Summary
En protokol til bestemmelse af relativ anti-apoptotiske aktiviteten af en anti-TNFα mAb ved hjælp af en neutralisering mekanisme med WEHI 164 celler er præsenteret her. Denne protokol er nyttig til sammenligning neutralisering styrken af forskellige molekyler med den samme biologiske funktioner.
Abstract
Denne protokol viser måling af apoptotiske aktivitet neutralisering af TNFα i en mus fibroblast celle model (WEHI 164) ved hjælp af en anti-TNFα mAb. Denne protokol kan desuden bruges til at evaluere andre anti-TNFα molekyler, såsom fusion proteiner. Den cellulære model ansat her er følsom over for TNFα-medieret apoptose, når en yderligere stressfaktor er induceret i celle kultur betingelser (fx serum afsavn). Denne fremgangsmåde er et eksempel på hvordan man kan udføre denne analytisk assay, fremhæve de centrale operationer vedrørende prøveforberedelse, celle fortynding, apoptose induktion og spektrofotometriske målinger, der er afgørende for at sikre succesfulde resultater. Denne protokol afslører de bedst ydende betingelser med hensyn til apoptose induktion og effektiv signal optagelse, fører til lav usikkerhed værdier.
Introduction
Biologiske potens er den kvantitative mål for biologisk aktivitet baseret på de analyserede produktattributter, der er knyttet til de relevante biologiske egenskaber, mængde (udtrykt i masse) er en fysisk-kemiske foranstaltning af proteinindhold. Potens tests, sammen med andre analytiske metoder, der udføres som en del af produktet conformance, stabilitet og sammenlignelige undersøgelser. I denne forstand bruges potens målinger til at vise at produktet batcher opfylder kritiske kvalitetsegenskaber (CQAs) eller kriterier for accept i alle faser af kliniske forsøg og efter markedet godkendelse.
Apoptose er programmeret celledød, naturligt forekommende når cellerne er smittet med en virus, eller når cellerne er understreget af en miljømæssig faktor at kompromiser cellulære levedygtighed og funktion1,2. Blandt andre er apoptose hæmning eller biologiske neutralisering, en af de hovedsagelig kendt terapeutisk mekanismer af mAbs, navnlig i behandlingen af kroniske sygdomme, såsom immun-medieret inflammatoriske lidelser. Anti-TNFα molekyler udøve deres terapeutiske egenskaber ved at blokere interaktion af tumor nekrose faktor alfa (TNFα) med p55 og p75 celle overfladen receptorer3, hvilket forhindrer signal veje, der til sidst føre til cellulært apoptose.
TNFα kan producere betændelse i nogle kroniske sygdomme4. TNFα udskilles spuriously i det ekstracellulære miljø af makrofager, der er vagter af den medfødte immunsystem og de vigtigste aktører i denne form for sygdom5. Som et fælles sti er TNFα deregulering knyttet til patogenesen af disse sygdomme. Uden kontrol og under konstant induktion og cell stress inducerer TNFα celle død og væv degeneration, i sidste ende fører til reumatoid arthritis, Crohns sygdom og andre patologiske profiler6.
TNF-antagonister, der blokerer for samspillet mellem TNF og dets receptorer er i stigende grad blevet brugt som en effektiv behandling at reducere symptomatologi og hindre progressionen af disse sygdomme. I dag, er anti-TNFα drug produkter almindeligt brugt til at styre den systemiske koncentration af dette cytokine, dermed forhindre yderligere degeneration af involverede væv. I denne forstand er at give en reproducerbar og robust bioassay for at beskrive et lægemiddel særlige evne til at nå sin biologiske virkning bydende nødvendigt.
I denne protokol, kritiske trin-identificeret under udviklingen af en neutralisering assay-for vellykket måling af biologiske potens er fremhævet, med særlig vægt på de færdigheder, der kræves for at udføre den bio-analysemetode. Denne bio-analytiske metode giver nyttige sammenlignelige oplysninger mellem forskellige partier eller anti-TNFα lægemidler i forhold til en klinisk testet referencestof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af medier og løsninger
- forberede næringssubstratet: RPMI-1640 med 10% FBS, pH 7,4.
- Forbered assay næringssubstratet: RPMI-1640 uden phenol rød, men med 1% FBS, pH 7,4.
- Forberede celle vaskeopløsning: DPBS Mg - og Ca-gratis løsning med 0,02% EDTA, pH 7,4.
- Forberede celle detachement løsning: 0,125% trypsin med 1 mM EDTA.
- Tø 100 mL 0,25% opløsning af trypsin-EDTA og overføres til en steril 500 mL kolbe.
- Mix med 100 mL af celle vaske løsning og dispensere 15 mL alikvoter i 15 mL sterilt rør. Opbevares ved -70 til-80 ° C indtil brug.
- Filter disse løsninger gennem et 0,22 µm membran og varm op til 37 ° C i mindst 30 min før anvendelsen.
- Forberede apoptose-induktion stamopløsning TNFα løsning på 3,3 µg/mL.
- Opløse 20 µg TNFα med 500 µL af filter-steriliseret vand i dens primære beholder og bland indtil fuldstændig opløsning.
- Transfer ind i en 15 mL sterilt rør og tilføje 5,5 mL af DPBS Mg - og Ca-gratis løsning til dette rør. Bland forsigtigt ved hjælp af en vortex-mixer.
- Alikvot løsning i 70 µL portioner. Dispensere hver delprøve i 0,5 mL microtubes og opbevares ved-80 ° C.
- Forberede apoptose induktion løsning: TNFα løsning på 40 ng/mL.
- Tø en alikvot af apoptose induktion stamopløsningen, inkubere det i et vandbad på 25 ˚C i 10 min.
- Fortyndes apoptose induktion stamopløsningen til 40 ng/mL ved at tilføje 61 µL af 3,3 µg/mL TNFα løsning til assay næringssubstratet i en 15 mL sterilt tube 4.939 mL.
- Blanding af vortex mixer til 10 s; denne løsning skal tilberedes frisk før brug.
- Varme op løsningen ved 37 ° C i mindst 30 min før anvendelsen i th eneutralization assay.
- Forberede substratopløsningen: caspase 3/7 Glo løsning 7 , 8.
- Tø caspase bufferopløsning (caspase 3/7 Glo buffer) 12 timer før brugen.
- Lad caspase stødpudeopløsning og substrat (caspase 3/7 Glo substrat) sidde separat på 25 ± 5 ° C i 30 min før mixing.
- Overføre 10 mL stødpudeopløsning caspase til substrat hætteglas og mix af inversion.
- Hold på 25 ± 5 ° C, lys-beskyttet indtil brug.
Bemærk: Løsningen er stabil i 6 timer ved stuetemperatur.
2. Celle Culturing og tælle
- celle optøning og den første subkultur.
- Fjerne et hætteglas med WEHI 164 celler 9 fra en fryser på-80 ˚C og overføre dem til en iskarret.
- Pipetteres op og ned med 1 mL af pre varmede næringssubstratet indtil de frosne celler helt tø.
- Give afkald 9 mL pre varmede næringssubstratet på en 15 mL sterilt tube.
- Overføre cellesuspension til 15 mL sterilt røret og blandes forsigtigt fem gange ved inversion.
- Centrifugeres cellesuspension ved 125 x g i 3 min. Fjern supernatanten og disaggregate celle pellet.
- Tilsættes 5 mL af næringssubstratet til røret. Bland indtil cellerne er helt genopslemmes.
- Til celle optælling, overføre 50 µL af cellesuspension til en 500 µL microtube og bland med 50 µL af 0,4% trypan blå. Tælle cellerne og justere til 0,5 x 10 6 celler/mL. Se trin 2.2 nedenfor.
- Tilføjes en 75 mL celle kultur kolbe 13 mL af pre varmede næringssubstratet.
- Give afkald nok celle suspension volumen fra trin 2.1.6 at opnå 0,5 x 10 6 celler/mL i celle kultur kolben og der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 natten.
- Celle tælle.
Bemærk: Se reference 10.- Bruger løsningen fra trin 2.1.6, overføre 0,05 mL til en hemocytometer og bestemme den celle tæthed under et mikroskop, benytter trypan blå udelukkelse.
- Opgøre det samlede antal celler og levedygtige celler.
- Justere celle suspensioner til 0,5 x 10 6 celler/mL.
Ligning 1
V næringssubstratet (mL) =
V næringssubstratet (mL) = (5 mL - V cellesuspension)
V næringssubstratet (mL) = korrigeret rumfang af WEHI 164 celle suspension
NVC = antallet af levedygtige WEHI 164 celler/mL
V næringssubstratet (mL) = Assay næringssubstratet volumen tilføjes cellesuspension at opnå 0,5 x 10 6 celler/mL
0,5 x 10 6 = mål celle tæthed
- Celle løsrivelse og den anden og tredje subkultur.
Bemærk: Et vakuum system kan bruges til at fjerne løsningerne fra kolberne. Engangs eller glas sterile pipetter kan bruges. Hvis pipetten har en bomuld træsko på toppen, skal den fjernes før brug.- Fjerne næringssubstratet fra cellekultur T-kolben ved hjælp af 1 mL steril pipette og en vakuum.
- Afpipetteres 5 mL af celle vask løsning i kultur T-kolbe, blandes forsigtigt, og kassér løsningen. Gentag dette trin to gange.
Bemærk: Den fuldstændig fjernelse af substratet er kritisk for effektiv celle detachement. - Tilsættes 15 mL celle udstationering til T-kolbe og lad det stå i 3 min. i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Kontroller fravær af tilknyttede celler i kolben indre væg under mikroskop. Fjerne celler fra kultur T-kolben ved hjælp af en 20 mL steril pipette og undvære dem i en 50 mL sterilt tube.
- Centrifugeres cellesuspension ved 125 x g i 3 min. Fjern supernatanten og resuspenderes med en anden 5 mL af næringssubstratet.
- Tæller cellerne og tilføje nok kultur medium for at nå den ønskede celle koncentration ifølge ligning 1.
- Tilføje denne suspension til en 72 cm 2 T-kolben og der inkuberes natten over ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Subkultur celler mindst to gange før du bruger dem i neutralisering assay. Gentag trin 2.3.1-2.3.8 for de næste to dage.
- Assay cellesuspension.
- Vælg en WEHI 164 subkultur, der har mindst tre passerer. Se trin 2.1.
- Detach og tælle celler efter trin 2.2 og 2.3 i denne protokol.
- Fortyndet cellesuspension ifølge ligning 1 til 0,5 x 10 6 celler/mL.
- Bruge denne cellulære suspension for neutralisering assay. Bland alle celle suspensioner af vortex mixer før brug.
3. Antistof forberedelse og fortyndinger
- kvantitering af mAbs.
- Bestemme koncentrationen af referencestof, kontrolprøve og analyseprøve gennem UV absorption på 280 nm ved hjælp af deres masseudryddelse koefficient (1.39) 11.
Bemærk: Oprindelige koncentrationer kunne tages fra narkotika produktetiketter. Men dette skal verificeres af UV absorption.
- Bestemme koncentrationen af referencestof, kontrolprøve og analyseprøve gennem UV absorption på 280 nm ved hjælp af deres masseudryddelse koefficient (1.39) 11.
- mAb fortyndinger.
- Dilute alle prøverne uafhængigt i tre eksemplarer, med DPBS Mg - og Ca-gratis løsning i 2 mL microtubes, ned til 2 mg/mL. Bekræfte denne koncentration af UV absorption i tre eksemplarer, ved hjælp af DPBS Mg - og Ca-gratis løsning som tomt.
- Mix materiel protein løsninger til 5 s ved hjælp af en vortex-mixer.
- Fortyndes 100 µL af hver 2 mg/mL mAb løsning med 0,9 mL af næringssubstratet assay.
- Mix for 5 s af vortex mixer.
Bemærk: Disse løsninger har en koncentration på 200 µg/mL. Fortyndingerne skal ske for hver tre eksemplarer. - Fortyndes 10 & #181; L for hver 200 µg/mL mAb løsning med 0,99 mL af næringssubstratet assay. Mix for 5 s ved hjælp af en vortex-mixer. Disse løsninger har en koncentration på 2 µg/mL. Udføre serielle fortyndinger for hvert tre eksemplarer før du bruger dem i neutralisering assay.
- Gøre anti-TNFα mAb fortyndinger i tre uafhængige mikroplader. Oprette en kopi af hver uafhængig tre eksemplarer og undvære dem i en mikrotiterplade, som angivet i tabel 1. Reference stof < tabel fo:keep-together.within-side = "1" fo:keep-med-next.within-side = "altid" fo:text-align = "center" >
plade 1 plade 2 plade 3 Brønde prøve Wells prøve Wells prøve B2:B11 referencestof B2:B11 kontrolprøve B2:B11 analyseprøve C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 analyseprøve D2:D11 referencestof D2:D11 kontrolprøve E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 kontrolprøve F2:F11 analyseprøve F2:F11 referencestof G2:G11 G2:G11 G2:G11 - Udføre mAb fortyndinger af hver reference prøve eller kontrol, som vist i tabel 2.
Bemærk: De anti-TNFα mAb koncentrationer er beskrevet i denne tabel er ikke de endelige koncentrationer i neutralisering assay.
T mulighed 2: Anti-TNFα mAb fortyndinger. Serielle fortyndinger af anti-TNFα mAbs er vist i denne tabel. Endelige koncentrationer er beskrevet i denne tabel er ikke koncentrationer i analysen, hvor anti-TNFα mAbs blev fortyndet med en faktor på 3 (mAb fortynding + næringssubstratet + celler suspension). Linjerne med fed skrift repræsenterer fortyndinger kommer fra linjerne 3, 5, 7, 9 og 10; ikke-fed linjer repræsenterer fortynding fra linjerne 3, 4 og 6. Disse serielle fortyndinger er gjort lige før du udfører neutralisering assay. Skal sørges for at blande af pipettering op og ned tre gange før udlevering Fortyndingerne.Plade kolonne mængden af Assay næringssubstratet (μL) volumen af referencestof, analyseprøve eller kontrol Prøven (uL) koncentration i Assay plade (ng/mL) 2 0 230 2000 3 150 150 fra linje 2 1000 4 75 75 fra linje 3 500 5 100 50 fra linje 3 333 6 75 75 fra linje 4 < td > 2507 75 75 fra linje 5 166 8 75 75 fra linje 6 125 9 75 75 fro m linje 7 83 10 75 75 fra linje 9 41 11 150 75 fra linje 10 13 - Holde pladerne på 25 ± 5 ° C indtil brug.
4. Neutralisering Assay med WEHI 164 celler
- blanding af vortexing alle celle suspensioner (0,5 x 10 6 celler/mL) før udlevering på alle trin i denne protokol.
Bemærk: I dette afsnit, varme hver løsning til 37 ° C i 30 min før brug. - Overføre 50 µL af cellesuspension til hver af de 60 wells af mikroplader, flytte fra kolonne 2 til 11 og linje B til G.
- Overføre 50 µL af mAb reference, prøve og kontrol fortyndinger i mikroplader. Følg mønster afbildet i figur 1.
- Tilsættes 50 µL af apoptose induktion løsning til hver brønd.
- Brug cellulære kontrol af 50 µL WEHI 164 celler, udleveres i tre brønde. Bringe hver brønd til en endelige mængden af 150 µL med assay næringssubstratet.
- Bruger en cytotoksicitet kontrol af en blanding af 50 µL af WEHI 164 celler plus 50 µL af apoptose induktion løsning. Bringe hver brønd til en endelige mængden af 150 µL med assay næringssubstratet.
- For TNFα kontrol bruge 50 µL af apoptose induktion løsning og bringe det til 150 µL med assay næringssubstratet.
- Til blindprøven, bruge 150 µL af assay næringssubstratet alene.
- Fylde de resterende brønde med 150 µL af næringssubstratet at undgå plade fordampning virkninger.
- Gentag trin 4.1.1-4.1.9 to gange i to andre mikroplader.
Bemærk: MAb endelige koncentrationer i mikrotiterplade er: 0,666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0,042, 0,028, 0.014 og 0.004 µg/mL. - Indlæses prøver i mikroplader, som angivet i figur 1.
figur 1: Disposition af prøver i assay plader. B1 til G11 er godt koordinater i mikroplader og beskrive de positioner, hvor prøven fortyndinger er placeret. Mangler koordinaterne wells fyldt med kontrol og analyse næringssubstratet (A1-A12 og H1-H12). Denne tilfældige fordeling af prøver (forward og reverse fortyndinger i mikroplader) hjælper med at fjerne bias i resultaterne på grund af fordampningen af medium eller andre variabler. Det er bedst at hver mikrotiterplade er udført af en analytiker ad gangen. R:, S: referenceprøve, CS: kontrolprøve, Dil: fortynding. venligst klik her for at se en større version af dette tal. - Ruger de tre plader på 37 ° C og 5% CO 2 til 16 ± 2 h.
- Lad caspase 3/7 Glo reagens stå på 25 ± 5 ° C i 30 min før brug.
- Tilsættes 100 µL af dette reagens til alle brønde, herunder prøver og kontroller.
- Ryst plader ved hjælp af en mikrotiterplade vortex mixer til 3 min på 25 ± 5 ° C umiddelbart efter udlevering i brøndene.
- Ruger plader til 2,5 ± 0,5 h på 25 ± 5 ° C, beskyttet mod lys.
- Indsætte microplates i luminometrisk og fuldføre afsnittet næste.
5. Analyse af resultater
- ved hjælp af en software til luminescence påvisning, Vælg funktionen luminescence tilstand og slutpunkt.
- Vælg en 96-godt klar-nederste plade og dens 80 interne wells, bortset fra kolonnerne 1 og 12.
- Vælg en integration af 1,250 ms og 10 s til at blande mikrotiterplade før læsning.
- Vælg brønde hvor referencestof, analytiske stof og kontrolprøve vil blive placeret og identificere sig med deres tilsvarende koncentrationer.
- Læse Prøverne anbringes i mikroplader med luminometrisk.
- Bruge en fjerde parameter ligning for analyser af resultater. Afbilde en dosis-respons kurve, som afbilledet i figur 2.
figur 2: dosis-respons kurve. Anti-TNFα mAb koncentration versus luminescens (cellernes levedygtighed) er afbildet. En fjerde parameter ligning beskriver anti-TNFα beskyttelse af mAbs blev brugt som en model. EC50 er koncentrationen af mAb, der kan neutralisere mængden af TNFα, der forårsager 50% celledød i hvert assay, eksemplificeret i grafen som ændring i hældningen. Barer beskrive standardafvigelsen af luminescence for hver mAb koncentration. x repræsenterer anti-TNFα Ab koncentration og er afbildet som en logaritmisk funktion i ng/mL, mens y repræsenterer luminescens svar i vilkårlige luminescence enheder. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Bemærk: I fjerde parameter ligningen, C er den effektiv koncentration 50 (EC50). Denne værdi bruges til at sammenligne referencestof, analyseprøve og kontrolprøve ved hjælp af funktionen effektor. - Til beregning af de relative kræfter, fix referencestof til 100% og beregne potenseringsniveau af prøven og styre følgelig.
Bemærk: Værdierne er afbildet i figur 3.
figur 3: matematiske ligning anvendes til beregning af EC50s og deres værdier. EC50-værdier, eller C parametre, har deres usikkerhed afbildet som standard fejl. En sammenligning af EC50s mellem prøve- og referencestoffer resultaterne af relative potens er også afbildet. Konfidensintervallet er beregnet med en α = 0,05. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dosis-respons Graf (med kontrol)
Figur 1 repræsenterer luminescence svar versus mAb koncentration. Denne sigmoide funktion eksemplificerer caspase 3 og 7 release assay dyrkningsmedium på grund af celle lysering. Celledød forstærkes af serum sult plus TNFα signalering induktion. Derfor, anti-TNFα molekyle (mAb) interagerer med cytokin, hæmmende (af sterisk hindring) sin interaktion med TNF celle receptoren. Dette forårsager celle overlevelse ved højere mAb koncentrationer.
De objekter, der bruges i metoden var: celler med assay kultur medium, celler plus TNFα plus assay næringssubstrat, og assay kultur mediumalone. Celler alene med assay næringssubstratet under FBS sult ikke undergår til apoptose, således udvikle luminescens. Derudover celler udsat for TNFα alene, men dyrkede med næringssubstratet faktisk overleve.
Et andet vigtigt kontrolelement er assay næringssubstratet alene. Dette styrer hjælper med forståelsen af molekylære indblanding vedrørende medium, især proteiner, der kan fordøje caspase substrat, og der således angiver en falsk-positive selvlysende signal. EC50 og relative styrke resultaterne er afbildet i tabel 3.
| Stikprøve | EC50 | Relative potens (%) | Konfidensintervallet (%) | RDS (%) |
| Referencestof | 241.5 | 100 | -- | -- |
| 243.6 | ||||
| 234.2 | ||||
| Analyseprøve | 225.2 | 99,7 | 86.0-115.1 | 8.5 |
| 240.3 | ||||
| 258.8 | ||||
| Kontrolprøve | 230.5 | 97,1 | 86,5-108,7 | 6.9 |
| 264 | ||||
| 248.4 |
Tabel 3: Relative styrke resultaterne. Den analyseprøve er i forhold til en kendt potens stikprøve, beskrevet i tabel som reference, med en fast 100% styrke. Forholdet beregnes med EC50 af hver prøve. Intervallet beregnes på et 95% konfidensinterval (α = 0,05). RSD: Relativ standardafvigelse.
Tabel 3 viser den relative styrke, i procent, mellem en reference mAb og en prøve under undersøgelsen. Sammenlignelighed antages inden for et interval af 80-120% af referencebeløbet. Dog har undertiden referencen store variation mellem partier; Derfor, rækken af accept kan ændre. Derfor er det ønsket at vælge reference partier inden for en kort periode af fremstilling, stramning af fysisk-kemiske egenskaber og accept interval.
Denne tabel viser, at henvisningen har en styrke på 100%, mens den analyseprøve har en styrke på 99,7%. Dette resultat betyder, at TNFα neutralisering kapacitet af prøven sammenlignes med henvisningen. Det forventes, at sygdomme relateret til overekspression af cytokin kan kontrolleres af disse mAbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne beskrivelse hjælper til at bestemme på forhånd den biologiske opførsel af et molekyle under udvikling før dyre og tidskrævende kliniske forsøg er gennemført. Det er også nyttigt for batch til batch release af en godkendt lægemiddel produkt. Det er værd at nævne, at disse analyser er nyttige til at bestemme hvis et molekyle har en passende biologisk virkning med hensyn til dets virkningsmekanisme. Den bio-analytiske metode præsenteres i denne tutorial er kritisk vigtige til sammenligning af forskellige anti-TNFα molekyler. Trods den fælles fysisk-kemiske metode er denne metode stand til at bestemme, gennem biologiske midler, styrken og effektiviteten af et lægemiddel som en kvalitet attribut, hvilket viser den komplette og fuld betydning af effektor funktion.
Almindeligt, kan celle apoptose lydhørhed over for TNFα være en udfordrende opgave for forskere at udføre. Fejlfinding kan gennemføres gennem karakterisering af celle-banken, der bruges dagligt før standardisere denne biologiske metode. Et eksempel er den celle respons variation inden for en periode, der vedrører cellelinie aging12. Dette problem er elimineret ved hjælp af en master celle bank frosset ved-80 ° C. Arbejde celle bank skal være stor nok til at dække kravene i en DOE undersøgelse udført af R & D eller en periode på et år til brug ved kvalitetskontrol laboratoriet. Også kan denne lydhørhed fastsættes ved hjælp af temperatur-stabiliseret løsninger før du føjer dem til celler på ethvert trin i denne protokol. Mindst tre pas skal udføres før du kører en neutralisering assay og begrænse længden af tid, at celler dyrkes i kontinuerlig kultur på grund af tilpasning og befolkningen dynamics12,13.
TNFα molekyle skal beskyttes mod fryse-tø cykler, som styrken af dette protein er væsentligt undermineres, hvis ikke stabiliseret. Formuleringer nævnt andetsteds14 for cytokin forberedelse er foreslået, når den rekonstituerede cytokin vil blive gemt, som koncentrationen af TNFα er kritisk for protokollen succes. Lydhørhed af en celle til en cytokin afhænger af antallet af receptorer pr. celle. Derfor, den optimale TNFα koncentration afhænger den celle-linje og tæthed15,-16. Vi fortyndet TNFα til en endelig koncentration på 13,3 ng/mL og justeret den celle tæthed ved hjælp af en kurve omkring 25.000 celler/brønd. Derfor, den celle tæthed skal kontrolleres for hver TNFα koncentration.
Camacho-Villegas et al. rapporter en TNFα endelige koncentration af 1,25 ng/mL; denne gruppe bruger også actinomycin D som en stress celle faktor9,17,18. Vi har i stedet ændret FBS fra 10% til 1% fra substratet til assay medium, giver en stærk stress signal at inducere apoptose i WEHI 164 celler med TNFα alene, at fjerne en anden variabel fra protokollen. Andre grupper rapport cellernes levedygtighed ved hjælp af MTT. Metoder med luminescens substrat følsomme caspase 37, i stedet for den Spektrofotometrisk metode, hvor UV-Vis absorbans stoffer er til stede i dyrkningsmediet eller selve cellerne (fx fenol rød absorberes af celler), kan interferere med signalet. Således blev følsomhed af analysen øget ved hjælp af denne Ac-DEVD-pNA luminescentreactant, som selvlysende stoffer (baggrund) i substratet ikke er forventet.
En begrænsning af denne metode er, at det kun kan anvendes til TNFα-følsomme celler; andre celler linjer skal afprøves og cytokin koncentration justeres for en optimeret cellulære reaktion. Desuden, den absolutte svar ikke kan måles, som vi ikke bruger en primær cellelinie eller en i vivo assay; i stedet foreslås ortogonale isotermisk titrering kalorimetri (ITC) eksperimenter til indledende metode justering. Oplysninger fra ITC er nyttig til oprettelse af TNFα affinitet med et nyt molekyle under udvikling og til at angive de oprindelige betingelser i den biologiske metode.
Denne metode er nyttig til at teste nye molekyler, når forskere har et referencestof for at opnå en basal relative reaktion; således anbefales vurderingen af en bio-bedre eller en molekylær svar vedrørende cellebeskyttelse. Det kan anvendes til andre anti-TNFα proteiner. For eksempel, er det relevant at vurdere den relative biologiske styrken af Etanercept, Infliximab, Certolizumab eller Golimumab19. Men alle disse anti-TNFα molekyler har forskellige tilhørsforhold til cytokin; Derfor, deres koncentrationer skal justeres individuelt. En anden fordel ved denne metode er det korte tidsrum mellem indledningen af eksperimenter og opnåelsen af resultater, hvilket gør det let at udføre, og billig sammenlignet med dyremodeller. Yderligere, denne metode måler samspillet mellem mAb med en fuldt aktiv TNFα molekyle, tyder på, at mAb er at anerkende TNFα trimer og at molekylerne ikke blev ændret under opbevaring eller laboratorium manipulation. På den anden side er en ren fysisk-kemiske assay resultatet stadig tvivlsom. For eksempel, kan interaktion mellem TNFα og en mAb ved hjælp af en konventionel ELISA være en artefakt vedrørende strukturelle ændringer som følge af cytokin kemiske immobilisering; Derfor, samfølelse kunne blive berørt og målingerne kompromitteret. Desuden under ITC analyser, kan fortynding løsninger ændre strukturen af TNFα eller mAb, dermed hæmme TNFα trimer dannelse, mAb interaktion eller kunstig epitop generation. Brugen af primærelementer linjer i denne metode kunne være krævende; ikke desto mindre kan beskyttelse mod TNFα give interessante resultater, efterligne i vivo svar.
Vi har designet denne metode til at være let at følge og reproducerbar. Som luminescence ikke kan afskærmes af phenol rød eller andre UV-Vis absorbans stoffer, kan næsten hver næringssubstratet tilsætningsstof bruges til at dyrke celler. Denne ændring aids forskere i studiet af krævende cellelinjer, med en fuld registrering svar for levedygtighed efter cytokin behandling. Mindst tre celle passager og celle tæthed justeringer skal gennemføres før den udfører neutralisering assay. Også, stabilisere cytokin og dets koncentration, samt opvarmning og equilibrating CO2 -koncentration i næringssubstratet og løsninger er kritiske trin for assay succes. Samlet set viser denne artikel de nødvendige skridt til at neutralisere TNFα cytokin med en mAb ved hjælp af en in vitro- biologiske test til at sammenligne en henvisning og en prøve under udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den nationale råd for videnskab og teknologi (CONACYT), Mexico give PEI CONACYT 2015 220333, uden deltagelse i udformningen af undersøgelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | -- |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | -- | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
