizzare cDNA utilizzando il kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore.
- Preparare reazioni triplicate 10 microlitri PCR in una piastra a 96 pozzetti, con ogni reazione contenente 5 ml di SYBR-verde PCR Supermix; 3 ml di acqua bidistillata; 0,5 ml di ciascun primer, avanti e indietro; e 1 ml di (1,10) cDNA diluito.
- Eseguire una PCR con i seguenti parametri: 10 min a 98 ° C, seguita da 44 cicli di 30 s ciascuno a 98 &# 176; C, 20 s a 60 ° C e 30 s a 72 ° C.
- Normalizzare l'amplificazione dei geni bersaglio ai geni di riferimento, GAPDH e β-actina; le sequenze dei primer sono elencati nella Tabella 1.
5. Analisi statistica
- Eseguire tutte le analisi usando un software statistico. Presentare i dati come media ± SEM. Risultati con un p-value (** p ≤ 0,01 e * p ≤ 0,05) sono stati considerati statisticamente significativi.
Representative Results
Dissezione e Isolamento di cellule da cordone ombelicale umano, Svincolo Cord-placentare e fetale Placenta
tessuto perinatale consiste di tre regioni anatomiche discrete. Il primo è il UC, contenente due arterie e una vena, e due zone distinte: CL (il rivestimento esterno del cavo) e WJ (il materiale gelatinoso che circonda i vasi sanguigni all'interno del cordone). Il secondo è CPJ (il collegamento tra il cavo e la placenta), ed il terzo è FP, che è immediatamente dopo il CPJ (il cavo inserisce nella placenta, che è attaccato alla parete uterina della madre). Lo schema del protocollo isolamento di cellule da tessuto perinatale è illustrato in Figura 1. Le quattro fonti-CL, WJ, CPJ e FP-sono chiaramente identificabili e sono state separate per isolare le cellule dagli espianti, come mostrato in figura 2. Tha l'aspetto di escrescenza cellulare da culture espianto è stato regolarmente monitorato e registrato da LM. sono state osservate cellule fibroblastoide aderenti dopo 3-4 giorni di coltura degli espianti CPJ. Cellule con morfologia simile apparvero 7-8, 9-10 e 11-14 giorni dopo coltura espianti WJ, CL, e FP, rispettivamente. La conseguenza di celle da espianti rappresentano le varie fonti (CL, WJ, CPJ, e PQ) è illustrato in Figura 3A. Queste cellule sono state considerate P0. Quando le cellule sono state P0 sottocoltura, sono apparsi a crescere clonale, la visualizzazione di una morfologia fibroblastoide simile a quella del BM-MSC. Tuttavia, hanno esibito variazione nella popolazione raddoppiamento tempo, che varia da 32 ore a 94 h per cellule da CPJ e FP, come mostrato in Figura 3B e C. Le cellule da WJ e CL avevano simili cicli di raddoppio mediale CPJ e FP. Ulteriori analisi delle cellule P0 indicato che variavano anche nel CFE, che vanno da 16 a 92 colonie.Le cellule del CPJ avuto il più alto (92), mentre le cellule FP hanno avuto il più basso (16) CFE. Celle dal CL e WJ avevano valori CFE di 59 e 80 colonie, rispettivamente (Figura 4A) -C. Le cellule da CL avevano valori CFE simili al BM-MSC. Questi risultati suggeriscono che le cellule derivate da CPJ hanno capacità proliferative e di auto-rinnovamento più elevati.
Immunoprofile delle cellule isolate
Cellule isolate dal CL, WJ, CPJ e FP sono stati studiati per l'espressione di marcatori specifici delle cellule. Cellule P3-5 visualizzati positiva espressione per MSC marcatori quali CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105 (Figura 5A e B). Queste cellule sono anche noti per esprimere maggiore di istocompatibilità di classe I Marker, HLA-ABC, e non esprimono classe II marcatore, HLA-DR 3. Le percentuali di cellule positive per °ese marcatori selezionati da tutte le quattro sorgenti erano simili a quella espressa dalla norma BM-MSC. Tuttavia, i rapporti IFM indicano che WJ e cellule CPJ-derivati sono quasi simili e sono addirittura superiore CL- e cellule FP-derivati (Figura 5C). È interessante notare che, nonostante diversi valori CFE, tutte le celle provenienti da fonti diverse esprimono livelli simili di marcatori MSC. Sulla base dei risultati di marcatori di superficie cellulare, le cellule isolate da tutte le quattro sorgenti sono state considerate MSC. Ulteriori analisi di queste cellule ha rivelato che essi esprimono anche geni pluripotenziali, OCT4, NANOG, Klf4 e SOX2, come mostrato in Figura 5D. CPJ-MSC aveva la più alta espressione di marcatori pluripotenza, seguita da WJ, CL- e FP-MSC.
Differenziazione potenziale di cellule staminali mesenchimali isolate
Il gold standard per la caratterizzazione MSC è la loro capacità di differentiate in molteplici linee. I nostri risultati hanno dimostrato che le MSC isolate da tutte le fonti perinatali facilmente in tipi di cellule adipogenici, condrogeniche e osteogeniche. Derivati adipogenici prodotte goccioline lipidiche che sono stati macchiati positivamente con olio rosso o, come mostrato nella Figura 6A. Blu di toluidina colorazione del derivato condrogenico delle MSC dimostrato la presenza di proteoglicani e glicoproteine che aiutato nella produzione di matrice extracellulare (Figura 6B). Derivati osteogeniche delle MSC colorate positivamente con il rosso di alizarina indicano la presenza dei depositi di calcio coinvolte nella mineralizzazione dell'osso, come illustrato nella Figura 6C.
Come previsto, l'analisi trascrizionale delle MSC isolate da tutte le fonti mostrato differenziazione trilineare (Figura 6D -F). Tuttavia, il piattoziale di differenziazione varia a seconda della fonte di MSC. derivati adipogenici di WJ-MSC avevano 2 volte superiori livelli di espressione dei geni selezionati (adipogenici CEBPβ, FABP4, e PPAR) rispetto al CPJ-MSC. CL- e FP-MSC avevano l'espressione più basso di questi geni. Nel caso di differenziazione condrogenica, derivati CPJ-MSC espressi selezionati geni condrogeniche (SOX9 e COL2) 50 volte superiori ai derivati WJ e FP-MSC. Simile alla scarsa differenziazione adipogenica di Cl-MSC, avevano minor potenziale condrogenica, come evidente dalla espressione inferiore di geni condrogeniche. CPJ-MSC ha anche mostrato il più alto potenziale di differenziazione osteogenico, come indicato dalle 2 volte più alti livelli di trascrizione di geni selezionati osteogeniche (COL1, OPN e OCN). Tuttavia, l'espressione del marcatore progenitore RUNX2 era più alta nei derivati osteogeniche di WJ-MSC, indicando che queste cellule erano lenti nel rispondere alle condizioni di differenziazione. Ancora una volta, CL-MSC ha mostrato scarsadifferenziazione in linea osteogenica. Questi risultati suggeriscono che la CPJ-MSC e WJ-MSC visualizzati maggiore potenziale di differenziazione di CL e FP-MSC. Il CL-MSC aveva il potenziale più basso di differenziarsi in derivati trilineare.
Figura 1: Schema di isolamento delle cellule da Cordone ombelicale, Junction Cord-placenta, e fetale placenta. Ispezionare il campione raccolto e procedere con la dissezione. Passo 1. dissezionare manualmente e separare il campione di cordicella / placenta in tre regioni distinte: cordone ombelicale (UC), giunzione cavo-placenta (CPJ), e placenta fetale (FP). Separare le due zone distinte della UC in rivestimento cavo (CL) e di gelatina di Wharton (WJ) usando forbici e pinze. Fase 2. Tagliare singoli tessuti sezionati separatamente in 1- to pezzi da 2 mm usando forbici e parzialmente digerire i pezzi. Fase 3. Cultura i pezzi di tessuto. Fase 4. isolare le cellule dalle espianti dal trattamento con tripsina. Subcultura e caratterizzare le cellule isolate. Passo 5. cellule isolato e caratterizzato possono essere amplificati e utilizzati per diverse applicazioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dissezione e cultura di espianti da Cordone ombelicale, Junction Cord-placenta, e fetale placenta. sono mostrate tre diverse regioni anatomiche del campione di cordicella / placenta: UC (split nella CL e WJ), CPJ, e FP, così come le arterie e le vene associato. CL, WJ, CPJ,e FP sono stati separati mediante dissezione manuale per isolare le cellule dagli espianti. Ciascuna delle regioni sezionato stato tagliato separatamente in piccoli frammenti e coltivate in 75 cm 2 piastre usando 9 mL di CM. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Morfologia delle cellule isolate da Cordone ombelicale, Junction Cord-placenta, e fetale placenta. (A) escrescenza cellulare da espianti di Cl, WJ, CPJ, e FP, come visualizzato da LM. (B) Sottocultura delle cellule isolate da CL, WJ, CPJ, e espianti FP mostrato morfologia fibroblastoide. La barra della scala rappresenta 100 um (ingrandimento: 4X). (C) Popolazione tempo di raddoppio tisolò le cellule da CL, WJ, CPJ, e FP. BM-MSC sono stati utilizzati come standard. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media delle misurazioni in triplicato (** p ≤ 0,01 e * p ≤ 0,05). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: formante colonia efficienza delle celle da Cordone ombelicale, Junction Cord-placenta, e fetale placenta. (A) La crescita delle cellule (P0) isolati da CL, WJ, CPJ, e FP, piastrate alla densità clonale di 1.63 cellule / cm 2, sono state visualizzate mediante LM. (B) microfotografie di cellule colorate con cristalvioletto visualizzazione capacità di formazione di colonie. (C) colonia singola di cellule spirito macchiatocristalvioletto h. Le barre rappresentano scala 100 um (ingrandimento: 4X). (D) Rappresentazione grafica del numero di colonie formate dalle cellule derivate da CL, WJ, CPJ e FP. BM-MSC sono stati utilizzati come standard. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media delle misurazioni in triplicato (** p ≤ 0,01 e * p ≤ 0,05). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi del MSC marker espresse dalle cellule isolate da Cordone ombelicale, Junction Cord-placenta, e fetale placenta. (A) Espressione dei marcatori di superficie mesenchimali (CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105) dalle cellule da CL, WJ, CPJ, e FP, come deterrenteminato mediante citometria di flusso. (B e C) Rappresentazione grafica delle percentuali di cellule positive ed i rapporti mediani intensità di fluorescenza (MFI) per i marcatori di superficie mesenchimali selezionati. coefficienti IFM sono stati calcolati dividendo il valore MFI del marcatore (generato dal software basato sull'intensità di fluorescenza di popolazioni cellulari gated) per il valore MFI di isotipo. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media delle misurazioni in triplicato. (D) Espressione dei geni pluripotenziali (OCT4, Nanog, Klf4 e SOX2) dalle cellule da CL, WJ, CPJ, e FP, come determinato mediante qRT-PCR. (** p ≤ 0,01 e * p ≤ 0,05). L'espressione genica è stata normalizzata a GAPDH e β-actina, e le barre di errore rappresentano l'errore standard della media delle misurazioni in triplicato. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: multilineage Differenziazione delle MSC isolate dal cordone ombelicale umano, Junction Cord-placenta, e fetale placenta. (A) Le cellule sono state incubate in un mezzo di differenziazione adipogenico per 3 settimane e colorate con Oil Red O, indicando la presenza di goccioline lipidiche. (B) I pellet cellulari sono state incubate in terreno di differenziamento condrogenica per 3 settimane. criosezioni istologici di culture pellet sono state colorate con blu di toluidina, visualizzando la presenza di glicosaminoglicani. (C) Le cellule sono state incubate in un mezzo di differenziazione osteogenico per 3 settimane e colorate con alizarin rosso, mostrando la produzione di depositi di calcio che suggeriscono la mineralizzazione delle ossa. Tutte le immagini sono state ottenute da LM. La barra della scala rappresenta 100 um (ingrandimento: 4X). BM-MSC siamoabituati come standard. (DF) Espressione dei geni selezionati (CEBPβ, FABP4 e PPARy; SOX9, ACAN e COL2 e COL1, RUNX2, OPN e OCN rappresenta la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in adipogenico, condrogenica, e linee osteogeniche, rispettivamente), come determinato da qRT-PCR (** p ≤ 0,01 e * p ≤ 0,05). L'espressione genica è stata normalizzata a GAPDH e β-actina, e barre di errore rappresentano l'errore standard della media delle misurazioni in triplicato. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Gene | Sequenze Primer | Lunghezza del prodotto |
| OCT4 | Forward-CCCCTGGTGCCGTGAA | 97 |
| Reverse-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG | </ Td> | |
| NANOG | AAAGAATCTTCACCTATGCC forward | 110 |
| GAAGGAAGAGGAGAGACAGT inversa | ||
| Klf4 | forward CGAACCCACACAGGTGAGAA | 94 |
| reverse TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC | ||
| SOX2 | TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA forward | 75 |
| reverse CTGGGGCTCAAACTTCTCTC | ||
| SOX9 | forward AGCGAACGCACATCAAGAC | 85 |
| reverse CTGTAGGCGATCTGTTGGGG | ||
| COL2 | forward CTCGTGGCAGAGATGGAGAA | 252 |
| reverse CACCAGGTTCACCAGGATTG | ||
| UNA LATTINA | AGCCTGCGCTCCAATGACT forward | 103 |
| COL1 | AAGGTCATGCTGGTCTTGCT forward | 114 |
| reverse GACCCTGTTCACCTTTTCCA | ||
| RUNX2 | forward TGCTTCATTCGCCTCACAAA | 111 |
| reverse AGTGACCTGCGGAGATTAAC | ||
| OPN | forward CATACAAGGCCATCCCCGTT | 112 |
| reverse TGGGTTTCAGCACTCTGGTC | ||
| OCN | TAAACAGTGCTGGAGGCTGG forward | 191 |
| reverse CTTGGACACAAAGGCTGCAC | ||
| CEBPβ | forward TATAGGCTGGGCTTCCCCTT | 94 |
| reverse AGCTTTCTGGTGTGACTCGG | ||
| FABP4 | TTAGATGGGGGTGTCCTGGT forward | 158 |
| reverse GGTCAACGTCCCTTGGCTTA | ||
| PPAR | forward GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC | 74 |
| reverse ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG | ||
| GAPDH | ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG forward | 101 |
| reverse GCCATCACGCCACAGTTTC | ||
| ACTIN | AATCTGGCACCACACCTTCTAC forward | 170 |
| reverse ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC |
Tabella 1: Elenco degli umani primer sequenze utilizzati in questo studio.
Discussion
I recenti progressi nella ricerca sulle cellule staminali non solo migliorato la comprensione dei processi di sviluppo di base, ma anche fornito promettenti opportunità per l'utilizzo delle cellule staminali nella biotecnologico, farmaceutico, terapia cellulare, la medicina rigenerativa, e applicazioni di ingegneria tissutale 18, 19, 20. Mentre CES pluripotenti isolate da embrioni precoci sono i più promettenti, si trovano ad affrontare sfide tecniche e dilemmi etici 21, 22, 23. Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) derivate da cellule adulte forniscono un'alternativa, ma troppo affrontano simili tecniche e di sicurezza 23 problemi. Inoltre, iPSCs non può essere geneticamente stabile o può avere cambiamenti genetici subito, limitando così il loro uso terapeutico. Le cellule staminali sono stati segnalati anche in una varietà di tis postnatalefa causa e gli organi. Le fonti più comuni di questi ASC sono il midollo osseo, adiposo e tessuto muscolare. Tuttavia, ASC provenienti da fonti post-natale hanno limitato potenziale di crescita e differenziazione 24, 25. Soffrono anche a causa di invecchiamento e l'esposizione a stress ambientali e, quindi, non sono sempre efficaci per applicazioni terapeutiche 26, 27, 28. Questo noi e gli altri ha portato alla ricerca di nuove fonti di cellule staminali che sono più ingenuo di ASC.
Abbiamo studiato le fonti perinatali per le cellule staminali primitive come alternativa a ASC. In questo rapporto, mettiamo a disposizione un metodo affidabile, robusto e semplice per isolare cellule staminali mesenchimali umane da campioni cavo / placenta. In confronto ad altre fonti e metodi impiegati per l'isolamento di ASC, questo metodo fornisce un metodo efficiente e non invasivo per isolare grandi quantità di higMSC h qualità. Si accentua ulteriormente la crescita e la differenziazione maggiore potenziale di MSC perinatali rispetto al MSC da fonti adulti, come BM.
Il UC fissaggio del feto alla placenta è un grande organo con le regioni anatomiche distinte, tra due arterie, una vena, CL, e WJ (tessuto circostante i vasi sanguigni). Diversi studi hanno riportato l'isolamento delle MSC dal intero cavo, WJ, o la placenta, con la crescita e la differenziazione variabile Potenziali 25, 29. Tuttavia, fino ad oggi, nessuno studio ha effettivamente esaminato e confrontato le cellule provenienti da diverse regioni anatomiche del campione di cordicella / placenta. Forniamo qui un metodo sistematico e semplice per la dissezione del UC, CPJ, e collegato FP per l'isolamento delle MSC. Mostriamo anche un protocollo completo e semplice per caratterizzare e valutare la qualità delle cellule isolate da determinare la loro proliferazione capabilvità, così come i loro auto-rinnovamento e differenziazione potenzialità. Questo metodo è riproducibile e produce una grande quantità di cellule staminali mesenchimali di qualità superiore.
Abbiamo trovato che la digestione parziale di pezzi di tessuto 1-2 mm di dimensione utilizzando una soluzione di tripsina commerciale cellule riproducibile ottenute dalle espianti, mentre la completa digestione del tessuto in singole cellule avuto scarsa resa di cellule isolate. Tuttavia, uno studio ha riportato che grandi espianti tissutali di UC a circa 10 mm di dimensioni erano ottimali per l'isolamento delle cellule 30. Viceversa, un altro studio ha suggerito che il metodo tessuto espianto determinato un ciclo più lungo e cultura bassa resa di cellule rispetto al metodo di digestione enzimatica 31. Nelle precedenti relazioni, il trattamento di tessuti cavo con collagenasi II e ialuronidasi, separatamente o in seguito alla tripsina, sono state eseguite per isolare cellule di cordone 32, 33
Mentre il protocollo per la dissezione e l'isolamento di cellule dagli espianti è semplice, alcuni dei passi possono rivelarsi impegnativo. In primo luogo, garantire l'aderenza espianto consentendo loro attaccamento alla superficie del pallone di coltura. Questo può essere facilitato utilizzando una piccola quantità di mezzo, solo copre i pezzi di tessuto per le prime 2 ore di coltura, e quindi aggiungendo accuratamente il mezzo rimanente. Seconda, limitare il numero di espianti a meno del 15 per bombola T75. Troppo poco spazio tra i pezzi o troppi pezzi al pallone sono inibente escrescenza cellulare. Terzi, pezzi di tessuto che non aderiscono alla superficie del pallone di coltura dopo 3 giorni di incubazione devono essere trasferiti in un pallone di aderenza e la coltura. Quarto, pezzi di tessuto da coltura dovrebbero essere privi di detriti cellulari, che inibisce l'attaccamento. In quinto luogo, la coltura di pezzi di grandi dimensioni richiede più medio e non migliora l'efficienza escrescenza cellulare. Infine, monitorare le culture espianto strettamente, in particolare dopo la comparsa di escrescenza cellule, come le cellule possono diventare rapidamente confluenti e differenziare a seconda della fonte di tessuto. Alcuni limiti della tecnica sono la mancanza di esperienza nel sezionare campioni per separare il CL, WJ, CPJ, e FP; una piccola dimensione del campione, con conseguente bassa resa WJ; ritardati lavorazione-i campioni devono essere trattati entro 2-4 h di raccolta per Avoid una perdita di recupero delle cellule.
Il gold standard per la caratterizzazione delle MSC è la capacità di aderire alla plastica, formare il fenotipo fibroblastico, e differenziarsi in molteplici linee. Questi sono anche criteri comunemente utilizzati per definire MSC come descritto dal ISCT 35. In questo studio, le cellule isolate da tutte le quattro sorgenti erano aderente alla plastica e aveva positiva espressione di marcatori MSC (CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105) ma espressione negativa per il CD45 marcatore ematopoietiche. Inoltre, hanno espresso antigene leucocitario umano (HLA) di classe I, ma sono risultati negativi per HLA di classe II. Rispetto al BM-MSC, WJ e le cellule CPJ-derivati erano più alti. Questi risultati sono coerenti con le precedenti relazioni di UC derivato MSC 33, 36, 37, 38. Inoltre, i nostri risultati hanno dimostrato che CL, WJ, CPJ-, FP-MSC espresso plurigeni potenza, come OCT4, Nanog, Sox2 e; tuttavia, la loro espressione era inferiore a quella dei CES, come riportato in precedenza 39. Questi risultati sono stati anche in accordo con un precedente studio che ha segnalato l'espressione di marcatori pluripotenza nelle cellule perinatali di derivazione 40. È interessante notare, è stato osservato che l'espressione del marcatore pluripotenti stata più alta nei CPJ-MSC che in cellule isolate da altre fonti. E 'stato anche notato che la UC-MSC esibito un maggiore potenziale di auto-rinnovamento di BM-MSC 41. È interessante notare che, nonostante la somiglianza delle caratteristiche fenotipiche, le cellule isolate da quattro fonti avevano valori CFE variabili. Tuttavia, fatta eccezione per la FP-MSC, tutti avevano migliori valori Inviti alla creazione di BM-MSC. CPJ-MSC ha avuto il più alto valore CFE e tasso di proliferazione, rispetto a tutti gli altri MSC. Inoltre, WJ e CPJ-MSC visualizzati potenzialità di differenziazione più elevati rispetto BM-MSC. CL-MSC ha mostrato la differenziazione almenopotenziale in tutte le tre linee (cioè, adipogenico, condrogenica e osteogeniche), mentre CPJ-MSC ha il più alto potenziale di differenziazione trilineare e FP-MSC visualizzato il minimo potenziale di differenziazione adipogenico.
In conclusione, i nostri risultati hanno dimostrato che la qualità e la quantità delle MSC isolate differivano tra le quattro sorgenti nel campione cavo / placenta. CPJ-MSC aveva più capacità di proliferazione e un maggiore potenziale di auto-rinnovamento. Erano anche potenti nella loro differenziazione in tipi di cellule trilineare. Grazie alla loro basso tempo raddoppio, CPJ-MSC potrebbe essere rapidamente espansa 1.000 volte e utilizzato per farmaci ad elevata capacità o di screening biomateriale. Queste cellule potrebbero essere una fonte più promettente per la terapia cellulare e le applicazioni di medicina rigenerativa.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto da UO-WB ISCRM, Oakland University e Michigan Head e Spine Institute. N. Beeravolu e C. McKee ha ricevuto il Premio di Ricerca Graduate Provost da Oakland University. Apprezziamo S. Bakshi per la revisione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM with 4,500 mg/mL glucose | Invitrogen | 11995065 | |
| FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
| Insulin | Prospec | CYT-270 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
| Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
| TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
| GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| DNase | Promega | M6101 | |
| iScript kit | Biorad | 1708891 | |
| Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
| Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
| Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
| Crystal violet | Sigma | C3886 | |
| Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
| APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
| APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
| FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
| FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
| APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
| FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
| APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
| Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
| Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
| Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
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