Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.
Abstract
Microglia sono i responder primari a insulti del sistema nervoso centrale; Tuttavia, molto resta sconosciuto circa il loro ruolo nella regolazione neuroinfiammazione. La microglia sono cellule mesodermiche che funzionano in modo simile ai macrofagi nel rilevamento stress infiammatorio. La classica (M1-type) ed alternativa (M2-type) attivazioni dei macrofagi sono stati anche esteso ad microglia nel tentativo di meglio comprendere l'interazione sottostante questi fenotipi hanno in condizioni neuroinfiammatori quali il Parkinson, morbo di Alzheimer e il morbo di Huntington. Nella sperimentazione vitro utilizzando microglia primaria offre risultati rapidi ed affidabili che possono essere estese per l'ambiente in vivo. Anche se questo è un chiaro vantaggio rispetto sperimentazione in vivo, isolando microglia mentre raggiungere adeguati rese di purezza ottimale è stata una sfida. I metodi più comuni attualmente in uso o soffrono di bassa recupero, bassa purezza, o di entrambi. Qui, abbiamo DEMstrare un perfezionamento del metodo di separazione magnetica senza colonne CD11b che realizza un recupero delle cellule elevata e una maggiore purezza in metà tempo. Proponiamo questo metodo ottimizzato come modello altamente utile di isolamento microgliali primario ai fini di studio neuroinflammation e neurodegenerazione.
Introduction
Microglia sono macrofagi residenti Myb indipendenti di origine mesodermica che differenziano da c-kit + / CD45- progenitori nelle isole sanguigni del sacco vitellino 1, 2 erythromyeloid. Una volta microglia embriologici hanno colonizzato il sistema nervoso centrale (CNS), la fase di transizione da un ameboide ad una forma ramificata 3. Questi microglia adulti sono classificati come surveillant dal loro ramificazioni dinamiche sondare il parenchima cerebrale sano per i potenziali insulti 4. Sebbene microglia contribuiscono solo a circa il 10% della popolazione cellulare CNS, la loro capacità di piastrelle tra di loro assicura scansione massima del parenchima 4, 5. Modelli pericolo associati molecolari (smorza), come α-sinucleina 6, 7 e 8 β-amiloide, o ppattern molecolari athogen-associati (PAMPs) come lipopolisaccaride (LPS) 9, attivano classicamente microglia per promuovere una risposta infiammatoria caratterizzata da reversione allo stato attivo amoeboid e la produzione di ossido nitrico, fattore di necrosi tumorale-α (TNF), interleuchina 1β (iL-1β), iL-6, iL-12, e il motivo CC chemochina ligando 2 9, 10, 11. In condizioni neuroinfiammatorie come il morbo di Parkinson, in cui patogeni α-sinucleina ha accumulato, un ciclo neurodegenerativa è creato dalla morte dei neuroni dopaminergici, che rilasciano più aggregate α-sinucleina, promuovendo un'ulteriore attivazione classica della microglia 7. Simile a macrofagi periferici, microglia può anche avere la capacità di attivare alternativamente in presenza di citochine antinfiammatorie IL-4 e IL-10, dando loro la potenteial di promuovere la riparazione neurale e attenuando l'infiammazione 2, 11. A parte i loro ruoli immunologici nel SNC, microglia sono stati descritti come regolatori vitali della circuiteria neuronale potatura sinapsi durante lo sviluppo. Ad esempio, i topi hanno Cx3cr1- KO microglia meno dense e ridotta potatura sinaptica, che porta ad una sovrabbondanza di spine dendritiche immature, sinapsi, ei modelli elettrofisiologici di un sottosviluppato CNS 12. La comprensione di queste complessità fisiologici ei diversi ruoli funzionali della microglia nell'omeostasi del sistema nervoso centrale è fondamentale per la ricerca di terapie rivolte malattie neurodegenerative.
Nel settore della neuroimmunologia, esperimenti in vitro sono altamente desiderabile a causa della maggiore fattibilità per studi meccanicistici, i minori costi di manutenzione, e per essere meno tempo e laborioso. Furthermori, la possibilità di isolare popolazioni di cellule è fondamentale per delineare la funzionalità di tali cellule bersaglio nelle condizioni prescritte. Numerosi metodi di isolamento microgliali esistono, ma sono limitati dalla loro capacità di ottenere numeri relativamente elevati e purezza per un'ampia sperimentazione 13, 14, 15. Ad esempio, un cluster di differenziazione 11b (CD11b) è un marcatore di superficie comune dei monociti, macrofagi e microglia 16. Sfruttando CD11b, un metodo di separazione magnetica è stata descritta come un approccio basato su colonne che ha dato ~ 99,5% di purezza e ~ 1,6 x 10 6 microglia per neonatale cervello 17. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un CD11b metodo di separazione magnetica senza colonne 15, che abbiamo eseguito in un tubo di polistirene mediante codifica CD11b con un anticorpo monoclonale coniugato con ficoeritrina (PE). Una Seconda bispecificoanticorpo ry a PE e complessi destrano con il PE. Una volta legato, particelle magnetiche destrano rivestite vengono introdotti, che si legano alla fine destrano del complesso anticorpo. Infine, il tubo polistirolo viene collocato in un magnete per l'isolamento della microglia. Questo approccio raddoppiato il rendimento a ~ 3,2 x 10 6 microglia al cervello neonatale, ma a costo di ridurre purezza a ~ 97%.
Qui, dimostriamo una rapida e raffinato privo di colonna CD11b magnetico protocollo di differenziazione (Figura 1). Questo metodo perfezionato rimane fattibile come nostro metodo libero-colonna originale poiché il prezzo del kit separazione magnetica CD11b è lo stesso. Il tempo di completamento è ridotta a metà, che può essere cruciale per massimizzare la sopravvivenza delle cellule e la resa. In particolare, la purezza ottenuto da questo metodo ottimizzato è ~> 99%, un netto miglioramento rispetto alla purezza raggiunto dal metodo originale senza colonne sviluppato dal nostro laboratorio 15. Ancora più importante, CD11b-PEnon è utilizzata, eliminando la necessità di incubare lontano dalla luce e permettendo l'utilizzo del canale rosso per microscopia a fluorescenza. Infine, come nel metodo originale CD11b, una frazione astrocitaria di elevata resa e purezza è ottenuto con questo procedimento perfezionato. Gli astrociti sono più numerose cellule gliali nel sistema nervoso centrale, che porta l'idea che le loro funzioni omeostatiche sono indispensabili in relazione alla fisiopatologia 18. Queste cellule gliali svolgono un ruolo in diverse funzioni fisiologiche quali formano la barriera emato-encefalica, che fornisce il supporto di nutrienti, mantenendo neurotrasmettitore omeostasi, la formazione di cicatrici gliali in risposta al danno, neuroprotezione, l'apprendimento e la memoria, e neuroinfiammazione, esemplificando il loro potenziale di indagine in gliale biologia 19. Morfologia e la funzionalità della microglia e astrociti sono state accertate tramite microscopia confocale, Western blotting, quantitativa Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR), Gtest nitriti Riess, e il test multiplex citochina Luminex. La raffinatezza fornita da questo protocollo offre una maggiore fiducia di pertinenza di purezza microglia o astrociti, più ampia applicazione della microscopia a fluorescenza con la disponibilità del canale rosso, e fa risparmiare tempo, che sono tutti importanti per la sperimentazione in vitro.
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Protocol
L'uso degli animali e delle procedure di protocollo è stato approvato e supervisionato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) alla Iowa State University (Ames, IA, Stati Uniti d'America)
1. Coltivazione di colture gliali miste
- Decapitare 1- 2 giorni di età cuccioli rapidamente con le forbici che operano 5.5 pollici, e posizionare le teste immediatamente in un tubo da 50 ml su ghiaccio. Si noti che questa decapitazione è la modalità di eutanasia.
- In una cappa flusso laminare, fare una piccola incisione nel cranio e meningi con le forbici micro-dissezione dritto 4,5 pollici. Iniziare il taglio dall'estremità caudale all'estremità rostrale (naso). Prendi sotto la pelle utilizzando l'apertura formata dalla decapitazione.
- Dopo l'incisione, sbucciare uno degli emisferi al lato. Quindi utilizzare un paio di pinzette curve o ad uncino per rimuovere l'intero cervello.
- Immergere il cervello (s) in una nuova provetta da 50 ml contenente 0,25% tripsina-ethylenediaminetetraacetate acido (EDTA) per 15 minuti in un bagno d'acqua 37 ° C. Utilizzare 2 ml di tripsina-EDTA per il cervello.
- Lavare il cervello (s) con Media fresco crescita (10% FBS, DMEM / F12, 1% di penicillina / streptomicina, 1% L-glutammina, 1% piruvato di sodio, e l'1% di acidi non essenziali amino) aggiungendo e rimuovendo il media. Ripetere questa 4x.
- Per ogni cervello, piatto due T-75 flaconi contenenti terreni di crescita. Quindi, aggiungere 2 ml di terreni di crescita per il cervello al tubo. Così, sarà un equivalente di 1 mL di cervello omogeneizzati con 8-9 ml di terreni di crescita per T-75 pallone.
- Omogeneizzare triturando cervello (s) con pipette di diverse dimensioni di apertura, in ordine dal più grande al più piccolo. Quando è visibile che il tessuto cerebrale non è sempre più piccolo, passaggio al successivo pipetta. Al termine della triturazione, la sospensione deve essere chiaro, senza blocchi visibili.
- Utilizzare una pipetta 25 mL, 5 mL pipetta, e poi a 10 mL pipetta in modo sequenziale.
- Superare ogni omogenizzazionesospensione enous cervello attraverso un colino cella 70 um a farne una singola coltura cellulare.
- Per ogni cervello omogeneizzata, piastra due T-75 beute contenenti mezzi di crescita, come descritto nel passaggio 1,5 (1 mL di cervello omogeneizzati con 8-9 ml di terreni di crescita per T-75 pallone).
- Cambiare i media crescita dopo 6 d e crescere fino a quando l'isolamento il 16 ° giorno.
2. Isolamento di cellule microgliali
- Dopo 16 giorni, rimuovere i mezzi di crescita dal pallone e metterlo in un tubo da 50 ml fresca. Aggiungere 3 ml 0,25% tripsina-EDTA per ciascun pallone T-75. Agitare i flaconi per 5 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale.
- Centrifugare i mezzi di crescita rimossi al 0,4 xg per 5 min e utilizzare per fermare la reazione tripsina-EDTA nel passaggio successivo.
- Dopo aver agitato per 5 minuti, aggiungere un minimo di 4 ml di terreni di crescita (fresco o il supporto usato da 2.1.1) per arrestare la reazione tripsina-EDTA.
- Triturare per garantire che tutta la cells sono staccati.
- Dopo triturazione, passare le cellule attraverso un colino cella 70 um a farne una singola coltura cellulare, eseguire una conta cellulare, e poi centrifugare le cellule a 0,4 xg per 5 min.
- Per ogni 100 x 10 6 cellule (circa 15 x T-75 beute), usare 1 mL di media positiva (2% FBS, DPBS (calcio e magnesio libero-cloruro), 1 mM EDTA) per risospendere il pellet cellulare.
NOTA: Tutte le seguenti operazioni sono su misura per una separazione 1 ml. - Prendere una provetta 5 polistirene, aggiungere 1 ml di supporti consigliati, e segnare il menisco. Aggiungi media consigliato fino a 2,5 mL e segnare anche questo. Eliminare la media positiva e trasferire le cellule risospese al tubo di polistirene da 5 ml.
- Aggiungere 50 microlitri di siero di ratto per ogni 1 ml di cellule sospese. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare cocktail selezione mescolando 25 microlitri del componente A e 25 ml di componente B. Questi componenti sono proprietari.
- Aggiungere 501; L del cocktail di selezione per le cellule. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: per le culture più puri, ripetere il punto 2.9 (raccomandato ma non obbligatorio). - microsfere vortex per 45 s. Aggiungere 80 ml di microsfere per 1 ml di campione. Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Portare il volume a 2,5 ml nel tubo di polistirene aggiungendo i supporti consigliati.
- Inserire il tubo nel magnete per 3 minuti a temperatura ambiente. Regolare l'incubazione per aumentare la purezza. Versare lentamente fuori i supporti consigliati in un tubo da 15 ml con il magnete ancora nel tubo di polistirene.
- Ripetere il punto 2.12 tre volte di più. incubazioni magnetici addizionali possono essere eseguite per aumentare la purezza.
- Aggiungere 3 ml di terreni di crescita e di contare il numero di cellule utilizzando un contatore di cellule.
- cellule piastra di conseguenza in Poly-D-lisina (PDL) piastre Rivestiti per trattamenti. Trattare le cellule 48 ore dopo la semina piastre inPDL rivestite. Questo permette alle cellule di recuperare dallo stress della separazione.
NOTA: Check la purezza della coltura utilizzando immunocitochimica come descritto in precedenza 15. - Piatto frazione negativo (raccolti in una provetta da 15 ml), che contiene principalmente astrociti, in T-75 palloni in mezzo di crescita.
- Dopo almeno 6 ore di incubazione a 37 ° C incubatore, cambiare il supporto e lasciarlo crescere O / N. Dividere gli astrociti il giorno successivo per i trattamenti.
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Representative Results
Microglia isolato utilizzando il kit CD11b selezione positiva II hanno elevata purezza
microglia primarie di topo sono stati isolati utilizzando il protocollo sopra indicata e piastrate su vetrini poli-D-lisina rivestite controllare la purezza di isolamento. Diecimila cellule sono state piastrate per pozzetto e analisi immunocitochimica è stata effettuata utilizzando ionizzato adattatore molecola legante il calcio 1 (Iba1) come un indicatore della microglia e proteina acida fibrillare gliale (GFAP) come marcatore degli astrociti per verificare la purezza della microglia isolato . La coltura isolata espressa solo Iba1 senza espressione GFAP (Figura 2A), suggerendo che la cultura isolato era microglia puri. A differenza di altri metodi precedentemente pubblicati per primario separazione microglia, che ha raggiunto ~ 97% di purezza, con questo metodo abbiamo ottenuto ~> 99% di purezza in metà tempo. Per convalidare ulteriormente la purezza di Th è la cultura, abbiamo fatto un Western Blot 20 per Iba1 e GFAP. Analisi immunoblot inoltre rivelato che tale isolamento dalle colture gliali miste era una coltura microglia quasi puro (Figura 2B).
La procedura di isolamento modificato non ha alcuna auto-fluorescenza da sfere magnetiche
Il canale rosso non può essere utilizzato per immunocitochimica (ICC) quando si usa il kit di isolamento precedente CD11b per la separazione microgliali come detto da Gordon et al. 15 per l'uso dell'etichettatura PE durante la separazione. Utilizzando questo nuovo kit di isolamento libera-PE, possiamo usare il canale rosso per l'analisi immunocitochimica (Figura 3). Da questo ICC, è evidente che questo nuovo metodo consente di utilizzare tutti i canali per citometria a flusso o altri studi di imaging fluorescenti.
ve_step" fo: keep-together.within-page = "1"> culture microgliali isolate rispondere funzionalmente alle LPS stimoloPer verificare che la microglia isolato sono funzionalmente attivi, abbiamo trattato le cellule con LPS, uno stimolante ampiamente usato 9 per attivare microglia, per 24 ore prima di sondaggio per vari fattori pro-infiammatori. attivazione della microglia classica è accompagnata dal rilascio di nitriti e varie citochine pro-infiammatorie nei mezzi. Quindi, abbiamo utilizzato più saggi complementari per confermare l'attività funzionale del nostro isolato microglia. In primo luogo, abbiamo utilizzato il test di Griess dimostrare che LPS drammaticamente indotta secrezione nitrito dalla microglia isolato (Figura 4A). Per convalidare ulteriormente l'attività di microglia isolato, abbiamo usato qRT-PCR per mostrare (acido ribonucleico messaggero) livelli di mRNA di NOS2, un altro segno distintivo di infiammazione della microglia, notevolmente migliorato witrattamento th LPS (Figura 4B). Quindi, abbiamo utilizzato un saggio multiplex branello-based, Luminex 21, per verificare che LPS stimolò significativamente la secrezione di citochine pro-infiammatorie dalla coltura microglia (Figura 5A). Inoltre, abbiamo verificato tramite qRT-PCR che il trattamento con LPS migliorato i livelli di espressione genica di diverse citochine pro-infiammatorie comprese IL-1β e TNF (Figura 5B). Tutti questi dati suggeriscono che insieme microglia primarie isolate utilizzando questo metodo recentemente raffinati sono funzionalmente attivi e mostrano un profilo di attivazione simile microglia primari isolati utilizzando metodi precedentemente pubblicati.
Isolati microglia possono essere utilizzati per la segnalazione studi
Utilizzando i metodi precedenti di isolamento della microglia, in esecuzione blo occidentalit per gli studi di segnalazione era difficile e impraticabile a causa della bassa resa e purezza. In precedenza, abbiamo dimostrato che Fyn, una chinasi della famiglia Src, è coinvolto in una cascata di segnalazione pro-infiammatorio in cellule microgliali 9. Qui abbiamo placcato un milione di cellule microgliali in un 12-pozzetti e dopo 48 ore, abbiamo raccolto le cellule per eseguire Western blot per nativo Fyn e Src chinasi fosforilata in tirosina residui 416 (p-Src-Y416). Siamo stati in grado di rilevare i livelli sia Fyn e p-Src-Y416 nei nostri isolate cellule microgliali (Figura 6), mostrando che questo metodo è applicabile a tecniche di Western blotting per la segnalazione studi.
La frazione negativo dalla separazione microglia contiene astrociti che può essere utilizzato per la segnalazione studi
Gli astrociti sono attori chiave nella neuroinfiammazione, e la comprensione dei meccanismi di segnalazione dietro Astrinfiammazione ocytic e neuroni-astrociti cross-talk è importante 19. Qui mostriamo che la frazione negativo dalla separazione microgliali contiene cellule astrociti GFAP-positivi (Figura 7A). Inoltre, la nostra analisi Western blot per Fyn e p-Src-Y416 (Figura 7B) ha dimostrato che entrambe queste proteine possono essere rilevati nella frazione negativo pure. Questi risultati mostrano insieme che la frazione negativo è una preparazione ideale per studi astrocitari volti a identificare proteine importanti per cascate di segnalazione infiammatorie.
Figura 1: Schema di Isolamento di cellule microgliali da Pups 1-2 giorni post-natale. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grandedi questa figura.
Figura 2: La microglia isolato utilizzando kit di selezione CD11b-positivi II dispongono di elevata purezza. (A) Immunocytochemistry di isolati cultura microglia rivelamento per GFAP nel canale rosso e Iba1 nel canale verde. (B) Immunoblot di isolati cultura microglia rivelamento per GFAP (~ 51 kDa), Iba1 (~ 15 kDa) e β-actina (~ 42 kDa). bar scala = 20 um. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la procedura di isolamento Modified non ha un'auto-fluorescenza da sfere magnetiche. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: LPS stimolazione L'aumento della produzione Nitrito in Cultura microglia. (A) Isolato microglia trattate con 1 mg / ml LPS per 24 ore e il terreno di trattamento sono stati raccolti per determinare il rilascio nitrito mediante saggio Griess. (B) q-RT-PCR per NOS2 da microglia isolato trattati con LPS per 24 h. I dati rappresentano la media ± SE da 2 o più indipendenti esperimenti. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t di Student (p *0; 0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: LPS-indotta Pro-infiammatoria di citochine dai microglia. Assay multiplex (A) Luminex è stata eseguita su terreno di trattamento raccolti da isolate cellule microgliali trattate con 1 mg / ml LPS per 24 h. (B) q-RT-PCR per IL-1βand TNFa da microglia isolato trattati con LPS per 24 h. I dati rappresentano la media ± SE da 2 o più indipendenti esperimenti. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t di Student (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). Si prega di cliccare qui per Una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Isolated microglia può essere utilizzato per la segnalazione Studies. analisi Western blot mostra che Fyn e p-Src-Y416 possono essere rilevati da microglia isolato con il nostro metodo recentemente raffinati.
Figura 7: La Frazione negativa dal Separazione microglia Contiene astrociti che può essere utilizzato per la segnalazione Studies. (A) Western blotting mostra che la frazione negativo contiene cellule GFAP-positive. (B) analisi Western blot mostra che Fyn e p-Src-Y416 possono essere rilevate dalle cellule GFAP-positive.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| parametri | metodo attuale | metodo modificato | |
| Costo | $ 620 | $ 620 | |
| Tempo | 55 min | 25 min | |
| Fluorescenza | Si (canale rosso) | No | |
| Purezza | ~ 97% | ~ 99% | |
Tabella 1: analisi comparativa tra il metodo di isolamento raffinato microglia e il metodo originale di isolamento.
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Discussion
Vecchi metodi di isolamento della microglia hanno recuperi limitate che non sono appropriati per varie proteine analisi mediante Western blot e RNA analisi da qRT-PCR. L'adesione differenziale e metodi tripsinizzazione miti sono due approcci comuni con basse rese microgliali 13, 14, 15. L'approccio CD11b basata su colonne ha anche bassa recupero, ma raggiunge una maggiore purezza del seguire differenziale e tripsinizzazione lieve 13, 14, 15, 16, 17. Il nostro approccio originale senza colonne CD11b, aumenta notevolmente le rese isolate, che lo rende adatto per le proteine e RNA analisi quali Western blotting e qRT-PCR, ma a costo di diminuita purezza 15.
Il nostro metodo appena modificato conservale rese del metodo originale e aumenta la purezza leggermente dal ~ 95-97% a ~> 99%, ma nella metà del tempo di completamento, che è fondamentale per la sopravvivenza cellulare. passi fondamentali nel protocollo possono assicurare isolamento microglia ottimale. Mentre decapitare i cuccioli, occorre prestare attenzione per evitare che le testine su ghiaccio e per sezionare in una camera di flusso d'aria laminare all'interno di 5-10 min. Prolungati tempi di escissione cervello renderà difficile ottenere la piena cervello, perché si comincia a perdere la sua solidità a temperatura ambiente, compromettendo le rese microgliali. In particolare, se il passaggio 2.9 viene ripetuta almeno una volta, v'è un aumento osservabile in purezza e vitalità. Se il rendimento di separazione è bassa, la separazione può essere ripetuto utilizzando un minor numero di flaconi per mL di supporti consigliati, o aumentando il volume di separazione (> 1 mL). Diminuendo affollamento cella generalmente migliorerà purezza, la vitalità e la resa. Il tempo di incubazione magnetico può essere esteso in passaggio 2.12 per aumentare la purezza. Questo puògarantire un'adeguata magnetico vincolante delle microsfere che sono attaccati alle microglia. Inoltre, incubazioni magnetici supplementari possono essere eseguite in fase 2.9 per motivi di aumentare purezza e resa.
La fattibilità del protocollo è equivalente o migliore rispetto al metodo originale CD11b; tuttavia, il nuovo metodo è raffinato e più breve. Un altro vantaggio significativo ottenuto da questo metodo raffinata è la possibilità di utilizzare il canale rosso per la microscopia a fluorescenza, che è occupato dal PE nel metodo originale (Tabella 1) 15. Se otteniamo alta resa e la purezza della microglia con il metodo, la resa astrociti ottenuti da questa separazione è meno puro in quanto mantiene alcuni fibroblasti. Come descritto al punto 2.17, dopo la placcatura astrociti e incubando per 6 h, i mezzi di crescita dovrebbe essere sostituito con mezzi freschi. Gli astrociti sono i primi a collegare al pallone, mentre gran parte dei fibroblasti rimangono in suspensione. La sostituzione dei mezzi di comunicazione in genere rimuoverà la maggior parte dei fibroblasti contaminanti. Sebbene questa tecnica assicura una elevata purezza di astrociti, un metodo di purificazione secondaria per ottenere colture più puri è giustificata.
In generale, questo metodo di isolamento CD11b modificato genera cellule altamente puri primarie microglia e astrociti in un breve lasso di tempo. Il tempo di isolamento corte migliorano generalmente tassi di sopravvivenza delle cellule. Esso fornisce un sistema modello utile per chiarire i meccanismi di segnalazione sottostanti sia microglia e biologia astrogliale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) Sovvenzioni: NS088206 e ES026892. L'W. Eugene e Linda Lloyd sedia dotata di AGK e Deans cattedra di AK sono anche riconosciuti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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