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Methodenartikel

Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion humaner mesenchymaler Stammzellen Homing in den Darm zur Verwendung in murinen Modellen von experimentellen entzündlichen Darmerkrankungen erhöhen

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DOI:

10.3791/55367

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1. September 2017

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1Division of Gastroenterology and Liver Disease, University Hospitals, Digestive Health Research Institute, Case Western Reserve University, 2Case Cardiovascular Research Institute, School of Medicine, Case Western Reserve University, 3Department of Medicine, Harrington Discovery Institute, Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Case Medical Center, 4Department of Radiology, University Hospitals Case Medical Center, 5Department of Biology - Skeletal Research Center, Case Western Reserve University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Modelle von Kolon Entzündung murine Studien haben gezeigt, dass ein kleiner Prozentsatz (1-5 %) von mesenchymalen Stammzellen (MSC) intravenös injiziert oder intraperitoneal beherbergt die entzündeten Darm1,2. Diese Studie zeigt, dass Ultraschall-geführte intrakardiale Injektionen von MSCs erhöhte Lokalisierung in den Darm führen.

Zusammenfassung

Morbus Crohn (CD) ist eine häufig chronisch-entzündliche Erkrankung des dünn- und Dickdarm. Murinen und menschlichen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) immunsuppressive Potential haben und haben gezeigt, dass unterdrücken Entzündung Mausmodellen der Darmentzündung, obwohl die Art der Verabreichung ihre Homing und Wirksamkeit 1 einschränken können , 3 , 4 , 5. lokale Anwendung von MSCs Kolon Verletzungen Modelle hat höhere Wirksamkeit bei Entzündungen im Dickdarm bessernde gezeigt. Allerdings gibt es Mangel an Daten über Techniken, um die Lokalisierung von menschlichen Knochenmark stammenden MSCs (hMSCs) in den Dünndarm, Entzündungsherd im SAMP-1/YitFc (SAMP) Modell der experimentellen Morbus Crohn zu verbessern. Diese Arbeit beschreibt eine neue Technik für die Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion von hMSCs bei Mäusen SAMP gut charakterisierten spontane Modellcharakter für die chronische Darmentzündung. Geschlecht und Alter-abgestimmt, Entzündungen-freie AKR/J (AKR) Mäuse dienten als Kontrollen. Um die Bioverteilung und die Lokalisierung zu analysieren, wurden hMSCs mit einen Lentivirus mit einem dreifachen Reporter ausgestrahlt. Die dreifache Reporter bestand aus Firefly Luciferase (fl), für die Biolumineszenz Bildgebung; Monomeren rot fluoreszierenden Proteins (Mrfp), für die Zelle Sortierung; und imaging-abgeschnittene Herpes-Simplex-Virus-Thymidin-Kinase (Ttk), für Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass 24 h nach der intrakardialen Verabreichung hMSCs im Dünndarm von SAMP Mäusen im Gegensatz zu Entzündungen-freie AKR Mäuse zu lokalisieren. Dieser Roman, Ultraschall-gesteuerte Injektion von hMSCs in der linken Herzkammer von SAMP Mäusen sorgt für eine hohe Erfolgsquote bei der Zelle Lieferung, so dass für die rasche Erholung von Mäusen mit minimalen Morbidität und Mortalität. Diese Technik könnte eine nützliche Methode für die verbesserte Lokalisierung von MSCs in anderen Modellen von klein-Darm-Entzündung, z. B. TNFΔRE6. Zukünftige Studien bestimmt, ob die erhöhte Lokalisierung des hMSCs durch die intra-arterielle Lieferung zu erhöhten therapeutische Wirksamkeit führen kann.

Einleitung

Morbus Crohn (CD) ist eine häufig chronisch-entzündliche Erkrankung des dünn- und Dickdarm und wird gedacht, um daraus eine unangemessene Reaktion des Immunsystems Host auf Darm Mikroben7,8. Jüngste Studien haben gezeigt, dass sowohl menschliche als auch murinen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) Entzündung Mausmodellen Darmentzündung1,3,4,5unterdrücken können. Es gibt mehrere laufende klinische Studien, mit denen menschliche MSCs abgeleitet aus Knochenmark oder Fettgewebe zur Behandlung von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), die CD9umfasst. Zwei Routen für MSC-Therapie in diesen klinischen Studien verwendet wurden: eine beinhaltet die systemische Infusion (z.B. intravenös) von MSCs luminalen IBD (inkl. CD), und der andere umfasst die lokalisierte Anwendung/Injektion von Stammzellen in die Fistel von Patienten mit perianale CD-Darm-Trakt. In einer aktuellen Meta-Analyse der MSC-Therapie für IBD, systemische (z.B. intravenös) MSC Therapie für luminalen IBD (inkl. CD) war wirksam in bis zu 40 % (95 % CI: 7-79 %) der Patienten, während die Wirksamkeit viel höher, bei 61 war % (95 % CI: 36-85 %), wenn die MSCs die erkrankten CD Fistel9wurden lokal injiziert werden. Eine jüngste Phase-III-Multicenter randomisierte Placebo-kontrollierte Studie von allogenen Fettgewebe Stammzellen direkt in die perianale Fistel CD Patienten statistisch signifikante klinische und radiologische Anzeichen von perianale Fisteln heilen injiziert, die Ergebnisse der Meta-Analyse10erhärten. Die Gründe für die geringe Wirksamkeit der MSC Therapie intravenös für luminalen CD wurde nicht ausreichend untersucht, aber möglicherweise ein Grund der unzureichenden Homing von MSCs an den Ort der Entzündung. Modelle von Kolon Entzündung murine Studien haben gezeigt, dass nur ein kleiner Prozentsatz der MSCs (1-5 %) intravenös injiziert erreichen den entzündeten Darm; die restlichen MSCs durch die Lungen (First-Pass-Effekt)1,2 gefiltert werden ,5,11,12. Mehreren murinen Studien haben daher die intraperitoneale Route (i.p.) für MSC Verwaltung in Tiermodellen der Kolitis4verwendet. Sie haben jedoch auch gezeigt, dass nur ein kleiner Bruchteil der Zellen zu erreichen und weiterhin den Doppelpunkt und, dass die Wirksamkeit auf die Sekretion von löslichen parakrine Faktoren wie Tumor-Nekrose-Faktor-induzierbaren Gen 6 Protein (TSG-6)2. Der MSC-Mechanismus der Immunsuppression und Heilung beinhaltet einen mehrgleisige Ansatz, parakrine; Zelle Nähe-unabhängige Faktoren wie TSG-6; und Zell-Nähe-abhängige Faktoren wie programmiert Tod-Liganden 1 (PD-L1); oder gezackt 1. Daher kann erhöhte Wirksamkeit9,13MSC Lokalisierung auf der Website der Entzündung führen. In der Tat zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass MSCs direkt auf dem Gelände des Kolon Verletzungen implantiert Heilung durch Sekretion Förderung der Angiogenese vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) führte. Auf der anderen Seite wurde eine minimale heilende Wirkung nach intravenöser Injektion5festgestellt. Um ihre Lokalisierung auf der Website der Entzündung (d. h. den Dünndarm in SAMP Mäuse) zu erhöhen, wurde diese Ultraschall-geführte intrakardialen Injektionstechnik für MSC-Verwaltung in die linke Herzkammer entwickelt. Bildgestützte Einspritzung sorgt für eine präzise Einspritzung, die führt zu einer höheren Erfolgsquote und sank auf Morbidität und Sterblichkeit. Darüber hinaus liefert sie die Injektion von MSCs in die linke Herzkammer an arteriellen Kreislauf, wo sie die entzündeten Dünndarm erreichen kann, bevor er gefangen in der Lunge.

In dieser Studie wurden menschliche Knochenmark stammenden MSCs (hMSCs) für die Injektion in die SAMP-1/YitFc (SAMP) Mausmodell CD14verwendet. SAMP ist ein gut charakterisierten spontane Mausmodell der chronischen Entzündung, der klein-Darm-Entzündung mit fast 100 % Penetranz14entwickelt. Die Entzündung entwickelt sich in Reaktion auf die Mikroflora in Ermangelung jeglicher chemischen, immunologischen oder genetische Manipulation und ähnelt menschlichen CD11. Geschlecht und Alter abgestimmt Entzündung-freie AKR/J (AKR) Mäuse, die Kindersicherung Mäuse von SAMP, wurden in dieser Studie verwendet.

Die hMSCs wurden isoliert und im Labor aus dem Knochenmark (BM) Proben aus normalen, nicht identifizierte Spender nach Einwilligung validiert und zuvor Protokolle15,16 veröffentlichtenerweitert. Nach der Isolierung und Expansion, die MSC-Fähigkeit in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Differenzierung wurde durch mehrere Tests15im Labor ausgewertet. Osteogene funktionelle Assays erfolgte durch Implantation von keramischen Würfel von Hydroxylapatit/Tricalcium-Phosphat-Matrix mit hMSCs subkutan in immungeschwächten CB17-Prkdc SCID Mäuse17. Der Cube-Test weist Osteogenesis und werden potenzielle und gilt als den ultimativen Test für die Bewertung der einzelnen MSC Vorbereitungen17. Um hMSCs in Vivo nach der Injektion zu visualisieren, wurde Lentivirus verwendet, um hMSCs mit dreifach Reporter Genkonstrukt transduzieren, der Firefly Luciferase (fl), Monomeren rot fluoreszierenden Proteins (mRFP) und Herpes-Simplex-Virus Thymidin-Kinase (Ttk besteht ), angetrieben durch eine modifizierte myeloproliferative Sarkom-Virus (Mnd) Projektträger18. Die Firefly Luciferase in der dreifachen Reporter ist ein Enzym, dass Coverts injizierten Luciferin zu Oxyluciferin in hMSCs und Photonen/Weißlicht erzeugt. Dies wird durch die sensible – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera (Biolumineszenz) in einem in Vivo optical imaging-System, ermöglicht die Visualisierung von live hMSCs bei Mäusen erkannt. Biolumineszenz imaging (BLI) ist eine sensible Technik, die serienmäßig für die Verfolgung von Zellen und für die ex-Vivo -Analyse verwendet werden kann. Die Verwendung eines starken Mnd-Promotors treibt den kontinuierlichen Ausdruck das Genkonstrukt triple Fusion Reporter und ermöglicht die Darstellung der injizierten hMSCs für mehr als 16 Wochen19. Die hMSCs sind schwer zu transduzieren und haben einen niedrigen Transduktion Wirkungsgrad. Mit einer optimierten Protokoll, hMSCs Transduktion Effizienz verbessert und die Expression des Transgens verbesserte18war. Mit mRFP Ausdruck (eines der drei Reporter Gene) auf Durchflusszytometrie, zeigte sich die Möglichkeit, hMSCs mit einem hohen Wirkungsgrad von bis zu 83 % transduzieren. Differenzierung-Assays und in Vivo Cube Assays zeigte die Fähigkeit von transduced hMSCs in Chondrozyten, Adipozyten und Osteozyten17zu unterscheiden.

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Protokoll

alle Mäuse Experimente und Verfahren in der Studie wurden von der Case Western Reserve University genehmigt ' s institutionelle Animal Care und Use Committee. Die Verfahren wurden im Verein zur Bewertung durchgeführt und Akkreditierung von Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Einrichtung. Der BM war unter einer Universität Krankenhäuser Institutional Review Board genehmigt Protokoll in der Stammzellen-Kern-Anlage an der Case Western Reserve University nach Einwilligung aspiriert.

1. Kultur und Transduktion menschlichen Knochenmark mesenchymale Stammzellen (hMSCs)

Hinweis: die Isolierung des hMSCs ist ausführlich in früheren Publikationen 15 , 20.

  1. Kultur isoliert hMSCs in Dulbecco ' s geändert Eagle mittlere bis niedrige Glukose (DMEM-LG) Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt. Kultur der Zellen bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2 in T175 Fläschchen mit 25 mL Wachstumsmedium. Ersetzen Sie das Medium alle 3-4 Tage. Am 14. Tag führen Sie die primäre Passage des hMSCs.
    1. Wenn die Zellen erreichen 80 % Zusammenfluss, das alte Medium vollständig zu entfernen und vorsichtig Waschen der Zellen mit 5 mL sterilem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; für 75 cm Gewebe Kulturflaschen).
    2. Der PBS aus der Flasche zu entfernen und 4 mL 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Ort der Kolben wieder in den Inkubator bei 37 ° C für 5-10 min. halten Sie die Dauer der Exposition so kurz wie möglich.
    3. Wenn der Großteil der Zellen gut abgerundeten geworden sind oder von der Kulturschale abgelöst haben, stoppen die Reaktion durch Zugabe von einem Volumen von Rindern Kälberserum gleich die Hälfte des Volumens von Trypsin.
    4. Übertragen die Zellsuspension auf eine geeignete Größe Zentrifugenröhrchen. Die Zellen bei 400 X g für 5 min Zentrifugieren und dann entfernen Sie vorsichtig den überstand.
    5. Aufschwemmen der Zellen in 5 mL Medium (DMEM-LG + 10 % FBS) und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
      Hinweis: An dieser Stelle die Zellen können subkultiviert oder mit dreifach Reporter ausgestrahlt.
  2. Führen die Signalweiterleitung hMSCs mit dreifach-Reporter.
    1. 1,5 x 10 6 Samenzellen in einem T175 Kolben. Kulturzellen Sie in 25 mL Nährmedium bei 37 ° C, 95 %, Feuchtigkeit und 5 % CO 2. Warten Sie 24 h für die Zellen befestigen.
    2. Machen einen Virus in 15 mL-Tuben, cocktail, wie in Referenz 18 beschrieben.
      1. Tauwetter Lentivirus bei 37 ° C in einem Wasser-Bad. Fügen Sie 160 µL einer 5 mg/mL-Proteamine-Sulfat-Lösung in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) bis 8 mL Kulturmedium (DMEM-LG + 10 % FBS) für eine Endkonzentration von 100 µg/mL. Wirbel für 3 S. Add vielfältige Virus Infektion (MOI) 5 (1. Mal aufgetaut) .
    3. Entfernen Sie das Medium aus der Zelle Kultur Kolben (Schritt 1.2.1) und die Zellen die Virus-Cocktail hinzufügen. 10 h bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2 inkubieren.
  3. Fügen Sie 4 mL 100 µg/mL Proteamine Sulfat in 4 mL DMEM-LG + 10 % FBS und inkubieren Sie für eine zusätzliche 14 h
  4. Stoppen die Signalweiterleitung nach 24 h durch den Austausch mit 25 mL Medium (DMEM-LG + 10 % FBS).
  5. Bestätigen Transduktion Effizienz durch die Auswertung mRFP Ausdruck von Flow Cytometry 18.
    Hinweis: Hier, hMSCs, die ausgestrahlt wurden mit über 65 % Effizienz dienten.
  6. Erweitern die Zellen durch den Austausch mit 25 mL frisches Medium (DMEM-LG + 10 % FBS) zweimal in der Woche. Kultur der Zellen bei 37 ° C, 95 %, Feuchtigkeit und 5 % CO 2. Durchgang Zellen, nachdem sie 80 % Zusammenfluss erreichen.
  7. Sobald die gewünschte Anzahl von Zellen erreicht wird, führen Sie Trypsinization pro Schritte 1.1.2 - 1.1.4.
  8. Der Zellen zu zählen und in sterilen PBS auszusetzen (1 X) in die Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen/µL 75. halten die Zellen auf dem Eis für den Transport, das Ultraschallgerät. Für Experimente, verwenden hMSCs aus Durchgang Ziffern 2-5.

2. Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion von hMSCs in die linke Herzkammer

Hinweis: Verwendung SAMP1/YitFc mit etablierten klein-Darm-Entzündung und Alter und Geschlecht abgestimmt AKR/J Mäusen für die Experimente. Pflegen Sie die SAMP und AKR Mäuse unter bestimmten Bedingungen Pathogen-freies, füttern Sie Standardlabor Chow, und halten sie über 12 h hell/dunkel-Zyklen. Hier wurden die Ultraschall-geführte kardiale Injektionen in einem dedizierten Pathogen-freies Herzultraschalluntersuchung Raum befindet sich in der Home-Tier Forschungsanlage, die mit einem Desinfektionsmittel desinfiziert und mit 70 % Alkohol gespült wurde durchgeführt. Laborpersonal Forschung tragen persönlichen Schutzausrüstung, einschließlich Kleider, Gesichtsmasken mit Auge Schilden und sterile Handschuhe während die intrakardialen Injektionen. Die Körperwärme der Maus muss für die Dauer des Verfahrens beibehalten werden.

  1. Eingerichtet, die Ultraschall-Bildgebung System vor die Maus zu betäuben. Verwenden Sie für dieses Protokoll das Ultraschallgerät für Maus Echokardiogramm konzipiert.
    1. Schalten Sie die Macht und Initialisieren der Wandler (30 MHz), um die neue Studie einzurichten.
  2. Betäuben die Maus in eine Induktion-Kammer mit 3-4 % Isofluran in 100 % Sauerstoff mit einer Rate von 0,2 - 0,5 L/min pflegen das Tier für das gesamte Verfahren mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff über eine Nase Kegel. Richtige Anesthetization vor der Durchführung der Bildgebung zu bestätigen durch Kneifen der Zehs, Rollen Sie die Maus, und ohne Bewegung zu beobachten.
    Hinweis: Ophthalmologische Salbe sollte auf die Augen nach der Induktion der Anästhesie, Hornhaut Trocknung zu verhindern angewendet werden. Die narkotisierten Mäuse zum Übertragen der bildgebenden Maschinen (z. B. Biolumineszenz Abbildungssystem und Ultraschall), wo erhalten sie eine Erhaltungsdosis von Narkosemittel Isofluran Bestimmen Sie die Narkose Startzeit und die Tiefe der Narkose durch die Beobachtung eines Mangels an Reaktion auf Prisen an der Rute und Fuß pad alle 10 Minuten für die gesamte Dauer der Narkose.
  3. Stellen Sie die Temperatur des bildgebenden Tisch und Ultraschall-Gels auf 37 ° c
  4. Vollständig zu entfernen das Fell über den Thorax-Bereich der narkotisierten Maus mit Enthaarungscreme.
  5. Platzieren Sie den Mauszeiger auf den bildgebenden Tisch in Rückenlage und sichern Sie die oberen und unteren Gliedmaßen mit Klebeband an die Bewegung des Körpers während des Verfahrens zu vermeiden. Verwenden Sie einen EKG-Monitor während des Verfahrens für alle Mäuse.
  6. Die Haut von den Thorax-Bereich mit einem 10 % Povidon/Jod Tupfer, gefolgt von einem 70 % Ethanol Tupfer reinigen. Auftragen des Gels auf den Thorax-Bereich der Maus.
  7. Die Wandler in den Halter montieren und stellen Sie seine Position, bis der linke Ventrikel gut sichtbar auf das Sichtfeld ist.
  8. Last 150 µL Zellsuspension ausgestrahlt Stammzellenreserve (2 x 10 6 hMSCs in 150 µL steriler PBS) in einer 1-mL-Spritze mit einem 28-G Nadel und Spritze an den entsprechenden Halter zu sichern. Um pulsierende Blut zu visualisieren, halten Sie eine kleine Luftsäule in die Spritze. Um Klumpenbildung zu vermeiden, die Zellen vor der Injektion auszusetzen.
  9. Fördern die Spritze in Richtung Maus Thorax, passen Sie die Nadel Flugbahn mit Hilfe der Ultraschallkontrolle, und geben Sie die linke Herzkammer.
  10. Anschluss an die Führung der Ultraschall-Bildgebung die Spritzennadel durch den Intercostalneuralgie Raum und in den linken Ventrikel der Maus durchdringen.
    Hinweis: Die Spitze der Spritze Nadel sollte in der linken Herzkammer auf die ultrasonographische Bild deutlich sichtbar sein. Richtige Platzierung sollte durch frisches arterielles Blut Abfluss in die Spritze bestätigt werden. Dies sind Anzeichen für eine erfolgreiche Eingliederung.
  11. Spritzen Stammzellenreserve Zellsuspension sehr langsam über 2 min, sanfte Pre anwendenSsure.
  12. Im Anschluss an die Injektion von suspendierten Zellen vorsichtig ziehen Sie die Nadel heraus, sauber aus dem Ultraschallgel, und lassen Sie die Maustaste von der Band fesseln.
  13. Legen Sie das Tier in einen neuen, sauberen Käfig mit einem vorgeheizten Pad.
    Hinweis: Nach Abschluss des Verfahrens, eine warme Umgebung den Mäusen bis zur Genesung vorzusehen. Überhitzung sollte vermieden werden, da periphere Vasodilatation den Aufschwung gefährdet. Die Mäuse sollten engmaschig überwacht und von anderen Mäusen bis zu ihrer vollständigen Genesung, gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen isoliert gehalten.
  14. Das Tier zu überwachen, bis sie vollständige Wiederherstellung aus der Narkose und täglich bis zum Ende des Experiments erreichen.

3. Biolumineszenz (BLI) Darstellung der hMSCs

  1. Bild die Mäuse 24 h nach der intrakardialen Injektion in die Biolumineszenz imaging-System. Starten Sie den in-Vivo imaging-Software. Initialisieren Sie das Abbildungssystem zu und öffnen Sie eine neue Studie.
    1. In der Systemsteuerung parametrisieren Bildgebung durch Klicken auf " Sequenz Setup. " im imaging-Modus wählen Sie " Lumineszenz " und " Foto. " legen Sie die Belichtungszeiten von 0,5 s bis 10 min. soll das binning " Medium " und die F / Stop, " 1. " stellen die Erregung Filter auf " Block " und der Emission Filter " offen. " soll das Sichtfeld " C " für zwei Mäuse. Bild-Assistenten das Sequenz-Setup hinzufügen, indem Sie auf den Erwerb der Systemsteuerung.
  2. Schalten Sie die Sauerstoff-Pumpe und die Isofluran auf 2,5 % in der Induktion-Kammer und die Bugnase im Inneren der Maschine.
  3. Spritzen die Maus i.p mit 300 µL D-Luciferin (12,5 mg/mL).
  4. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Anästhesie-Induktion-Kammer.
    1. Nach 2-3 min, übertragen Sie die Maus in der in-Vivo imaging-Kammer, mit seinem Kopf in die Bugnase auf dem Anästhesie-Verteiler. Wenden Sie optische Salbe zum Schutz der Augen während der Bildgebung an. Um mehrere Mäuse Bild, Schwarzlicht Schallwand verwenden, um zu verhindern, dass die Reflexion des Lichtes auf angrenzenden Mäuse.
  5. Klicken Sie auf die " erwerben " Taste, um die Bildaufnahme 10 min nach der Injektion von D-Luciferin.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.5 um mehr Mäuse Bild.
  7. Nach der Bildaufnahme in Vivo einschläfern die Mäuse durch CO 2 einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation, um Tod zu bestätigen. Durchzuführen Sie die ex-Vivo-Analyse.
    1. Wenn die ex-Vivo-Analyse nach 20 min durchgeführt wird, wiederholen Sie die Luciferin Injektion (Schritt 3.3) vor Einbußen bei den Mäusen; das BLI-Signal kann 20 Minuten nach der Injektion von Luciferin zu verringern.
  8. Sezieren die Mäuse um die gesamte Magen-Darmtrakt (d. h. aus dem Magen, Enddarm), mesenterialen Lymphknoten (MLN), Lunge, Milz und Leber entfernen. Legen Sie sie in Petrischalen mit Zange und Schere 2 , 4.
  9. Legen Sie die Petrischale mit der explantierten Organe in der bildgebenden Kammer und BLI Bilder pro Schritte 3.1-3.6.
  10. Nach der Bildaufnahme der explantierten Organe auf Probe Formen mit optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung übertragen. Cryofreeze die Formen bei-80 ° C mit Trockeneis. Führen Sie Immunohistochemistry mit Anti-Luciferase Antikörper auf Gefrierschnitte um zu bestätigen das Vorhandensein von hMSCs 16.
  11. Für die Quantifizierung der Lichtintensität, verwenden die Region von Interesse (ROI) Werkzeug in der Tool-Palette 16 , 19. Wählen Sie den ROI-Rahmen und verschieben sie dieses Interesse auf das Bild. Klicken Sie " ROI Messung " und sichern Sie die Daten in SEQ-Datei-Format. Exportieren Sie die Daten als txt-Datei und Statistik-Software verwenden, um grundlegende statistische Tests für Quantifizierung 16 durchzuführen.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt, dass hMSCs mit dem dreifachen Reporter bei einem hohen Wirkungsgrad, bewahren ihre Stammzellen Eigenschaften ausgestrahlt werden können. Ausgestrahlt hMSCs kann in Echtzeit durch BLI (Abbildung 1, Abbildung 3) visualisiert werden. Dieser Roman, Ultraschall-gesteuerte Injektion von hMSCs in den linken Ventrikel SAMP Mäuse sorgt für eine sehr hohe Erfolgsquote bei der Injektion, so d...

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Diskussion

Diese Studie beschreibt eine neue Technik für die Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion von hMSCs in einem kleinen Darm Mausmodell der experimentellen CD. Diese Technik hat sehr hohe Rate des Überlebens und Erfolg, da die Flugbahn der Nadel basierend auf Echtzeit-, hochauflösende Bilder des linken Ventrikels Maus, bereitgestellt durch den Ultraschall angepasst werden kann. Der Vorteil der Lieferung an die linke Herzkammer ist, dass hMSCs dann Intra arterially verteilt und venösen Kreislauf, wodurch die Aggregation...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Maneesh Dave wird vom US-Verteidigungsministerium Grant PR141774 und der Morbus Crohn und Colitis Foundation of America Career Development Award unterstützt. Das Labor von Fabio Cominelli stützt sich auf NIH DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) und DK07948 (F.C.) gewährt. Das Labor von Arnold Caplan wird teilweise von David L. und E. Virginia Baldwin Foundation unterstützt. Förderinstitutionen hatte keine Rolle bei der Analyse der Studie oder Schreiben des Manuskripts. Deren Inhalt sind ausschließlich in der Verantwortung der Autoren.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM-LG   Gibco31600-091
0,25 % Trypsin-EDTAGibco25-200-072
ProteaminsulfatSigma AldrichP4020-1G
D-LuciferinGoldbioluck-500
Fetal Bobine SerumGibco26140-079
Antibiotikum-AntimykotikumGibco15240-062
PBSHyCloneSH30256.01
175 cm Tissue-Cutlure-KolbenCorning431080
75 cm Tissue-Cutlure-KolbenCorning430720
ZentrifugenröhrchenCrysalgen23-2265
Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher HealthCare4585
Cryomold StandardTissue-Tek 4557
Lenti-Pac HIV-ExpressionsverpackungssystemGeneCopoeiaHPK-LvTR-20 
Povidon Ionidin TupferMedlineMDS093901
HaarentfernungscremeNairN/A
Isofluran  Piramal Helathcare NDC 66794 013 25
Pinzetten Fine Science Tools11200-33
Sezierschere (Wagner)Fine Science ToolsWagner 14068-12
Puralube TierarztsalbePuralubeNDC 17033-211-38
Aquasonic 100 Ultraschall-TransmissionsgelParker Laboratories01 08
PetrischaleFisher ScientificFB0875711A
SAMP MäuseCleveland Digestive Disease Research Core Centre
AKR-MäuseCleveland Digestive Disease Research Core Centre
Vevo 770 Bildgebungssystem  Visual Sonics, Toronto, Kanada
  System der IVIS-Spektrum-Serie PerkinElmer, Waltham, MA
Software für lebende Bilder CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA
Dreifacher ReporterMit freundlicher Genehmigung von Dr. Zheng-Hong Lee, CWRU, (Zitat 19)

Referenzen

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