Summary
Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.
Abstract
Les microglies sont les répondeurs principaux aux insultes du système nerveux central; Cependant, il reste encore beaucoup de leur rôle dans la régulation neuro-inflammation. Microglies sont des cellules mésodermiques qui fonctionnent de manière similaire aux macrophages dans le stress inflammatoire arpentage. Le classique (M1-type) et alternatif (M2 type) activations de macrophages ont également été étendues à microglie dans le but de mieux comprendre l'interaction sous-jacente de ces phénotypes ont dans des conditions neuro-inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, d'Alzheimer et la maladie de Huntington. Dans l' expérimentation in vitro en utilisant la microglie primaire offre des résultats rapides et fiables qui peuvent être étendues à l'environnement in vivo. Bien que ce soit un net avantage sur l' expérimentation in vivo, l' isolement microglies tout en obtenant des rendements adéquats de pureté optimale a été un défi. Les méthodes courantes actuellement utilisées souffrent soit de faible récupération, de faible pureté, ou les deux. Ici, nous demontrer un perfectionnement du procédé de séparation magnétique CD11b sans colonne qui permet d'obtenir une récupération élevée de cellules et de pureté améliorée dans la moitié de la quantité de temps. Nous vous proposons cette méthode optimisée comme un modèle très utile d'isolement microglie primaire aux fins de l'étude et la neuro-inflammation neurodégénérescence.
Introduction
Les microglies sont macrophages résidents Myb indépendants d'origine mésodermique, qui se différencient à partir de c-kit + / CD45- érythromyéloïde progéniteurs dans les îlots sanguins de la vésicule ombilicale 1, 2. Une fois embryologique microglie ont colonisé le système nerveux central (SNC), leur transition d'une amoeboid à une forme ramifiée 3. Ces microglies adultes sont classés comme Surveillant puisque leurs ramifications dynamiques sonde le parenchyme cérébral sain pour les insultes potentiels 4. Bien que les microglies ne contribuent à environ 10% de la population de cellules du système nerveux central, leur capacité à carreaux entre l'autre assure la numérisation maximale du parenchyme 4, 5. Motifs moléculaires associés danger (DAMPS), tels que α-synucléine 6, 7 et 8 β-amyloïde, ou pmotifs moléculaires associés athogen (PAMP) tels que le lipopolysaccharide (LPS) 9, classiquement activer la microglie , de promouvoir une réaction inflammatoire caractérisée par le retour à l'état actif de amoeboid et la production d'oxyde nitrique, le facteur-α de nécrose tumorale (TNF), l' interleukine 1β (IL-1β), IL-6, IL-12, et le ligand motif chimiokine CC 2 9, 10, 11. Dans des conditions neuro - inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, dans laquelle pathogène α-synucléine a accumulé, un cycle neurodégénérative est créé à partir de la mort des neurones dopaminergiques, qui libèrent α-synucléine agrégée plus, en favorisant en outre l' activation de la microglie classique 7. Similaires aux macrophages périphériques, la microglie peut également avoir la capacité d'activer alternativement en présence des cytokines anti-inflammatoires IL-4 et IL-10, en leur donnant la puissanteial de favoriser la réparation neuronale et l' inflammation 2 atténuer, 11. En plus de leurs rôles immunologiques dans le système nerveux central, la microglie ont été décrits en tant que régulateurs vitaux des circuits neuronaux par la taille synapses au cours du développement. Par exemple, les souris KO ont Cx3cr1- microglie moins denses et réduit la taille synaptique, ce qui conduit à une surabondance d'épines dendritiques immatures, synapses, et les motifs électrophysiologiques d'une sous - développée du système nerveux central 12. La compréhension de ces complexités physiologiques et les divers rôles fonctionnels des microglies dans l'homéostasie du système nerveux central est essentiel à la recherche de thérapies ciblant les maladies neurodégénératives.
Dans le domaine de la neuro - immunologie, des expériences in vitro sont hautement souhaitables en raison de la plus grande faisabilité des études mécanistes, les coûts d'entretien et d'être moins de temps et de main-d'œuvre. Furthermore, la capacité d'isoler des populations de cellules est essentielle pour délimiter la fonctionnalité de ces cellules cibles dans des conditions prescrites. De nombreuses méthodes d'isolement microgliales existent, mais ils sont limités par leur capacité à obtenir un nombre relativement élevé et la pureté pour une large expérimentation 13, 14, 15. Par exemple, un groupe d'11b de différenciation (CD11b) est un marqueur de surface commune des monocytes, les macrophages et les microglies 16. En exploitant CD11b, un procédé de séparation magnétique a d' abord été décrit comme étant une approche basée sur colonne qui a donné ~ pureté de 99,5% et ~ 1,6 x 10 6 par la microglie cerveau néonatal 17. Notre laboratoire a récemment mis au point un procédé de séparation magnétique CD11b libre de la colonne 15, que nous avons effectuée dans un tube de polystyrène par le marquage CD11b avec un anticorps monoclonal conjugué à la phycoérythrine (PE). Un bispécifique secondary anticorps à PE et complexes dextrane avec le PE. Une fois lié, les particules magnétiques revêtues de dextrane sont introduits, qui se lient à la fin de dextrane du complexe d'anticorps. Enfin, le tube en polystyrène est placé dans un aimant pour l'isolement de la microglie. Cette approche a doublé le rendement à ~ 3,2 x 10 6 microglies par cerveau du nouveau - né , mais au coût de la réduction à la pureté ~ 97%.
Ici, nous démontrons un protocole magnétique CD11b sans colonne rapide et raffinée séparation (figure 1). Cette méthode améliorée reste aussi possible que notre méthode sans colonne d'origine puisque le prix du kit de séparation magnétique CD11b est le même. La durée de traitement est réduit de moitié, ce qui peut être crucial pour optimiser le rendement et la survie cellulaire. En particulier, la pureté obtenue à partir de cette méthode optimisée est ~> 99%, une nette amélioration par rapport à la pureté obtenue à partir de la méthode sans colonne originale développée par notre laboratoire 15. Plus important encore, CD11b-PEn'est pas utilisé, ce qui élimine la nécessité de laisser incuber abri de la lumière et permettant l'utilisation du canal rouge pour la microscopie de fluorescence. Enfin, comme dans le procédé CD11b original, une fraction astrocytaire de rendement élevé et une pureté est obtenue avec ce procédé amélioré. Les astrocytes sont les plus nombreuses cellules gliales du système nerveux central, ce qui conduit à l'idée que leurs fonctions sont indispensables homéostatique par rapport à 18 physiopathologie. Ces cellules gliales jouent un rôle dans diverses fonctions physiologiques telles que la formation de la barrière hémato-encéphalique, fournissant un soutien en éléments nutritifs, le maintien de l'homéostasie des neurotransmetteurs, formant des cicatrices gliales en réponse à des blessures, la neuroprotection, l'apprentissage et la mémoire, et neuroinflammation, ce qui illustre leur potentiel d'enquête dans gliale biologie 19. Morphologique et la fonctionnalité de la microglie et astrocytes ont été vérifiés par microscopie confocale, Western Blot quantitative en temps réel Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR), Gdosage de nitrite Riess, et le dosage des cytokines multiplex Luminex. Le raffinement fourni par ce protocole offre une plus grande confiance concernant la pureté des microglies ou astrocytes, une application plus large de la microscopie à fluorescence avec la disponibilité du canal rouge, et fait gagner du temps, qui sont tous importants pour l' expérimentation in vitro.
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Protocol
L'utilisation des animaux et des procédures de protocole ont été approuvés et supervisés par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) à l'Iowa State University (Ames, IA, États-Unis)
1. Croissance des cultures mixtes gliales
- 1- 2 chiots Décapitez âgés jour rapidement avec 5,5 pouces ciseaux d'exploitation, et placer les têtes immédiatement dans un tube de 50 ml sur la glace. Notez que cette décapitation est le mode d'euthanasie.
- Dans une hotte à flux laminaire, une petite incision dans le crâne et les méninges en utilisant 4,5 pouces ciseaux micro-dissection droites. Commencer à couper à partir de l'extrémité caudale à l'extrémité rostrale (nez). Obtenir sous la peau à l'aide de l'ouverture formée par la décapitation.
- Après l'incision, peler une des hémisphères sur le côté. Ensuite, utilisez une paire de pinces courbes ou crochet pour enlever l'ensemble du cerveau.
- Immerger le cerveau (s) dans un nouveau tube de 50 ml contenant 0,25% de trypsine-ethylenediaminetetraacetmangé acide (EDTA) pendant 15 min dans un bain d'eau à 37 ° C. Utiliser 2 ml de trypsine-EDTA par cerveau.
- Laver le cerveau (s) avec des produits frais du milieu de croissance (10% de FBS, DMEM / F12, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine, 1% de pyruvate de sodium, et 1% d'acides aminés non essentiels) en ajoutant et en enlevant le médias. Répétez cette 4x.
- Pour chaque cerveau, plaque deux T-75 flacons contenant un milieu de croissance. Par conséquent, ajouter 2 ml de milieu de croissance par cerveau au tube. Ainsi, il sera un équivalent de 1 ml de cerveau homogénéisés avec 8-9 ml de milieu de croissance par flacon T-75.
- Homogénéiser par triturer le cerveau (s) avec des pipettes de différentes tailles d'ouverture, pour le plus grand au plus petit. Quand il est visible que le tissu du cerveau ne reçoit pas plus petit, la transition à la pipette suivante. A la fin de la trituration, la suspension doit être claire, sans morceaux visibles.
- Utiliser une pipette de 25 ml, pipette 5 ml, puis une pipette de 10 ml de manière séquentielle.
- Passez chaque homogsuspension Enous du cerveau à travers un tamis cellulaire de 70 um à en faire une culture d'une cellule unique.
- Pour chaque cerveau homogénéisé, plaque deux flacons T-75 contenant un milieu de croissance, tel que décrit à l'étape 1.5 (1 ml de cerveau homogénéisé avec 8-9 ml de milieu de croissance par flacon T-75).
- Changer les médias de croissance après 6 d et croître jusqu'à l' isolement le 16 e jour.
2. Isolement des cellules microgliales
- Après 16 jours, retirez le support de croissance du ballon et le placer dans un nouveau tube de 50 ml. Ajouter 3 ml de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque flacon T-75. Agiter les flacons pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur orbital.
- Centrifuger la milieu de croissance retiré à 0,4 g pendant 5 min et en utilisant pour arrêter la réaction de la trypsine-EDTA dans l'étape suivante.
- Après agitation pendant 5 min, ajouter un minimum de 4 ml de milieu de croissance (frais ou le support utilisé à partir 2.1.1) pour arrêter la réaction de la trypsine-EDTA.
- Triturer pour faire en sorte que tous les cElls ont été détachés.
- Après trituration, passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 um pour en faire une seule culture cellulaire, effectuer une numération cellulaire, puis centrifuger les cellules à 0,4 g pendant 5 min.
- Pour chaque 100 x 10 6 cellules (environ 15 x flacons T-75), en utilisant 1 ml de milieu recommandé (2% de FBS, du DPBS (calcium et sans chlorure de magnésium), EDTA 1 mM) pour remettre en suspension le culot cellulaire.
REMARQUE: Toutes les étapes suivantes sont adaptées pour une séparation 1 ml. - Prenez un tube de polystyrène 5 ml, ajouter 1 ml de supports recommandés, et marquer le ménisque. Ajouter un média recommandée jusqu'à 2,5 ml et marquer aussi. Jeter les médias recommandée et transférer les cellules remises en suspension dans le tube de polystyrène 5 ml.
- Ajouter 50 pi de sérum de rat pour chaque 1 ml de cellules en suspension. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Préparer cocktail de sélection en mélangeant 25 pi de composant A et 25 ul de composant B. Ces composants sont exclusifs.
- Ajouter 501; L du cocktail de sélection aux cellules. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
NOTE: Pour les cultures plus pures, répétez l'étape 2.9 (recommandé mais non obligatoire). - microsphères de Vortex pour 45 s. Ajouter 80 pi de microsphères par 1 ml d'échantillon. Incuber pendant 3 min à température ambiante.
- Porter le volume à 2,5 ml dans le tube de polystyrène en ajoutant les supports recommandés.
- Placer le tube dans l'aimant pendant 3 min à température ambiante. Ajuster l'incubation pour augmenter la pureté. Verser lentement le support recommandé dans un tube de 15 ml avec l'aimant toujours dans le tube de polystyrène.
- Répétez l'étape 2,12 trois fois plus. peuvent être effectués incubations magnétiques supplémentaires pour augmenter la pureté.
- Ajouter 3 ml de milieu de croissance et compter le nombre de cellules en utilisant un compteur de cellules.
- Cellules de la plaque en conséquence de Poly-D-Lysine (PDL) des plaques revêtues d'pour les traitements. Traiter les cellules 48 h après l'ensemencement des plaques revêtues de inPDL. Cela permet aux cellules de récupérer du stress de la séparation.
NOTE: Check la pureté de la culture en utilisant une immunocytochimie comme décrit précédemment 15. - Plaque de la fraction négative (recueilli dans un tube de 15 ml), qui contient principalement des astrocytes, dans des flacons T-75 dans le milieu de croissance.
- Après au moins 6 heures d'incubation à 37 ° C incubateur, changer le milieu et laisser croître O / N. Diviser les astrocytes le lendemain pour les traitements.
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Representative Results
Microglie isolés en utilisant le kit de sélection positive CD11b II ont une grande pureté
microglies de souris primaires ont été isolés en utilisant le protocole mentionné ci-dessus et étalées sur des lamelles revêtues de poly-D-lysine pour vérifier la pureté de l'isolement. Dix mille cellules ont été étalées par puits et l'analyse immunocytochimique a été effectuée en utilisant la molécule d'adaptateur de liaison du calcium ionisé 1 (Iba1) en tant que marqueur de la microglie et de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) en tant que marqueur des astrocytes pour vérifier la pureté de la microglie isolé . La culture isolée seulement exprimé Iba1 sans expression GFAP (figure 2A), ce qui suggère que la culture était isolé microglies pur. Contrairement à d'autres procédés précédemment proposés pour la séparation primaire de la microglie, qui a atteint ~ 97% de pureté, en utilisant cette méthode, nous avons obtenu ~> 99% de pureté dans la moitié du temps. Afin de valider la pureté de e est la culture, nous avons effectué un Western Blot 20 pour Iba1 et GFAP. Analyse par immunotransfert a en outre révélé que cet isolement à partir des cultures gliales mixtes était une culture microgliale presque pur (figure 2B).
La procédure d'isolement modifiée n'a pas de billes magnétiques auto-fluorescence
Le canal rouge ne peut pas être utilisé pour immunocytochimie (ICC) en utilisant le kit d'isolement précédent CD11b pour la séparation de la microglie comme mentionné par Gordon et al. 15 en raison de l'utilisation de l' étiquetage PE lors de la séparation. L' utilisation de ce nouveau kit d'isolation sans PE, nous pouvons utiliser le canal rouge pour l' analyse immunohistochimique (figure 3). De cette CPI, il est évident que cette nouvelle méthode nous permet d'utiliser tous les canaux pour la cytométrie de flux ou d'autres études d'imagerie de fluorescence.
ve_step » fo: keep-together.within page = "1"> isolées cultures microgliales répondent fonctionnellement à un stimulus LPSPour vérifier que les microglies isolés sont fonctionnellement actifs, nous avons traité les cellules avec LPS, un stimulant largement utilisé 9 pour activer la microglie, pendant 24 h avant le sondage de divers facteurs pro-inflammatoires. l'activation de la microglie classique est accompagnée par la libération de nitrite et diverses cytokines pro-inflammatoires dans les médias. Par conséquent, nous avons utilisé plusieurs tests complémentaires pour confirmer l'activité fonctionnelle de notre microglies isolé. Tout d' abord, nous avons utilisé le test Griess pour montrer que le LPS induit la sécrétion de façon spectaculaire le nitrite de la microglie isolée (figure 4A). Afin de valider l'activité de la microglie isolée, nous avons utilisé qRT-PCR pour montrer (acide ribonucléique messager) les taux d' ARNm de NOS2, une autre caractéristique de l' inflammation de la microglie, considérablement amélioré wie traitement LPS (figure 4B). Ensuite, nous avons utilisé un dosage multiplex à base de billes, Luminex 21, pour vérifier que le LPS stimule de façon significative la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires à partir de la culture de la microglie (figure 5A). En outre, nous avons vérifié par analyse qRT-PCR que le traitement par LPS a augmenté les niveaux d'expression des gènes de plusieurs cytokines pro-inflammatoires , y compris l' IL-1β et TNF (figure 5B). Toutes ces données suggèrent ensemble que les microglies primaires isolées en utilisant cette méthode nouvellement raffiné sont fonctionnellement actifs et présentent un profil d'activation similaire microglies primaires isolées à l'aide des méthodes précédemment publiées.
microglies isolés peuvent être utilisés pour des études de signalisation
En utilisant les méthodes précédentes d'isolement de la microglie, en cours d'exécution blo Ouestt pour les études de signalisation a été difficile et infaisable en raison du faible rendement et la pureté. Auparavant, nous avons montré que Fyn, une kinase de la famille Src, est impliqué dans une cascade de signalisation pro-inflammatoires dans les cellules microgliales 9. Ici, nous PLAQUÉ un million de cellules microgliales dans une plaque de 12 puits et après 48 h, nous avons recueilli les cellules pour exécuter Western blots pour kinases native Fyn et Src phosphorylée au résidu tyrosine 416 (p-Src-Y416). Nous avons pu détecter les Fionie et les niveaux p-Src-Y416 dans nos cellules microgliales isolées (figure 6), ce qui montre que cette méthode est applicable aux techniques de Western Blot pour les études de signalisation.
La fraction négative de la séparation microgliale contient astrocytes qui peut être utilisé pour des études de signalisation
Les astrocytes sont des acteurs clés dans la neuro-inflammation, et la compréhension des mécanismes de signalisation derrière Astrinflammation ocytic Paradiaphonie et des neurones-astrocytes est important 19. Ici, nous montrons que la fraction négative de la séparation microgliale contient des cellules astrocytaires GFAP-positifs (figure 7A). En outre, notre analyse par transfert de Western pour Fyn et p-Src-Y416 (figure 7B) a montré que ces deux protéines peuvent être détectées dans la fraction négative aussi bien. Ces résultats montrent ensemble que la fraction négative est une préparation idéale pour les études astrocytes visant à identifier des protéines importantes pour les cascades de signalisation inflammatoires.
Figure 1: Schéma d'isolement des cellules microgliales de 1-2 chiots Days post-natales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandede ce chiffre.
Figure 2: microglies isolé à l' aide de sélection CD11b positif Kit II ont haute pureté. (A) L' immunocytochimie de la culture microgliale isolé de sondage pour GFAP dans le canal rouge et le canal vert dans IBA1. (B) Immunoblot de culture microgliale isolé de sondage pour GFAP (~ 51 kDa), IBA1 (~ 15 kDa) et de β-actine (~ 42 kDa). Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: La procédure d'isolement modifié n'a pas d' auto-fluorescence de billes magnétiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: LPS stimulation Augmentation de la production de nitrites dans la microglie Culture. (A) isolés les cellules microgliales traitées avec 1 pg / ml de LPS pendant 24 h et le milieu de traitement ont été recueillis pour déterminer la libération de nitrite par dosage Griess. (B) q-RT-PCR pour NOS2 de microglie isolés traités avec du LPS pendant 24 h. Les chiffres représentent la moyenne ± SE de 2 ou plusieurs expériences indépendantes. Les données ont été analysées à l'aide du test t de Student (p *0, 0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: LPS induite par cytokine pro-inflammatoire Libération de cellules microgliales. (A) Essai de multiplex Luminex a été réalisée sur un milieu de traitement ont été recueillies à partir de cellules microgliales traitées avec isolées 1 pg / ml de LPS pendant 24 h. (B) q-RT-PCR pour le TNFa IL-1βand de microglie isolés traités avec du LPS pendant 24 h. Les chiffres représentent la moyenne ± SE de 2 ou plusieurs expériences indépendantes. Les données ont été analysées à l'aide du test t de Student (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: microglies isolé peut être utilisé pour les études de signalisation. analyse par Western blot montre que Fyn et p-Src-Y416 peuvent être détectés à partir microglies isolés avec notre nouvelle méthode raffinée.
Figure 7: La Fraction négative de la séparation microglie Contient astrocytes qui peut être utilisé pour les études de signalisation. (A) Western blot montre que la fraction négative contient des cellules GFAP-positifs. (B) Analyse par transfert de Western montre que Fyn et p-Src-Y416 peuvent être détectés à partir des cellules GFAP-positifs.target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Paramètres | méthode actuelle | méthode modifiée | |
| Coût | 620 $ | 620 $ | |
| Temps | 55 min | 25 min | |
| Fluorescence | Oui (canal rouge) | Non | |
| Pureté | ~ 97% | ~ 99% | |
Tableau 1: Analyse comparative entre la méthode d'isolement et de raffinage microglial la méthode originale d'isolement.
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Discussion
Anciennes méthodes d'isolement microgliales ont des recouvrements limités qui ne sont pas appropriés pour diverses analyses de protéines par Western Blot et des analyses ARN par qRT-PCR. L'adhérence différentielle et les méthodes de trypsinisation douces sont deux approches courantes avec de faibles rendements microgliales 13, 14, 15. L'approche basée CD11b colonne de récupération est également faible, mais permet d' obtenir une plus grande pureté que l' adhésion différentielle et trypsinisation douce 13, 14, 15, 16, 17. Notre approche CD11b sans colonne d' origine a considérablement amélioré les rendements isolés, le rendant approprié pour les protéines et les analyses ARN tels que Western Blot et qRT-PCR, mais au prix d' une diminution de pureté 15.
Notre nouvelle méthode modifiée conserveles rendements de la méthode originale et augmente la pureté légèrement de ~ 95-97% à ~> 99%, mais à la moitié du temps d'achèvement, ce qui est essentiel pour la survie cellulaire. des étapes cruciales au sein du protocole peuvent assurer l'isolement optimal de la microglie. Alors que décapitant les chiots, il faut prendre soin de garder la tête sur la glace et de disséquer dans une chambre d'air laminaire dans les 5-10 min. temps d'excision du cerveau prolongée, il sera difficile d'obtenir le cerveau complet, car il commence à perdre sa solidité à température ambiante, ce qui compromet les rendements microgliales. Notamment, si l'étape 2.9 est répétée au moins une fois, il y a une augmentation observable dans la pureté et la viabilité. Si le rendement de la séparation est faible, la séparation peut être répétée en utilisant moins de flacons par ml de milieu recommandé, ou en augmentant le volume de séparation (> 1 ml). La diminution de l'entassement des cellules généralement améliorer la pureté, la viabilité et le rendement. Le temps d'incubation magnétique peut être prolongée à l'étape 2.12 pour augmenter la pureté. Ceci peutassurer une bonne fixation magnétique des microsphères qui sont attachés à des microglies. En outre, les incubations magnétiques supplémentaires peuvent être effectuées à l'étape 2.9 pour le bien d'augmenter la pureté et le rendement.
La faisabilité du protocole est équivalente ou supérieure à celle de la méthode originale CD11b; Cependant, la nouvelle méthode est raffinée et plus courte. Un autre avantage important obtenu à partir de cette méthode raffinée est la possibilité d'utiliser le canal rouge pour la microscopie de fluorescence, qui est occupée par PE dans la méthode originale (tableau 1) 15. Bien que nous obtenons un rendement élevé et la pureté de la microglie avec la méthode, le rendement obtenu astrocytes de cette séparation est moins pure, car il conserve des fibroblastes. Comme décrit à l'étape 2.17, après étalement des astrocytes et incubation pendant 6 h, le milieu de croissance doit être remplacé par du milieu frais. Les astrocytes sont les premiers à attacher au flacon, alors que la plupart des fibroblastes restent dans suspension. Le remplacement des médias généralement éliminer la majorité des fibroblastes contaminantes. Bien que cette technique assure une grande pureté de astrocytes, une méthode de purification secondaire pour obtenir des cultures plus pures est justifiée.
Dans l'ensemble, cette méthode d'isolement CD11b modifié génère des cellules microgliales primaires de haute pureté et les astrocytes dans un court laps de temps. Le temps d'isolement plus court améliore généralement les taux de survie des cellules. Il fournit un système de modèle utile pour élucider les mécanismes de signalisation sous-jacents à la fois la microglie et la biologie des astrocytes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (NIH): le nom de subventions NS088206 et ES026892. W. Eugene et Linda Lloyd président à Doué AGK et les doyens Professorat à AK sont également reconnues.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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