Methodenartikel

Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten

DOI:

10.3791/55242

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11. Mai 2017

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1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt einen experimentellen Ansatz zur morphologischen und biochemischen Charakterisierung von Pferdostozyten. Speziell veranschaulicht die vorliegende Arbeit, wie man unreife und reife Pferdoozyten durch Ultraschall-geführte Ovum-Pick-up (OPU) sammelt und wie man Chromosomensegregation, Spindelmorphologie, globale Histonacetylierung und mRNA-Expression untersucht.

Zusammenfassung

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Das Feld der assistierten Reproduktion wurde entwickelt, um Unfruchtbarkeit bei Frauen, Begleittieren und gefährdeten Arten zu behandeln. Im Pferd erlaubt die assistierte Reproduktion auch die Produktion von Embryonen von Hochleistungskünstlern, ohne ihre sportliche Karriere zu unterbrechen und trägt zu einer Zunahme der Anzahl von Fohlen aus Stuten mit hohem genetischen Wert bei. Das vorliegende Manuskript beschreibt die Verfahren, die zum Sammeln von unreifen und reifen Oozyten aus Pferd Eierstöcken mit Ovum Pick-up (OPU) verwendet werden. Diese Oozyten wurden dann verwendet, um die Inzidenz von Aneuploidie durch die Anpassung eines Protokolls, das zuvor in Mäusen entwickelt wurde, zu untersuchen. Speziell wurden die Chromosomen und die Zentromere der Metaphase-II (MII) -Oozyten fluoreszenzmarkiert und auf sequentielle Fokuspläne nach konfokaler Lasermikroskop-Scanning gezählt. Diese Analyse zeigte eine höhere Inzidenz in der Aneuploidie-Rate, wenn unreife Oozyten aus den Follikeln gesammelt und in vitro im Vergleich zu reifenIn vivo Immunfärbung für Tubulin und die acetylierte Form von Histon vier an spezifischen Lysinresten zeigten auch Unterschiede in der Morphologie der meiotischen Spindel und im globalen Muster der Histonacetylierung. Schließlich wurde die Expression von mRNAs, die für Histon-Deacetylasen (HDACs) und Acetyl-Transferasen (HATs) kodieren, durch reverse Transkription und quantitative-PCR (q-PCR) untersucht. Es wurden keine Unterschiede in der relativen Expression von Transkripten zwischen in vitro und in vivo reifen Oozyten beobachtet. In Übereinstimmung mit einem allgemeinen Stummschalten der Transkriptionsaktivität während der Oozytenreifung kann die Analyse der Gesamttranskriptmenge nur die mRNA-Stabilität oder den Abbau zeigen. Daher deuten diese Befunde darauf hin, dass andere translatorische und posttranslationale Regelungen betroffen sein könnten.

Insgesamt beschreibt die vorliegende Studie einen experimentellen Ansatz zur morphologischen und biochemischen Charakterisierung der PferdeozytenLl Typ, das ist extrem schwierig zu studieren aufgrund der geringen Probenverfügbarkeit. Allerdings kann es unser Wissen über die Fortpflanzungsbiologie und Unfruchtbarkeit in monovulatorischen Spezies erweitern.

Einleitung

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Eine breite Palette von assistierten Reproduktionstechniken wurde entwickelt, um Unfruchtbarkeit bei Frauen, Begleittieren und gefährdeten Arten zu behandeln. Eine der häufigsten Verfahren in der klinischen Umgebung ist die Abfrage von Metaphase II (MII) -Stufen-Oozyten aus den Ovarialfollikeln durch Ultraschall-geführte transvaginale Aspiration, Eizelle (OPU) 1 . Diese Oozyten werden dann in vitro (IVF) befruchtet, wobei der resultierende Embryo (s) in einen Empfänger-Uterus implantiert wird. Die MII-Stadium (reifen) Oozyten werden nach der Verabreichung von exogenen Gonadotropinen gewonnen. Allerdings ist diese Behandlung bei einige....

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Protokoll

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Alle Verfahren wurden vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss CEEA Val de Loire Nr. 19 genehmigt und wurden gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Oozytensammlung und in vitro Reifung

  1. Ovum Pick-up
    1. Tägliche Beurteilung durch Ultraschall der Durchmesser der Ovarialfollikel in einer Kohorte von erwachsenen Stuten. Bei der Entstehung eines Follikels ≥33 mm (dominanter Follikel) injizieren Sie die Stute mit 1.500 IE menschlichem Choriongonadotrophin (hCG) im oberen Teil der Vena jugularis (iv).
      1. Bevor Sie die Injektion durchführen, den Bereich m....

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Ergebnisse

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Die ursprünglichen Befunde dieser Experimente wurden bisher in der Tiefe 7 beschrieben und werden hier als ein Beispiel von Ergebnissen beschrieben, die unter Verwendung der beschriebenen Protokolle erhalten werden können.

Reifungsrate

Von den 32 COCs, die von OPU von dominanten Follikeln abgerufen wurden, waren 28 (88%) im MII-Stadium. Vierzehn.......

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Diskussion

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Obwohl IVM seit mehr als 20 Jahren bei Pferden aufgeführt ist, wissen wir noch nicht, ob die Oozyte der Ursprung der embryonalen Aneuploidie sein kann, wie es für den Menschen vorgeschlagen wurde. Der Grund dafür ist wahrscheinlich, dass die Vorbereitung der Oozytenaufstriche für die Chromosomenzählung zu einem erheblichen Probenverlust führt. In diesem Sinne wurde eine Übersicht über die Methoden, die für die Untersuchung von Fehlern in der Chromosomensegregation verwendet wurden, durchgeführt, um nach der am besten ge.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die Autoren danken Fabrice Vincent für die Unterstützung bei der Laserscanning-konfokalen Mikroskopie (LSCM) und Philippe Barrière und Thierry Blard für die tägliche Ultraschall-Ovarial-Scanning und hCG-Injektion. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Projekt "Regione Sardegna und Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (Zuschuss Nr. 26096200 an AML) unterstützt; Die "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" Stipendium (Vertrag 2012 bis FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Forschungsausschuss (REA) "Pro-Ovum" (Zuschuss Nr. 303640 bis VL); Und durch die vom Europäischen Sozialfonds kofinanzierte Postdoktorandenschule für Landwirtschaft und Veterinärmedizin, Sektorielles op....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
UltraschallsondeAlokaUST-5820-7,5
humanes Choriongonadotropin-CentravetCHO0041.500 Einheit/Tier IV
Detomidin-CentravetMED0109 - 15 & micro; g/kg i.v
Butylscopolamin BromurZentravetEST0010,2 mg/kg i.v
StereomikroskopNIKONSMZ-2B
ButorphanolCentravetDOL00310µ g/kg i.v
Benzyl-Penicillin-CentravetDEP203 IM15.000 IE/Tier
TCM199Sigma-AldrichM3769 10X1LPulver für hepes-gepuffertes TCM199 Hepes-Natriumsalz
Sigma-AldrichH3784-100G
RinderserumalbuminSigma-AldrichA8806
Heparin Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3-gepuffert TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLFlüssigkeit für IVM mittlerer
epidermaler WachstumsfaktorSigma-AldrichE4127
Serum für NeugeboreneSigma-AldrichN4762-500ML
4-Well-SchalenNUNCLON144444
InkubatorHeraeusBB6060
MonastrolSigma-AldrichM8515
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
PronaseSigma-AldrichP5147
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
PolyvinylalkoholSigma-Aldrich341584
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787
normales EselserumSigma-AldrichD9663
Kaninchen Anti-Aurora B Phospho-Thr232BioLegend636102
TRITC-konjugierter Esel Anti-Kaninchen IgGVector Laboratories711-025-152
Vecta-ShieldVector LaboratoriesH-1000
YOPRO1Thermofisher ScientificY3603
konfokales Laser-Scanning-MikroskopLSM 780Zeiss
konfokales Laser-Scanning-MikroskopLSM 700Zeiss
ImageJ Softwarersb.info. nih.gov/ij/download.htmlkostenlose Ressource
Maus Anti-Alpha-TubulinSigma-AldrichT8203
Kaninchen Anti-acH4K16Upstate Biotechnologie07-329
AlexaFluor 488-coniugated esel anti-mouse IgGLife TechnologiesA21202
4',6-diamidino-2-phenylindolSigma-AldrichD8417DAPI
ZentrifugeEppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Luciferase RNAPromegaL4561
PicoPure RNA Isolation KitApplied Biosystems12204-01
zufällige HexamerThermofisher ScientificN8080127
Maus Moloney Leukämie Virus reverse TranskriptaseThermofisher Scientific28025013
SYBR grüner SupermixBioRad1708880
spezifische PrimerSigma-Aldrichspezifische Primer wurden unter Verwendung der Primer3Plus-Software (freie Ressource)
ThermocyclerBioRadMyiQ
Maus monoklonal anti-CENPAAbcamab13939
Maus monoklonal anti-Aurora BAbcamab3609
. . . entwickelt

Referenzen

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  1. Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
  2. Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

OozytenreifungKonfokalmikroskopieImmunf rbungqPCR AnalyseOozytensammlungIn vitro Reifung

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