Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Abstract

Mikroglia sind die primären Responder auf Zentralnervensystem Beschimpfungen; bleibt jedoch viel Unbekanntes über ihre Rolle bei der Regulierung der neuroinflammation. Mikroglia sind mesodermalen Zellen, die in der Vermessung entzündliche Stress ähnlich wie Makrophagen funktionieren. Der klassische (M1-Typ) und alternativer (M2-Typ) Aktivierungen von Makrophagen haben auch Mikroglia in dem Bemühen, erweitern das darunter liegende Zusammenspiel dieser Phänotypen haben in neuroinflammatorische Bedingungen wie Parkinson, Alzheimer und Huntington-Erkrankungen besser zu verstehen. In - vitro - Experimente unter Verwendung von primären Mikroglia bieten schnelle und zuverlässige Ergebnisse , die auf die in - vivo - Umgebung erweitert werden können. Obwohl dies ein klarer Vorteil gegenüber in vivo Experimenten Mikroglia zu isolieren , während eine adäquate Ausbeuten optimale Reinheit zu erreichen eine Herausforderung gewesen. Gängige Methoden zur Zeit in Gebrauch entweder leiden unter niedriger Erholung, geringe Reinheit, oder beides. Wir berichten hier über DMonstrate eine Verfeinerung der säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren, die eine hohe Zellgewinnung und eine verbesserte Reinheit in der Hälfte der Menge an Zeit erreicht. Wir schlagen vor, diese optimierte Methode als sehr nützliches Modell der primären Mikroglia-Isolierung für die Zwecke der neuroinflammation und Neurodegeneration zu studieren.

Introduction

Mikroglia sind Myb unabhängige Makrophagen mesodermalen Ursprungs, die von c-kit + / CD45- unterscheiden erythromyeloid Vorläufern in den Blutinseln des Dottersacks ^{1, 2.} Sobald embryologischen Mikroglia das zentrale Nervensystem (ZNS) kolonisiert haben, Übergangs- sie von einer zu einer verästelten amoeboid Form ^3. Diese Erwachsenen Mikroglia als surveillant klassifiziert , da ihre dynamische Verzweigungen das gesunde Hirnparenchyms für mögliche Beleidigungen Sonde ^4. Obwohl nur Mikroglia auf etwa 10% der Bevölkerung CNS Zelle beitragen, ihre Fähigkeit , untere....

Protocol

Die Verwendung der Tiere und Protokollverfahren genehmigt und überwacht von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Iowa State University (Ames, IA, USA)

1. Anbau von Mixed Gliakulturen

1. Köpfen 1- 2 Tage alten Welpen schnell mit 5,5-Zoll-Betriebs Schere, und legen die Köpfe sofort in ein 50 ml Röhrchen auf Eis. Beachten Sie, dass diese Enthauptung der Modus der Euthanasie ist.
2. In einer laminaren Luftstrom Haube, macht einen kleinen Schnitt in dem Schädel und Hirnhaut mit 4,5 Zoll gerade Mikro-Dissektionsscheren. Beginnen vom Schwanzende zum rostralen Ende Schneiden (Nase). Holen ....

Results

Mikroglia isoliert CD11b Positive Selection Kit II hohe Reinheit

Primäre Maus Mikroglia wurden unter Verwendung des oben genannten Protokolls isoliert und ausplattiert auf Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser, die Reinheit der Isolation zu prüfen. Zehntausend Zellen wurden pro Napf und immunzytochemische Analyse ausplattiert wurde mit ionisiertem Calcium bindende Adaptormolekül 1 durchgeführt (Iba1) als Marker für Mikroglia und g.......

Discussion

Ältere Mikroglia-Isolationsmethoden haben begrenzte Wiederherstellungen, die nicht geeignet sind für verschiedenes Protein durch Western-Blot-Analysen und RNA-Analysen durch qRT-PCR. Die differentielle Adhärenz und milde Trypsinisierung Methoden sind zwei gemeinsame Ansätze mit niedrigeren Ausbeuten Mikroglia ^{13, 14, 15.} Die Säule basierte CD11b Ansatz hat auch eine geringe Erholung, aber erreicht eine höhere Reinheit als diffe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasySep CD11b Separation Kit II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Natriumpyruvat	Life Technologies	11360070
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamin (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	13H469
0,25% Trypsin-EDTA	Gibco von Life Technologies	25200
Dulbecco's PBS (DPBS)	Gibco von Life Technologies	14190250