Summary
Un protocollo per la determinazione dell'attività anti-apoptotica relativa di un mAb anti-TNFα utilizzando un meccanismo di neutralizzazione con cellule WEHI 164 è presentato qui. Questo protocollo è utile per confrontare la forza di neutralizzazione di molecole diverse con la stessa funzionalità biologica.
Abstract
Questo protocollo viene visualizzata la misura della neutralizzazione attività apoptotica di TNFα in un modello di cellulare dei fibroblasti del topo (WEHI 164) utilizzando un mAb anti-TNF. Inoltre, questo protocollo può essere usato per valutare altre molecole anti-TNF, come proteine di fusione. Il modello di cellulare utilizzato qui è sensibile all'apoptosi TNFα-mediata quando un fattore di stress aggiuntivo è indotta in condizioni di coltura delle cellule (per esempio, la privazione del siero). Questa procedura esemplifica come eseguire questo test analitico, evidenziando le operazioni chiave riguardanti la preparazione del campione, diluizione delle cellule, l'induzione di apoptosi e misure spettrofotometriche che sono fondamentali per garantire risultati di successo. Questo protocollo rivela le condizioni migliori prestazioni relative all'induzione di apoptosi e segnale efficiente registrazione, portando a valori di bassa incertezza.
Introduction
Potenza biologica è la misura quantitativa dell'attività biologica basate sugli attributi prodotto dosato che sono collegati alle proprietà biologiche rilevanti, considerando che la quantità (espressa in massa) è una misura fisico-chimica del contenuto proteico. Prove di attività, insieme ad altre metodologie analitiche, vengono effettuate nell'ambito di studi di comparabilità, la stabilità e la conformità del prodotto. In questo senso, misurazioni di potenza vengono utilizzati per dimostrare che i lotti di prodotto soddisfano gli attributi di qualità critica (CQAs) o i criteri di accettazione durante tutte le fasi della sperimentazione clinica e previa approvazione del mercato.
L'apoptosi è la morte programmata delle cellule, naturalmente che si verificano quando le cellule sono infettate con un virus o quando le cellule sono sollecitate da un ambientale fattore che compromette cellulare attuabilità e la funzione1,2. Tra gli altri, l'inibizione di apoptosi, o neutralizzazione biologico, è uno dei meccanismi terapeutici principalmente noti di mAbs, particolarmente nel trattamento delle malattie croniche, quali disordini infiammatori immuno-mediata. Molecole anti-TNFα esercitano le loro proprietà terapeutiche bloccando l'interazione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα) con il p55 e p75 delle cellule recettori di superficie3, impedendo così le vie di segnale che infine conducono all'apoptosi cellulare.
TNFα può produrre infiammazione in alcune malattie croniche4. TNFα spurio è secernuto nell'ambiente extracellulare da parte dei macrofagi, che sono le sentinelle del sistema immunitario innato e degli attori principali in questo tipo di malattia5. Come un percorso comune, TNFα deregolamentazione è associata con la patogenesi di queste malattie. Senza controllo e sotto costante induzione e stress cellulare, TNFα induce degenerazione delle cellule morte e tessuto, sfociare in artrite reumatoide, malattia di Crohn e altri profili patologici6.
Antagonisti TNF che bloccano l'interazione tra TNF e dei suoi recettori sono stati sempre più utilizzati come efficace terapia per ridurre la sintomatologia e ostacolare la progressione di queste malattie. Oggi, i prodotti di droga di anti-TNF sono ampiamente utilizzati per controllare la concentrazione sistemica di questa citochina, evitando così ulteriore degenerazione dei tessuti coinvolti. In questo senso, fornendo un'analisi biologica riproducibile e affidabile per descrivere la capacità specifica di un farmaco per raggiungere l'effetto biologico è di importanza fondamentale.
In questo protocollo, critico gradini-identificati durante lo sviluppo di un'analisi di neutralizzazione-per la misura di successo di potenza biologica sono evidenziate, con una particolare enfasi sulle competenze necessarie per eseguire il metodo bio-analitici. Questo metodo bioanalitiche fornisce informazioni utili comparabilità tra lotti diversi o anti-TNF prodotti di droga rispetto ad una sostanza di riferimento clinicamente testato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione dei Media e delle soluzioni
- preparare il terreno di coltura: RPMI-1640 con 10% FBS, pH 7.4.
- Preparare analisi colturale: RPMI-1640 senza rosso fenolo ma con 1% FBS, pH 7.4.
- Preparare la soluzione di lavaggio della cella: soluzione di privo di Ca e Mg DPBS con 0,02% EDTA, pH 7.4.
- Preparare soluzione di distacco delle cellule: 0,125% tripsina con 1 mM EDTA.
- Scongelare 100 mL di una soluzione di 0,25% di tripsina-EDTA e trasferimento in una sterile bottiglia da 500 mL.
- Mix con 100 mL di cella soluzione di lavaggio e dispensare aliquote da 15 mL in provette sterili da 15 mL. Conservare a -70 a-80 ° C fino all'utilizzo.
- Filtrare queste soluzioni attraverso una membrana da 0,22 µm e caldo fino a 37 ° C per almeno 30 min prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di riserva di induzione di apoptosi soluzione TNFα 3,3 µ g/ml.
- Sciogliere 20 µ g di TNFα con 500 µ l di acqua filtro-sterilizzato nel suo contenitore primario e mescolare fino a completa dissoluzione.
- Trasferire in una provetta sterile da 15 mL e aggiungere 5,5 mL di DPBS privo di Ca e Mg soluzione per questo tubo. Mescolare delicatamente con un miscelatore vortex.
- Aliquota della soluzione in 70 porzioni µ l. Pipettare ogni aliquota in microprovette da 0,5 mL e conservare a -80 ° C.
- Preparare apoptosi induzione soluzione: soluzione TNFα a 40 ng/mL.
- Scongelare un'aliquota della soluzione madre induzione apoptosi, incubando in un bagno di acqua a 25 ˚ c per 10 min.
- Diluire la soluzione madre di induzione di apoptosi a 40 ng/mL aggiungendo 61 µ l di soluzione TNFα 3,3 µ g/mL a 4,939 mL di medium di coltura di analisi in una provetta sterile da 15 mL.
- Mix da miscelatore vortex per 10 s; questa soluzione deve essere preparata fresca prima dell'uso.
- Riscaldare la soluzione a 37 ° C per almeno 30 min prima dell'uso in analisi eneutralization th.
- Preparare la soluzione di substrato: caspase 3/7 Glo soluzione 7 , 8.
- Scongelare caspase soluzione tampone (buffer di Glo caspase 3/7) 12 h prima dell'uso.
- Lasciare che la soluzione tampone di caspase e il substrato (caspase 3/7 Glo substrato) siedono separatamente a 25 ± 5 ° C per 30 min prima della miscelazione.
- Trasferire 10 mL della soluzione tampone caspase flaconcino di substrato e mescolare capovolgendo.
- Keep a 25 ± 5 ° C, protetto da luce fino all'uso.
Nota: La soluzione è stabile per 6 ore a temperatura ambiente.
2. Culturing e conteggio delle cellule
- cella lo scongelamento e la sottocultura prima.
- Rimuovere un flaconcino con 164 WEHI cellule 9 da un congelatore a-80 ˚ c e trasferirli in un bagno di ghiaccio.
- Pipetta su e giù con 1 mL di terreno di coltura pre-riscaldato, fino a quando le cellule congelate scongelare completamente.
- Erogare 9 mL di terreno di coltura pre-riscaldato in una provetta sterile da 15ml.
- Trasferire la sospensione cellulare nella provetta sterile 15 mL e mescolare delicatamente cinque volte capovolgendo.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 125 x g per 3 min. scartare il sopranatante e disaggregare il pellet cellulare.
- Aggiungere 5 mL di terreno di coltura per il tubo. Mescolare fino a quando le cellule sono completamente risospese.
- Per conta cellulare, trasferire 50 µ l di sospensione cellulare a una 500 µ l conetti e mescolare con 50 µ l di blu di trypan 0,4%. Contare le celle e regolare a 0,5 x 10 6 cellule/mL. Vedere il punto 2.2, di sotto.
- Aggiungere 13 mL di terreno di coltura pre-riscaldato per un matraccio di cultura cellulare 75ml.
- Erogazione sufficiente volume di sospensione cellulare dal punto 2.1.6 per raggiungere 0,5 x 10 6 cellule/mL in un matraccio di cultura delle cellule e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte.
- Conta cellulare.
Nota: Vedi riferimento 10.- Utilizzando la soluzione dal punto 2.1.6, trasferire 0,05 mL in un emocitometro e determinare la densità delle cellule al microscopio usando l'esclusione del blu di trypan.
- Quantificare il numero totale di cellule e cellule vitali.
- Regolare le sospensioni delle cellule a 0,5 x 10 6 cellule/mL.
Equazione 1
V il terreno di coltura (mL) =
V il terreno di coltura (mL) = (5 mL - V sospensione cellulare)
V terreno di coltura (mL) = volume rettificato di WEHI 164 cella sospensione
NVC = numero di vitali WEHI 164 cellule/mL
V terreno di coltura (mL) = volume di terreno di coltura di dosaggio aggiunto alla sospensione di cellule di raggiungere 0,5 x 10 6 cellule/mL
0,5 x 10 6 = densità cellulare Target
- Cellulare distacco e la seconda e la terza subcoltura.
Nota: Un sistema di vuoto può essere utilizzato per rimuovere le soluzioni dai palloni. Pipette sterili monouso o vetro possono essere utilizzati. Se la pipetta ha uno zoccolo di cotone nella parte superiore, questa deve essere rimossa prima dell'uso.- Rimuovere il terreno di coltura dalla coltura delle cellule T-boccetta utilizzando una pipetta sterile da 1 mL e un vuoto. Soluzione
- dispensare 5 mL di lavaggio delle cellule nella cultura T-boccetta, mescolare delicatamente e scartare la soluzione. Ripetere questo passaggio due volte.
Nota: La rimozione completa del mezzo di coltura è critica per distacco cellulare efficiente. - Aggiungere 15 mL di soluzione di distacco delle cellule al T-pallone e lasciare riposare per 3 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Verificare l'assenza di cellule nella parete interna pallone sotto il microscopio. Rimuovere le celle dalla cultura T-boccetta utilizzando una pipetta sterile 20 mL e li pipettare in una provetta sterile da 50 mL.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 125 x g per 3 min. scartare il supernatante e risospendere il sedimento con un altro 5 mL di terreno di coltura.
- Contare le celle e aggiungere abbastanza terreno di coltura per raggiungere la concentrazione di cella desiderata secondo l'equazione 1.
- Aggiungere questa sospensione un 72 cm 2 T-boccetta e incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO 2.
- Sottocultura le cellule almeno due volte prima di utilizzarli nella neutralizzazione di dosaggio. Ripetere i passaggi 2.3.1-2.3.8 per i prossimi due giorni.
- Assay sospensione cellulare.
- Selezionare un 164 WEHI sottocultura che ha almeno tre passaggi. Vedere il passaggio 2.1.
- Detach e contare le celle secondo punti 2.2 e 2.3 del presente protocollo.
- Diluire la sospensione cellulare secondo l'equazione 1 a 0,5 x 10 6 cellule/mL.
- Utilizzare questa sospensione cellulare per l'analisi di neutralizzazione. Mescolare tutte le sospensioni di cellule da prima del miscelatore vortex utilizzare.
3. L'anticorpo e diluizioni
- quantificazione di mAbs.
- Determinare la concentrazione della sostanza di riferimento, campione di controllo e campione analitico attraverso assorbimento UV a 280 nm usando loro estinzione di massa coefficiente (1.39) 11.
Nota: Originale concentrazioni potrebbero essere prese da etichette di prodotto di droga. Tuttavia, questo deve essere verificato di assorbimento UV.
- Determinare la concentrazione della sostanza di riferimento, campione di controllo e campione analitico attraverso assorbimento UV a 280 nm usando loro estinzione di massa coefficiente (1.39) 11.
- mAb diluizioni.
- Diluire tutti i campioni in modo indipendente in triplice copia, con soluzione di DPBS privo di Ca e Mg in 2 mL microprovette, fino a 2 mg/mL. Confermare questa concentrazione di assorbimento UV in triplice copia, con DPBS privo di Ca e Mg soluzione come il vuoto.
- Mescolare le soluzioni stock proteina per 5 s usando un miscelatore vortex.
- Diluire 100 µ l di ogni soluzione di mAb 2 mg/mL con 0,9 mL di medium di coltura analisi.
- Mix per 5 s di Miscelatore vortex.
Nota: Queste soluzioni hanno una concentrazione di 200 µ g/mL. Diluizioni devono essere fatto per ogni triplicato. - Diluire 10 & n.181; L di ogni soluzione di mAb 200 µ g/mL con 0,99 mL di medium di coltura di analisi. Mix per 5 s usando un miscelatore vortex. Queste soluzioni hanno una concentrazione di 2 µ g/mL. Effettuare diluizioni seriali per ogni triplice copia prima del loro utilizzo nell'analisi della neutralizzazione.
- Rendere anti TNFα mAb diluizioni in tre piastre microtiter indipendente. Creare un duplicato da ogni triplice copia indipendente e dispensare loro in una micropiastra, come indicato nella tabella 1. Sostanza di riferimento < tavolo fo:keep-together.within-pagina = "1" fo:keep-con-next.within-pagina = "sempre" fo:text-align = "center" >
piastra 1 Plate 2 piastra 3 Pozzetti campione pozzi campione pozzi campione B2:B11 sostanza di riferimento B2:B11 campione di controllo B2:B11 campione analitico C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 campione analitico D2:D11 sostanza di riferimento D2:D11 campione di controllo E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 esempio di controllo F2:F11 campione analitico F2:F11 sostanza di riferimento G2:G11 G2:G11 G2:G11 - Eseguire diluizioni di mAb di ogni riferimento, campione o di controllo, come illustrato nella tabella 2.
Nota: Le concentrazioni di mAb anti-TNFα descritte in questa tabella non sono le concentrazioni finali con il test di neutralizzazione.
T in grado 2: diluizioni di mAb Anti-TNF. Diluizioni seriali di anticorpi monoclonali anti-TNF sono illustrati in questa tabella. Le concentrazioni finali descritte in questa tabella non sono le concentrazioni nell'analisi, dove anticorpi monoclonali anti-TNF sono stati diluiti di un fattore di 3 (mAb diluizione + terreno di coltura e sospensioni di cellule). Linee in grassetto rappresentano diluizioni provenienti da linee 3, 5, 7, 9 e 10; le linee in grassetto non rappresentano diluizione dalle linee 3, 4 e 6. Queste diluizioni seriali sono fatto appena prima dell'eseguimento del test di neutralizzazione. Cura deve essere presa per miscelare pipettando su e giù tre volte prima di dispensare le diluizioni.Piastra colonna Volume di dosaggio di coltura (μL) Volume di sostanza di riferimento, campione o controllo Campione (uL) concentrazione nella piastra di dosaggio (ng/mL) 2 0 230 2000 3 150 150 dalla linea 2 1000 4 75 75 da linea 3 500 5 100 50 da linea 3 333 6 75 75 dalla riga 4 < td > 2507 75 75 dalla linea 5 166 8 75 75 dalla linea 6 125 9 75 75 fro linea m 7 83 10 75 75 dalla linea 9 41 11 150 75 dalla riga 10 13 - Tenere le piastre a 25 ± 5 ° C fino all'utilizzo.
4. Analisi di neutralizzazione con le cellule WEHI 164
- Mix tutto cella sospensioni (0,5 x 10 6 cellule/mL) prima dell'erogazione ad ogni passo di questo protocollo nel Vortex.
Nota: In questa sezione, caldo ogni soluzione a 37 ° C per 30 min prima dell'uso. - Trasferire 50 µ l della sospensione delle cellule a ciascuno dei 60 pozzetti di micropiastre, muovendo dalla colonna 2 e 11 e linea B a G.
- Trasferire 50 µ l di riferimento mAb, campione e controllo diluizioni in piastre microtiter. Seguire lo schema rappresentato nella Figura 1.
- Aggiungere 50 µ l della soluzione di induzione di apoptosi in ciascun pozzetto. Cellule
- utilizzare i controlli cellulari di 50 µ l di WEHI 164, erogate in tre pozzi. Portare ciascun pozzetto ad un volume finale di 150 µ l con medium di analisi cultura.
- Utilizzare un controllo di citotossicità di una miscela di 50 µ l di cellule WEHI 164 oltre 50 µ l di soluzione di induzione di apoptosi. Portare ciascun pozzetto ad un volume finale di 150 µ l con medium di analisi cultura.
- Controllo per il TNFα, utilizzare 50 µ l della soluzione di induzione di apoptosi e portarlo a 150 µ l con il medium di coltura analisi.
- Per il bianco, utilizzare 150 µ l di terreno di coltura saggio da solo.
- Riempire i pozzetti rimanenti con 150 µ l di terreno di coltura per evitare effetti di evaporazione piastra.
- Ripetere i passaggi da 4.1.1-4.1.9 due volte in due altre piastre microtiter.
Nota: Le concentrazioni finali di mAb nella micropiastra sono: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0,056, 0,042, 0.028, 0,014 e 0,004 µ g/mL. - Caricare i campioni in micropiastre, come indicato nella Figura 1.
Figura 1: disposizione dei campioni nelle piastre di dosaggio. B1 per G11 sono bene coordinate in micropiastre e descrivere le posizioni in cui si trovano le diluizioni del campione. Coordinate mancante sono pozzi riempiti con controlli e analisi terreno di coltura (A1-A12 e H1-H12). Questa distribuzione casuale dei campioni (forward e reverse diluizioni in micropiastra) aiuta ad per eliminare i pregiudizi nei risultati dovuto all'evaporazione del medium o altre variabili. È meglio che ogni micropiastra è fatto da un analista alla volta. R: riferimento, s: campione, CS: esempio di controllo, Dil: diluizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. - Incubare le tre piastre a 37 ° C e 5% di CO 2 per 16 ± 2 h.
- Lasciare che il reagente di Glo caspase 3/7 stand a 25 ± 5 ° C per 30 min prima dell'uso.
- Aggiungere 100 µ l del reagente in tutti i pozzetti, tra cui i controlli e campioni.
- Scuotere le piastre con un miscelatore vortex micropiastra per 3 min a 25 ± 5 ° C immediatamente dopo l'erogazione nei pozzetti.
- Incubare le piastre per 2,5 ± 0,5 h a 25 ± 5 ° C, al riparo dalla luce.
- Inserire il microfonoroplates nel luminometro e completare la successiva sezione.
5. Analisi dei risultati
- utilizzando un software per rilevamento di luminescenza, selezionare la funzione di modalità ed endpoint luminescenza.
- Selezionare un 96 pozzetti clear-fondo piatto e suoi 80 pozzi interni, escluse le colonne 1 e 12.
- Selezionare un tempo d'integrazione di 1.250 ms e 10 s per la miscelazione la micropiastra prima della lettura.
- Selezionare i pozzi dove sostanza di riferimento, sostanza analitica e campione di controllo verrà inseriti e identificare con loro concentrazioni corrispondenti.
- Leggere i campioni inseriti in micropiastra con il luminometro.
- Utilizzare una quarta equazione di parametro per l'analisi dei risultati. Grafico di una curva dose-risposta, come raffigurato in Figura 2.
Figura 2: curva Dose-risposta. Concentrazione di mAb anti-TNFα contro luminescenza (attuabilità delle cellule) è raffigurato. Un quarto equazione di parametro che descrive la protezione anti-TNF di Marazzi è stato utilizzato come un modello. EC50 è la concentrazione di mAb che possono neutralizzare la quantità di TNFα che causano la morte delle cellule di 50% in ogni dosaggio, esemplificato nel grafico come la variazione di pendenza. Bar descrivono la deviazione standard di luminescenza per ogni concentrazione di mAb. x rappresenta la concentrazione di Ab anti-TNF e viene raffigurato come una funzione logaritmica in ng/mL, mentre y rappresenta la risposta di luminescenza in unità arbitrarie luminescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nota: Nell'equazione del quarto parametro, C è la concentrazione efficace 50 (EC50). Questo valore verrà utilizzato per confrontare la sostanza di riferimento, campione e campione di controllo mediante la funzione effettrice. - Per calcolare le potenze relative, difficoltà la sostanza di riferimento al 100% e calcolare le potenze del campione e controllo conseguenza.
Nota: Questi valori sono rappresentati in Figura 3.
Figura 3: equazione matematica utilizzata per calcolare i EC50s e i loro valori. Valori di EC50, o parametri di tipo C, hanno loro incertezza raffigurato come errore standard. È raffigurato anche un confronto di EC50s tra i risultati di campione ed il riferimento di potenza relativa. L'intervallo di confidenza è calcolato con un α = 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grafico di dose-risposta (con controlli)
Figura 1 rappresenta la risposta di luminescenza contro concentrazione di mAb. Questa funzione sigmoidale esemplifica la caspasi 3 e 7 rilascio nel terreno di coltura di dosaggio a causa di lisi delle cellule. Morte delle cellule è esaltata dalla deprivazione di siero plus TNFα induzione di segnalazione. Di conseguenza, la molecola anti-TNF (mAb) interagisce con la citochina, inibizione della sua interazione con il recettore TNF (mediante sterico). In questo modo la sopravvivenza delle cellule alle più alte concentrazioni di mAb.
I controlli utilizzati nel metodo erano: cellule con analisi di cultura media, cellule più terreno di coltura TNFα più saggio e cultura mediumalone di analisi. Solo con terreno di coltura di dosaggio sotto inedia FBS cellule non subissero all'apoptosi, sviluppando così la luminescenza. Inoltre, le cellule esposte a TNFα da solo, ma coltivata con terreno di coltura sono infatti sopravvissuto.
Un altro controllo importante è il terreno di coltura di saggio da solo. Questo controlla aiuta con la comprensione dell'interferenza molecolare relative al mezzo, in particolare le proteine che possono digerire il substrato di caspase, indicando così un segnale luminescente di falsi positivi. L'EC50 e potenza relativa risultati sono rappresentati nella tabella 3.
| Campione | EC50 | Potenza relativa (%) | Intervallo di confidenza (%) | RDS (%) |
| Sostanza di riferimento | 241,5 | 100 | -- | -- |
| 243,6 | ||||
| 234.2 | ||||
| Campione da analizzare | 225,2 | 99.7 | 86,0-115.1 | 8.5 |
| 240.3 | ||||
| 258,8 | ||||
| Esempio di controllo | 230,5 | 97.1 | 86,5-108,7 | 6.9 |
| 264 | ||||
| 248,4 |
Tabella 3: risultati di potenza relativa. Il campione da analizzare viene confrontato con un campione di potenza noti, descritto nella tabella come riferimento, con una potenza di 100% fisso. Il rapporto è calcolato con la CE50 di ciascun campione. L'intervallo viene calcolato a una confidenza del 95% (α = 0,05). RSD: deviazione standard relativa.
La tabella 3 Mostra la potenza relativa, in percentuale, tra un mAb di riferimento e un campione in esame. Comparabilità è assunto all'interno di una gamma di 80-120% del riferimento. Tuttavia, a volte il riferimento ha grande variabilità tra lotti; di conseguenza, può modificare l'intervallo di accettazione. Quindi, si desidera selezionare i lotti di riferimento entro un breve periodo di produzione, l'intervallo di accettazione e proprietà fisico-chimica di serraggio.
Questa tabella dimostra che il riferimento ha una potenza di 100%, mentre il campione analitico ha una potenza pari al 99,7%. Questo risultato significa che la capacità di neutralizzazione di TNFα dal campione è paragonabile a quello di riferimento. Si prevede che le malattie correlate alla sovraespressione della citochina possono essere controllate da questi anticorpi monoclonali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questa caratterizzazione consente di determinare a priori il comportamento biologico di una molecola in fase di sviluppo prima di costosi e laboriosi studi clinici sono condotti. È anche utile per il rilascio lotto di un prodotto di farmaco approvato. Vale la pena ricordare che queste analisi sono utili per determinare se una molecola ha un effetto biologico adeguato per quanto riguarda il suo meccanismo d'azione. Il metodo bio-analitici presentato in questa esercitazione è estremamente importante per il confronto di molecole differenti anti-TNF. Nonostante il metodo fisico-chimico comune, questa metodologia è in grado di determinare, attraverso mezzi biologici, la potenza e l'efficacia di un farmaco come un attributo di qualità, dimostrando così il significato completo e completo delle funzioni effettrici.
Comunemente, la reattività di apoptosi delle cellule di TNFα può essere un compito impegnativo per i ricercatori eseguire. Risoluzione dei problemi può essere condotta attraverso la caratterizzazione della Banca delle cellule che viene utilizzata su una base quotidiana prima di standardizzare questo metodo biologico. Un esempio è la variabilità di risposta cellulare all'interno di un periodo di tempo relativi alla linea cellulare invecchiamento12. Questo problema è eliminato tramite una banca di cellule congelata a-80 ° C. La banca di cellule di lavoro deve essere abbastanza grande per coprire le esigenze di uno studio DOE effettuato da R & D o un periodo di un anno per l'uso in laboratorio controllo qualità. Inoltre, questa risposta può essere risolto utilizzando soluzioni temperatura stabilizzata prima di aggiungerli alle cellule a qualsiasi passo durante questo protocollo. Almeno tre passaggi devono essere eseguiti prima in esecuzione di un test di neutralizzazione e limitando la lunghezza di tempo in cui le cellule sono coltivate nella cultura continua a causa di adattamento e popolazione dinamica12,13.
Molecola TNFα dovrà essere protetti da cicli di gelo-disgelo, come la potenza di questa proteina è sostanzialmente compromessa se non stabilizzata. Formulazioni citato altrove14 per la preparazione di citochina sono suggerito quando la citochina ricostituita sarà conservata, come la concentrazione di TNFα è critica per il successo di protocollo. La reattività di una cella di una citochina dipende dal numero di recettori per la cellula. Di conseguenza, la concentrazione ottimale di TNFα dipende la cella linea e densità15,16. Abbiamo diluito TNFα ad una concentrazione finale di 13,3 ng/mL e regolata la densità delle cellule usando una curva intorno 25.000 cellule per pozzetto. Di conseguenza, la densità delle cellule deve essere verificata per ogni concentrazione di TNFα.
Camacho-Villegas et al. segnala una concentrazione finale di TNFα di 1,25 ng/mL; Questo gruppo utilizza anche l'actinomicina D come un stress cellulare fattore9,17,18. Invece abbiamo cambiato i FB dal 10% al 1% dal terreno di coltura al medium di analisi, dando un segnale di forte stress per indurre apoptosi in cellule WEHI 164 con TNFα da sola, eliminando un'altra variabile dal protocollo. Altri gruppi relazione di attuabilità delle cellule usando MTT. Metodologie usando un substrato di luminescenza sensibile a caspase 37, anziché il metodo spettrofotometrico dove sono presenti nel terreno di coltura o le cellule stesse (ad esempio, rosso fenolo assorbito le sostanze di assorbanza UV-Vis dalle cellule), possono interferire con il segnale. Quindi, la sensibilità del dosaggio è stata aumentata utilizzando questo luminescentreactant CA-DEVD-pNA, come la presenza di sostanze luminescenti (sfondo) nel terreno di coltura non è previsto.
Una limitazione di questo metodo è che può essere applicato solo alle celle di TNFα sensibili; altre linee di cellule devono essere testati e la concentrazione di citochina regolata per una risposta cellulare ottimizzato. Inoltre, la risposta assoluta non può essere misurata, come non stiamo usando una linea di cellulari primarie o un test in vivo ; invece, gli esperimenti ortogonale isotermica di titolazione calorimetria (ITC) sono suggeriti per la regolazione del metodo iniziale. Informazioni da ITC sono utile per stabilire l'affinità TNFα con una nuova molecola in fase di sviluppo e per specificare le condizioni iniziali nel metodo biologico.
Questo metodo è utile per testare nuove molecole quando i ricercatori hanno una sostanza di riferimento per l'ottenimento di una risposta relativa basale; Pertanto, si raccomanda la valutazione di un bio-meglio o una risposta molecolare relative alla protezione delle cellule. Può essere applicato ad altre proteine anti-TNF. Per esempio, è applicabile per valutare la relativa potenza biologica di Etanercept, Infliximab, Certolizumab o Golimumab19. Tuttavia, tutte queste molecole anti-TNF hanno diverse affinità per la citochina; di conseguenza, le loro concentrazioni devono essere regolate individualmente. Un altro vantaggio di questo metodo è nel breve periodo tra l'inizio degli esperimenti e il raggiungimento dei risultati, che lo rende facile da eseguire e poco costoso rispetto ai modelli animali. Ulteriormente, questo metodo misura interazione del mAb con una molecola TNFα pienamente attiva, suggerendo che il mAb sta riconoscendo il trimero TNFα e che le molecole non sono stati modificati durante la manipolazione di deposito o laboratorio. D'altra parte, un risultato di analisi fisico-chimico puro è ancora dubbio. Ad esempio, interazione tra TNFα e un mAb usando una ELISA convenzionale può essere un artefatto relative ai mutamenti strutturali dovuto immobilizzazione chimica di citochina; Pertanto, l'affinità potrebbe risentirne e le misurazioni compromessa. Inoltre, durante l'analisi ITC, soluzioni di diluizione possono modificare la struttura del TNFα o il mAb, inibendo così la formazione di TNFα trimero, mAb interazione o epitopo artifactual generation. L'uso di linee di cellule primarie in questo metodo potrebbe essere esigenti; Tuttavia, protezione contro il TNFα può dare risultati interessanti, che imita in vivo le risposte.
Abbiamo progettato questo metodo facile da seguire e riproducibile. Come luminescenza non può essere mascherato da rosso fenolo o altre sostanze di assorbanza UV-Vis, quasi ogni additivo del terreno di coltura può essere utilizzato per la coltivazione di cellule. Questa modifica aiuta i ricercatori nello studio dei più esigenti di linee cellulari, con una risposta di rilevamento completo per redditività dopo trattamento di citochina. Almeno tre passaggi di cella e cella densità regolazioni devono essere effettuate prima di eseguire il test di neutralizzazione. Inoltre, stabilizza la citochina e la sua concentrazione, nonché riscaldamento ed equilibrare la concentrazione di CO2 in il terreno di coltura e le soluzioni sono passaggi critici per il successo di dosaggio. Nel complesso, in questo articolo vengono illustrati i passaggi necessari per neutralizzare la citochina TNFα con un mAb utilizzando un test biologico in vitro per confrontare un riferimento e un campione in fase di sviluppo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio nazionale di scienza e tecnologia (CONACYT), Messico concedere PEI CONACYT 2015 220333, senza partecipazione nella progettazione dello studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | -- |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | -- | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
