Methoden zur Selbst Integration von Megamolecular Biopolymere auf der Trocknungsluft-LC-Schnittstelle

Zusammenfassung

Ein Verfahren zur Trocknung induzierte Selbst Integration von megamolecular Biopolymeren auf der Luft-Flüssigkeit-kristalline Grenzfläche ist vorgesehen. Diese Methodik wird nützlich sein, nicht nur für das Verständnis der makroskopischen Potentiale von Biopolymeren, sondern auch als ein Bewertungsverfahren für weiche Materialien in der biomedizinischen und Umwelt.

Zusammenfassung

Lebende Organismen, die Wasser verwenden, sind immer anfällig in der Umwelt zu trocknen. Ihre Aktivitäten werden angetrieben von Biopolymer-basierten Mikro- und Makrostrukturen, wie in den Fällen gesehen Wasser in Leitbündel bewegten und feuchtigkeitsspendende Wasser in Hautschichten. In dieser Studie haben wir ein Verfahren zur Bewertung der Wirkung von wässrigem flüssigkristallinen (LC) Lösungen von Biopolymeren beim Trocknen zusammen. Als LC Biopolymere megamolecular Gewicht haben, wählten wir Polysaccharide, Cytoskelett-Proteine ​​und DNA zu untersuchen. Die Beobachtung von Biopolymer-Lösungen während zeigt aus der instabilen Luft-LC-Schnittstelle beginnend milliscale Selbstintegration unter polarisiertem Licht trocknet. Die Dynamik der wässrigen LC-Biopolymer-Lösungen kann durch Verdampfen von Wasser aus einer einseitig offenen Zellen überwacht werden. Durch die Analyse der Bilder kreuzpolarisiertem Licht genommen, ist es möglich , die räumlich-zeitlichen Veränderungen des Orientierungsordnungsparameter zu erkennen. DiesVerfahren für die Charakterisierung von nicht nur künstlichen Materialien in verschiedenen Bereichen, aber auch natürliches Leben Geweben nützlich sein. Wir glauben, dass es ein Bewertungsverfahren für weiche Materialien in der biomedizinischen und Umweltbereich bieten.

Einleitung

Durch die Fokussierung auf den starren, stabförmigen Strukturen von Biopolymeren, dynamisch weichen Materialien wurden für verschiedene Anwendungen, einschließlich Polysaccharids Biofilm Matrices ¹ „aktiven Gele“ bestehend aus Zytoskelett - Proteinen ² und „DNA origami“ gewünschten Formen ³ verwendet. Um zu klären, haben die strukturellen Eigenschaften, viele Strategien wurden untersucht, wie die Transmissionselektronenmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Da jedoch diese Methoden meist in einem ausgetrockneten oder statischen Zustand durchgeführt werden, ist es schwierig, die dynamischen Verhalten in der makroskopischen Ebene zu erklären, wie es in der tatsächlichen lebenden Systemen gesehen. Vor kurzem haben wir beobachtet , erfolgreich das dynamische Verhalten von Biopolymeren auf die wässrige Luft-LC - Schnittstelle durch polarisiertes Licht ^4. Bei der Visualisierung der Struktur ausgerichtet, während das Trocknen des BiopolymersLösung zeigten die zeitlichen Veränderungen Selbst Integration von Biopolymeren auf der instabilen Luft-LC-Schnittstelle.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Trocknung von LC-Biopolymer-Lösungen an der Luft-LC-Schnittstelle unter Verwendung von polarisiertem Instrumenten. Durch Auswertung des Orientierungsordnungsparameters in der Seitenansicht der Fluidphase in einer offenen einseitiges-Zelle im Gegensatz Phase auf andere Analysen der LC , dass ⁵ nicht die Ansicht , ^{Trocknen, 6} wurde die LC Dynamik während des Trocknungsvorganges hier untersucht . Die Kombination der Zelle der Verdampfung und die Verwendung von polarisiertem Instrumenten zur makroskopischen Überwachung mit einer kontrollierten Verdampfungsrichtung erlaubt. Darüber hinaus war es möglich , die Trocknungs Aufzeichnungen durch die Konzentration auf den kristallinen Strukturen der adsorbierten Mikrodomänen zu validieren, die durch das Molekulargewicht beeinflußt wurde, Konzentration, usw. Um die Wirksamkeit des Verfahrens wird die Trocknung Pro zu demonstrierenzesse basischer Biopolymeren mit starren Stabformen, wie Polysaccharide, Mikrotubuli (MTs), und DNA, wurden untersucht. Wir haben uns für diese Biopolymere, weil sie typische Beispiele für hierarchische Makromoleküle mit megamolecular Gewichte sind, und ihre intermolekularen Wechselwirkungen ermöglichen ihnen LC Staaten zu bilden.

Protokoll

1. Instrumente

1. Polarisationsvorrichtung
   1. Um eine Polarisationsvorrichtung zu konstruieren, liefert eine Lichtquelle mit einer Halogenlampe, eine Lichtführung, Polarisatoren, ein Probentisch, ein optischer Schiene, Stange steht und eine digitale Spiegelreflexkamera (siehe Abbildung 1C und Liste für die Polarisations Geräteteile).

2. Herstellung der Biopolymer-Lösung

1. Polysaccaridlösungen
   1. Löst sacran ⁷ (0,5 g) in reinem Wasser (100 ml) durch Rühren bei ~ 80 ° C für mehr als 12 h. Während der Auflösung, decken sie die Behälter mit Plastikfolie, um Verdunstung zu verhindern. Bereiten einer wäßrigen Lösung von Xanthangummi in der gleichen Weise.
   2. Kühlen Sie die Lösung auf ~ 25 ° C 0,5 Gew% ige wässrige Lösungen zu erhalten.
   3. Zentrifugiere die sacran Lösung zu entfernen Verunreinigungen (48.400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 timn).
2. MT - Lösung
   1. Vorbereiten eine 0,5 wt% Tubulin - Lösung (1 ml) in einem Britton-Robinson - Puffer (80 mM Piperazin- N, N '-Bis (2-ethansulfonsäure) (PIPES), 1 mM Ethylenglycol-bis (β-aminoethylether) - N, N, N 'N' -tetraessigsäure (EGTA) und 5 mM MgCl _2, pH 6,8) auf Eis ^8.
   2. Verwenden 0,5 wt% Tubulin-Lösung (50 ul) und Guanosin-5' - [(α, β) -methyleno] triphosphat (GpCpp) (5 & mgr; l), um eine GpCpp Tubulin enthaltenden Lösung hergestellt (50 ul). bei 37 ° C inkubieren 3 h einen stabilen Kern MT zu erhalten.
      HINWEIS: Die Rolle der GpCpp ist MT Bildung zu unterstützen und vollständig die Depolymerisation von MT an Tubulin zu unterdrücken.
   3. Mischen Sie die 0,5 wt% Tubulin-Lösung (950 ul) und die GpCpp enthaltenden Tubulin-Lösung (50 ul) bei ~ 25 ° C für 1 Tag eine stabile 0,5 wt% MT-Lösung zu erhalten.
3. DNA - Lösung
   1. Vorbereiten eine 0,5 wt% DNA-Lösung (1 ml) in Tris-EDTA-Pufferlösung (10 mM Tris, pH 8,0, mit 1 mM EDTA).
4. Halten Sie die 0,5 wt% Biopolymer Probenlösungen bei 25 ° C für die Trocknung Experiment.

3. Trocknen Experimente und Beobachtung unter Kreuz-polarisiertes Licht

1. Lösungen in einer einseitig offenen Zellen (1A)
   1. Geschnitten , um eine Silizium - Platte (siehe Materialliste) in eine geeignete Form mit einer Dicke von 1 mm (Innenmaß von 5-15 mm, 1 mm, und ~ 20 mm; 1A).
      1. Zubauen eine einseitig offene Zelle eines Siliziumabstandshalters zusammengesetzt mit Innenmaß von 5-15 mm, 1 mm, und ~ 20 mm und zwei nicht-modifizierten Glas-Objektträger (76 mm × 1 mm × 26 mm). Fix beide Seiten der Zelle mit Doppel Clips im Voraus, um die Probenlösung zu halten austritt.
   2. Langsam jede der 0,5 Gew% Biopolymer-Lösung (100-300 ul) eine ~ 1 mm Porengröße Pipettete Spitze jeder Zelle bei ~ 25 ° C. Entfernen von Luftblasen aus den Zellen unter Verwendung einer Spritzennadel.
   3. Platzieren Sie die Zellen in einem Ofen mit einer Luft Zirkulator bei 60 ° C unter Atmosphärendruck für die Verdampfung; die Verdampfungsrichtung, die der Schwerkraft entgegengesetzt.
2. Beobachtungen unter kreuzpolarisiertem Licht (1B-1C)
   1. Bietet gerade sichtbares Licht über eine 100 W Halogenlampe mit einer flachen Oberflächen-Lichtquelle über einen breiten Bereich (80 mm x 80 mm). Stellen Sie die Polarisatoren 45 ° und 135 ° , um den Halter (Abbildung 1C).
   2. Fix die Positionen der Lichtquelle, Polarisatoren, Probentisch, und eine optische Kamera Schiene und Stange steht (1C) verwendet wird . Platzieren Sie den Probentisch zwischen den beiden Polarisatoren (der Abstand zwischen den Polarisatoren sollte ~ 5 cm). Stellen Sie die Kamera ~ 20 cm von dem Probentisch Fokussierung zu ermöglichen.
   3. Zu bestimmten Zeiten, legen Sie die Proben aus Schritt 3.1.3 zwischen dem polarizers auf der Bühne parallel zu der XZ-Ebene und die Vorrichtung mit einem schwarzen Vorhang bedecken; die eigentliche Vorrichtung ist in 1C gezeigt.
   4. Fotografieren Sie die Proben durch lineare gekreuzten Polarisatoren eine digitale Spiegelreflexkamera mit einem Standard-Zoomobjektiv (siehe Materialliste). Steuern Sie die Kamera-Einstellungen, wie Brennweite, Computer-Software (siehe Materialliste).
3. Räumlich-zeitliche Analyse der durchgelassenen Lichtintensität (1C)
   1. Um die Änderung des Orientierungsordnungsparameters in dem Trocknungsprozess zu bewerten, sammeln Fotografien stündlich für 24 h.
   2. Messen Sie die übertragene Lichtintensität entlang der Mittellinie in der Z-Richtung als Grauwert eines Bildverarbeitungsprogramms unter Verwendung von (zB ImageJ).
   3. Eine Grafik mit dem Grauwert in Abhängigkeit von dem Abstand von der oberen offenen Seite.
4. Mikroskopische Beobachtungen unter kreuzpolarisierten light (1D)
   1. Um die Methoden zu überprüfen, machen mikroskopische Beobachtungen mit einem Polarisationsmikroskop mit einer CCD - Kamera ausgestattet ^9. Halten erster Ordnung Verzögerungsplatte im Strahlengang. Kontrollieren Sie die Bedingungen für die Fotos eine PC-Software.

Ergebnisse

Verwendung der Vorrichtung wie in 1 gezeigt ist , um die Selbst Integration von Mikrodomäne macrodomain auf einer trocknenden Luftschnittstelle-LC bewertet wurde (2A). Da die erste Demonstration des Trocknungs Experiment wurden zwei Arten von megamolecular Polysacchariden, sacran (M _w = 1,9 x 10 ⁷ g mol ^-1) und Xanthangummi (4,7 x 10 ⁶ g mol ^-1), wurden verglichen. 2B ...

Diskussion

Es war manchmal schwierig, für die Kamera auf der Probe zu konzentrieren, aufgrund der durchgelassenen Lichtintensität zu gering zu sein. In solchen Fällen auf der Bühne eine erweiterte transparenten Kunststoffilm Platzieren half, den Fokus zu arrangieren. Die Begrenzung der beobachtbaren Auflösung war abhängig von der Kameralinse, ~ 10 & mgr; m in diesem Fall. Die beobachtbare Begrenzung der Probendicke, & Delta; y, waren abhängig von der maximalen Lichtintensität der Lampe, ~ 10 mm in diesem Fall.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
sacran	Green Science Materials Inc., Japan		Von Aphanothece sacrum. Mw = 1,9 × 107 g mol-1
xanthan	Gum Taiyo Kagaku Co., Japan	Neosoft XC	Von Xanthomonas campestris. Mw = 4,7 & mal 106 g mol-1
tubulin	Cytoskeleton, Inc., USA	T240	Aus dem Schweinehirn.
GpCpp	Jena Bioscience, Deutschland	NU405L
Piperazin-N,N′ -bis(2-ethansulfonsäure)	Sigma-Aldrichi, Co. LLC.	P6757-500G	PIPES
Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N',n'-tetraessigsäure	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	342-01314	EGTA
MgCl2-6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-15055
KOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	162-21813	Pellet
DNA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	D1626	Aus Lachshoden Mw = 1,3 & mal 106 Da (~2.000 bp)
Tris-EDTA-Pufferlösung	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	T9285-100ML	10 mM Tris, pH 8,0, mit 1 mM EDTA-Objektträgerglas
	Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan	S1111
Silikonkautschukplatte	Asone Co.	6-611-32	Dicke: 1 mm
Zentrifuge	Beckman-Coulter, Inc., USA	Avanti J-25	bestückt mit einer JA-20
Rotorlichtquelle	Sumita Optical Glass, Inc., Japan	LS-LHA
Lichtleiter	Sumita Optical Glass, Inc., Japan	GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)	80 mm &fach 80 mm
Halogenlampe	Ushio Inc., Japan	JCR 15V150WBN
Halter	Sigmakoki, Co., Ltd.	KMH-80
Probentisch	Sigmakoki, Co., Ltd.	TARW-25503L
Probenhalter	Sigmakoki, Co., Ltd.	SHA-25RO
Stab	Sigmakoki, Co., Ltd.	ROU-12-40
Pfostenhalter	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-6-40
Pfostenhalter	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-60
Pfostenhalter	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-80
Pfostenhalter	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-130
Träger	Sigmakoki, Co., Ltd.	CAA-25LS
Kamerahalter	Sigmakoki, Co., Ltd.	CMH-2
mittlere optische Schiene	Sigmakoki, Co., Ltd.	OBA-500SH
Objektivrohr	Tomytech, BORG	Objektivrohr BK	80φ, L25 mm
Lenstube	Tomytech, BORG	Lenstube BK	80φ, L50 mm
	Multiband Tomytech, BORG		80φ
V-Platte	Tomytech, BORG	V-Platte 60S
Plattenhalter	Viexen, Co.,Ltd.	Plattenhalter SX
EOS Kiss X7i	Canon Inc., Japan	8594B001	mit einem Standard-Zoomobjektiv  EFP 18-55 mm
Fotosoftware	Canon Inc., Japan	EOS Utility
PC	Microsoft
	Olympus	BX51
Retardierungsplatte erster Ordnung	Olympus	U-TP530	lambda; = 530 nm
CCD-Kamera	Olympus	DP80
Fotosoftware	Olympus	cellSens Standard
Java-basiertes Bildverarbeitungsprogramm	der National Institutes of Health	ImageJ

Oberflächenpolarisationsmikroskop &